陳道虎 劉 輝 何書(shū)武 黃茂芹 葛廣全

特發(fā)性房顫(idiopathic atrial fibrillation，IAF)約占房顫(atrial fibrillation，AF)患病率的10%～20%，通常不存在高血壓、糖尿病等AF患者常見(jiàn)危險(xiǎn)因素。但近年來(lái)有研究[1]顯示，IAF的發(fā)生受遺傳、飲酒、肥胖等多個(gè)因素影響。KCNA5基因編碼Kv1.5通道α亞基因，王汝朋等[2]學(xué)者的研究顯示，AF患者較健康者KCNA5基因表達(dá)下調(diào)8.13倍。超速激活延遲整流鉀電流(ultrarapid delayed rectifier K+current，Ikur)在心房動(dòng)作電位的復(fù)極化中起重要作用[3]，有一項(xiàng)分析IAF患者的研究[4]發(fā)現(xiàn)，編碼Kv1.5攜帶Ikur通道的KCNA5基因的6個(gè)突變，分別導(dǎo)致功能獲得和功能喪失。因此，KCNA5基因突變改變Ikur，影響心房肌細(xì)胞動(dòng)作電位時(shí)程，可能是IAF發(fā)生機(jī)制之一。故本文旨在探究KCNA5基因單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)與IAF的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年1月至2018年12月海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院收治的204例IAF患者(IAF組)。納入標(biāo)準(zhǔn)：心電圖或動(dòng)態(tài)心電圖檢查發(fā)生AF者；未合并冠心病、先天性心臟病、瓣膜病、心肌病等器質(zhì)性心臟病者；年齡>18歲者；均為漢族；患者知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并高血壓、甲狀腺功能亢進(jìn)等常見(jiàn)AF危險(xiǎn)因素者。以性別、年齡作為匹配因子收集同期在本院體檢的200例體檢健康者作為對(duì)照組。本研究已經(jīng)我院倫理委員會(huì)審核通過(guò)。IAF組：男性117例、女性87例，年齡32～62歲、平均(45.37±7.01)歲。對(duì)照組：男性114例、女性86例，年齡30～62歲、平均(45.34±7.59)歲。兩組研究對(duì)象性別、年齡對(duì)比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 研究方法 所有研究對(duì)象(IAF組和對(duì)照組)均采集外周靜脈血5 mL，置于EDTA抗凝管中，-80℃保存待測(cè)。多態(tài)性基因位點(diǎn)選擇：根據(jù)HapMap人類(lèi)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)選擇KCNA5基因兩個(gè)SNP(rs3741930、rs1056468)?；蚪MDNA提?。菏褂醚夯蚪MDNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司提供)提取來(lái)自全血細(xì)胞的基因組DNA，嚴(yán)格依照試劑盒說(shuō)明操作；經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定各樣品的DNA濃度和純度，DNA樣本-20℃儲(chǔ)存。引物設(shè)計(jì)：根據(jù)KCNA5基因的標(biāo)準(zhǔn)DNA序列，輔助應(yīng)用Primer5.0進(jìn)行目的基因片段引物設(shè)計(jì)。PCR擴(kuò)增：由上海賽百盛基因技術(shù)有限公司進(jìn)行引物合成。PCR反應(yīng)總體系：基因組DNA模板10 μL，上下游引物各1 μL，2×Taq PCR mastermix(北京博凌科為生物科技有限公司提供)25 μL，去離子水補(bǔ)足體系至50 μL，使用9700型PCR儀(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司生產(chǎn))進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列及擴(kuò)增條件見(jiàn)表1。基因分型：瓊脂糖凝膠電泳后，經(jīng)凝膠成像儀觀察是否擴(kuò)增出目的條帶，發(fā)現(xiàn)目的條帶后采用AxyPreP DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化，使用3500基因測(cè)序儀(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司生產(chǎn))對(duì)所得產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。

表1 待擴(kuò)增片段的引物設(shè)計(jì)和擴(kuò)增條件

1.3 觀察指標(biāo) 采用基因測(cè)序法檢測(cè)兩組研究對(duì)象KCNA5 SNP(rs3741930、rs1056468)的分布，基于不同基因型(rs3741930、rs1056468)將IAF患者分為CC基因型和CT+TT基因型兩組，比較IAF患者不同基因型相關(guān)臨床指標(biāo)[年齡、體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)、舒張壓、收縮壓、心率、左心房?jī)?nèi)徑、左室射血分?jǐn)?shù)]的差異。

2 結(jié)果

2.1 兩組研究對(duì)象哈德溫伯格平衡檢驗(yàn)結(jié)果比較 rs3741930、rs1056468各基因型在IAF組和對(duì)照組中均存在。KCNA5基因rs3741930位點(diǎn)CC、CT、TT在IAF組、對(duì)照組中實(shí)際分布與預(yù)期分布對(duì)比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；KCNA5基因rs1056468位點(diǎn)AA、AT、TT在IAF組、對(duì)照組中實(shí)際分布與預(yù)期分布對(duì)比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

2.2 兩組研究對(duì)象不同組基因分型對(duì)比 IAF組rs3741930位點(diǎn)CC基因型和等位基因C分布頻率高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，兩組CT、TT基因型頻率對(duì)比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；IAF組rs1056468位點(diǎn)AA、AT、TT和等位基因A分布頻率與對(duì)照組對(duì)比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表3。

2.3 IAF患者不同基因型相關(guān)臨床指標(biāo)比較 IAF患者rs3741930位點(diǎn)CC與CT+TT基因型年齡、舒張壓、收縮壓、心率、左心房?jī)?nèi)徑、射血分?jǐn)?shù)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，CC基因型BMI高于CT+TT基因型(P<0.05)；IAF患者rs1056468位點(diǎn)AA與AT+TT基因型年齡、舒張壓、收縮壓、心率、左心房?jī)?nèi)徑、射血分?jǐn)?shù)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，AA基因型BMI低于AT+TT基因型(P<0.05)。見(jiàn)表4、5。

表2 兩組研究對(duì)象哈德溫伯格平衡檢驗(yàn)比較

表3 IAF組和對(duì)照組基因型及等位基因頻率對(duì)比[例(%)]

表5 IAF患者rs1056468位點(diǎn)基因型相關(guān)臨床指標(biāo)對(duì)比

3 討論

心臟Kv1.5鉀通道由KCNA5基因編碼，由Kv1.5通道介導(dǎo)的Ikur構(gòu)成心房動(dòng)作電位的關(guān)鍵組成部分，KCNA5基因中的功能性突變導(dǎo)致AF[5]。SNP是指在基因組水平上，由單個(gè)核苷酸變異引起的DNA序列多態(tài)性，這種突變包括錯(cuò)意突變和同義突變[6]。苗海軍等[7]研究顯示，KCNA1(rs1805127)是維吾爾族AF的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，而KCNE4(rs12621643)是維吾爾族和漢族AF患者的共同危險(xiǎn)因素。KCNA5基因與KCNA1、KCNA6毗鄰，但目前關(guān)于該基因SNP與AF關(guān)系的研究仍較少。Ni等[8]學(xué)者使用模擬心房肌細(xì)胞機(jī)電動(dòng)力學(xué)的人體心房細(xì)胞的機(jī)電模型來(lái)模擬KCNA5突變對(duì)心房電子力學(xué)的影響，結(jié)果顯示功能獲得性KCNA5突變導(dǎo)致心房收縮性的嚴(yán)重?fù)p害。上述研究表明，KCNA5基因突變?cè)贏F發(fā)病機(jī)制中的重要作用，也顯示出分析KCNA5 SNP與IAF關(guān)系的重要性。

本研究數(shù)據(jù)顯示，KCNA5基因rs3741930、rs1056468各基因型在IAF和健康人群中均存在，分布頻率符合哈德溫伯格定律。本研究結(jié)果顯示，在不同位點(diǎn)各基因型對(duì)比中，IAF患者rs3741930位點(diǎn)CC基因型和等位基因C分布頻率分別為17.65%和42.40%，較健康人群明顯升高。這說(shuō)明rs3741930位點(diǎn)可能與IAF發(fā)病存在一定聯(lián)系，攜帶C等位基因或是IAF人群的易感因素之一。而rs1056468位點(diǎn)各基因型IAF患者與對(duì)照組對(duì)比，分布頻率均相近，差異未達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。rs1056468位于KCNA5基因5’-UTR區(qū)域，參與構(gòu)成一段剪接增強(qiáng)子序列。其SNP C>T可能通過(guò)影響KCNA5基因表達(dá)，進(jìn)而損害KCNA5基因編碼的Kv1.5通道結(jié)構(gòu)和功能，影響心房肌細(xì)胞機(jī)電動(dòng)力學(xué)，使該人群成為IAF的易感人群。

本研究比較rs3741930、rs1056468位點(diǎn)不同基因型與IAF相關(guān)臨床指標(biāo)，結(jié)果顯示各臨床指標(biāo)中僅BMI一項(xiàng)出現(xiàn)顯著差異。具有rs3741930、rs1056468位點(diǎn)基因變異IAF患者與未發(fā)生變異的IAF患者，這說(shuō)明KCNA5基因 SNP還可能與BMI存在聯(lián)系。Ball等[9]學(xué)者的一項(xiàng)大樣本量分析顯示，過(guò)高的BMI會(huì)增加AF風(fēng)險(xiǎn)，40 kg/m2人群較23 kg/m2人群患病風(fēng)險(xiǎn)增加4.42倍，且在男性和女性呈現(xiàn)相同趨勢(shì)。Huang等[10]則指出，BMI與人群左心房直徑、左心房面積和左心房體積均獨(dú)立相關(guān)，其中左心房直徑是整體人群中AF發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。另有一項(xiàng)研究[11]發(fā)現(xiàn)，AF患者經(jīng)射頻消融術(shù)治療后，BMI超標(biāo)是其早期復(fù)發(fā)的獨(dú)立影響因素之一。因此，BMI在AF發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后等方面均產(chǎn)生重要影響，KCNA5基因SNP與BMI的相關(guān)機(jī)制仍不明確，或可成為今后IAF發(fā)病機(jī)制的研究入手點(diǎn)之一。

綜上所述，KCNA5基因SNP rs3741930位點(diǎn)與IAF發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，攜帶C等位基因的人群是IAF的危險(xiǎn)人群，且rs3741930、rs1056468位點(diǎn)均與IAF患者BMI相關(guān)。