閆曉芳，謝 虹，湯 華

（天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系，天津市生命科學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室，天津市炎癥生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300070）

宮頸癌是最常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤之一，在全世界可以導(dǎo)致死亡的癌癥中排名第四位[1]。研究表明，每年有超過(guò)50 萬(wàn)名女性被診斷患有宮頸癌，每年因患有宮頸癌而死亡的人數(shù)超過(guò)30 萬(wàn)[2]。所以研究用于宮頸癌早期診斷或預(yù)后的新型生物標(biāo)志物對(duì)于女性健康是必須的。miRNA 是短鏈單鏈非編碼RNA，參與各種生理和病理過(guò)程[3]。大量研究表明miRNA 在包括癌癥在內(nèi)的多種疾病中發(fā)揮著不同的作用[4-5]，它們可能以一種致癌基因的身份去參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖能力、凋亡速率、侵襲性及轉(zhuǎn)移[6]。例如，miR-148a 作為腫瘤抑制基因通過(guò)直接靶定Wnt1 mRNA 的3′UTR 抑制肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲[7]，miR-221-3p 可以通過(guò)靶向THBS2 來(lái)治療癌癥[8]，本實(shí)驗(yàn)室報(bào)道了一種新的miRNA（miR-G-1）通過(guò)靶向TMED5 促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的惡性行為和核自噬[9]。但是，目前miR-3685 對(duì)宮頸癌細(xì)胞的功能研究知之甚少，作用機(jī)制也尚不清楚。CTTN 基因位于人染色體11q13，有研究證明其能夠促進(jìn)食管癌細(xì)胞系的運(yùn)動(dòng)、侵襲以及抗失巢凋亡能力[10]。比起正常組織，在26%的乳腺癌組織中可以觀察到CTTN 含量增多，并且CTTN 的過(guò)表達(dá)可以促進(jìn)多種癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性和侵襲性[11-12]，但是CTTN 對(duì)宮頸癌細(xì)胞的功能作用尚不清楚。所以，本文旨在探討miR-3685 和CTTN 對(duì)宮頸癌細(xì)胞惡性行為的影響，從而為宮頸癌提供新的治療思路。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果首次證明了miR-3685通過(guò)抑制宮頸癌細(xì)胞遷移、侵襲和生長(zhǎng)來(lái)抑制其惡性行為，本研究強(qiáng)調(diào)了miR-3685-CTTN 軸在宮頸癌發(fā)病機(jī)制中的重要性，該調(diào)控軸可以為預(yù)防宮頸癌的發(fā)生提供潛在的價(jià)值和治療方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 宮頸癌HeLa和SiHa細(xì)胞（美國(guó)ATCC公司），RPMI1640 液體培養(yǎng)基、DMEM 液體培養(yǎng)基（美國(guó)GIBCO 公司），細(xì)胞上皮標(biāo)志物E-cadherin抗體、細(xì)胞間質(zhì)標(biāo)志物vimentin 抗體、EGFP 抗體、偶聯(lián)HRP 的山羊抗兔抗體（天津賽爾生物公司），細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Fisher 公司），胎牛血清（FBS；美國(guó)Hyclon 公司），LipofectamineTM 2000 regent（美國(guó)Invitrogen 公司），Matrigel、流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD Biosciences 公司），RNase A（100U；德國(guó)Calbiochem 公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)人宮頸癌細(xì)胞系 HeLa 和SiHa 細(xì)胞在含有8%或10%胎牛血清、100 μg/mL 鏈霉素和100 IU/mL 青霉素的RPMI-1640 或DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，將細(xì)胞孵育在37 ℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中，2～3 d 更換1 次新鮮培養(yǎng)液，待細(xì)胞匯合度達(dá)到80%～90%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 提前1 d 接種指數(shù)生長(zhǎng)的HeLa細(xì)胞和SiHa 細(xì)胞于24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，使細(xì)胞匯合度在培養(yǎng)14～18 h 時(shí)達(dá)到70%～80%。配制A 轉(zhuǎn)染液：在100 μL 液體培養(yǎng)基（Opti-MEMα）中加入1 μg 實(shí)驗(yàn)組質(zhì)?；蛘邔?duì)照組質(zhì)粒，吹吸混勻。配制B轉(zhuǎn)染液：把1 μL Lipofectamine 2000 Reagent 脂質(zhì)體加在100 μL 液體Opti-MEMα 中混勻，5 min 后，將A、B 液混合，20 min 后，將混合液加入到24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，4～6 h 棄掉培養(yǎng)板中的液體，每孔加入1 mL含血清的液體培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR） 使用SYBR Premix Ex TaqTM（TaKaRa，大連，中國(guó)）進(jìn)行RTqPCR 以檢測(cè)miRNA 和mRNA 的表達(dá)水平。小RNA特異性莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物用于進(jìn)行miRNA 的逆轉(zhuǎn)錄。U6 snRNA 和β-肌動(dòng)蛋白分別用作miRNA和mRNA的內(nèi)源對(duì)照。

1.2.4 遷移/侵襲實(shí)驗(yàn) 根據(jù)制造商的說(shuō)明書，使用不含或含Matrigel 的transwell 小室進(jìn)行遷移/侵襲測(cè)定。轉(zhuǎn)染后24 h，用1×PBS 洗滌細(xì)胞，重懸于無(wú)血清培養(yǎng)基中并接種到上室（6×104細(xì)胞用于遷移，8×104細(xì)胞用于侵襲）。下室加入600 μL 含有20%FBS的HeLa 細(xì)胞或SiHa 細(xì)胞的培養(yǎng)基。溫育48 或72 h，將遷移/侵襲的細(xì)胞用75%甲醇-25%冰醋酸固定并用結(jié)晶紫染色。在顯微鏡下放大100 倍對(duì)5 個(gè)隨機(jī)選擇的視野進(jìn)行成像，并在Nikon TE2000 顯微鏡下對(duì)遷移/侵襲的細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.2.5 集落形成實(shí)驗(yàn) 在轉(zhuǎn)染后24 h，將HeLa 和SiHa 細(xì)胞以500 個(gè)cell/孔的密度接種到12 孔板中。每3 d 更換1 次新鮮培養(yǎng)基，持續(xù)兩周。用結(jié)晶紫染色，然后計(jì)算菌落形成率。

1.2.6 細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染后24 h，用PBS 洗滌細(xì)胞3 次并用胰蛋白酶消化，然后用95%的乙醇固定過(guò)夜。PBS 洗滌細(xì)胞，并在PBS/0.05%Triton X-100 混合液中重懸，將細(xì)胞與不含DNA 酶的RNase A 在室溫下共溫育30 min，并用25 mg/mL 的碘化丙錠染色。室溫、黑暗中靜置30 min，然后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期變化。

1.2.7 Western blot 通過(guò)蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。轉(zhuǎn)染48 h 后，收集細(xì)胞，用RIPA裂解液在4 ℃條件下裂解30 min。在10%SDS-PAGE凝膠中分離等量的細(xì)胞裂解物，并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，用5%脫脂乳（TBST 稀釋）在室溫下封閉2 h，加入一抗4 ℃孵育過(guò)夜，隨后，將膜與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗兔二抗在室溫下孵育2 h。通過(guò)增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光液檢測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá)，通過(guò)Image J 量化條帶強(qiáng)度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有統(tǒng)計(jì)分析均由Graphpad Prism 7.0 進(jìn)行。使用配對(duì)Student’st檢驗(yàn)評(píng)估對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組之間的顯著性差異。P＜0.05 被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。數(shù)據(jù)顯示為來(lái)自至少3 次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的x±s。

2 結(jié)果

2.1 miR-3685 抑制宮頸癌細(xì)胞的遷移/侵襲及生長(zhǎng)構(gòu)建 miR-3685 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒（pcDNA3/miR-3865）并商業(yè)合成其封閉劑（ASO-miR-3685），用RT-qPCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其有效性，結(jié)果表明質(zhì)粒均有效（圖1A）。Transwell 遷移/侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：過(guò)表達(dá)miR-3685可顯著抑制HeLa 和SiHa 細(xì)胞的遷移/侵襲能力，而封閉miR-3685 可促進(jìn)HeLa 和SiHa 細(xì)胞的遷移/侵襲能力（遷移：圖1B,侵襲：圖1C）。Western blot 實(shí)驗(yàn)（圖1D）、克隆形成實(shí)驗(yàn)（圖1E）及細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)（HeLa：圖1F，SiHa：圖1G）結(jié)果表明：過(guò)表達(dá)miR-3685能抑制HeLa 和SiHa 細(xì)胞的EMT 進(jìn)程、集落形成能力及細(xì)胞周期進(jìn)程，而封閉miR-3685 卻得到相反的結(jié)果。

圖1 miR-3685 對(duì)HeLa 和SiHa 細(xì)胞的遷移/侵襲能力、EMT 進(jìn)程、集落形成能力及細(xì)胞周期進(jìn)程的影響Fig 1 Effect of miR-3685 on migration/invasiveness,EMT progression,colony forming ability and cell cycle progression of HeLa andSiHacells

RT-qPCR 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-3685 的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒及其封閉劑ASO-miR-3685 在HeLa 和SiHa 細(xì)胞中是否有效（A）；Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過(guò)表達(dá)或封閉miR-3685 對(duì)宮頸癌細(xì)胞遷移（B）/侵襲（C）能力的影響；Western blot 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證過(guò)表達(dá)或封閉miR-3685對(duì)宮頸癌細(xì)胞EMT 進(jìn)程的影響（D）；克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-3685 對(duì)宮頸癌細(xì)胞集落形成能力的影響（E）；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)miR-3685 對(duì)HeLa（F）和SiHa（G）細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程的影響（*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001）。

2.2 CTTN 是miR-3685 的直接作用靶基因 為了進(jìn)一步研究miR-3685 的潛在機(jī)制，使用miRBase 2.1 和TargetScan7.1 預(yù)測(cè)miR-3685 的潛在靶點(diǎn),根據(jù)預(yù)測(cè)得分情況挑選了以下4 種候選靶基因，即CTTN,PRKAR2B,ULK2，RERE。在HeLa 細(xì)胞中將miR-3685 結(jié)合CTTN, PRKAR2B, ULK2，RERE 的3′UTR（WT）序列分別克隆到pcDNA3-EGFP 報(bào)告系統(tǒng)中，并在HeLa 細(xì)胞中與pcDNA3/miR-3685 共轉(zhuǎn)染,用Western blot 實(shí)驗(yàn)評(píng)估這4 種候選靶基因的EGFP 蛋白表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比其他3 種候選靶基因，用pcDNA3-EGFP-CTTN-3′UTR 與pcDNA3/miR-3685 共轉(zhuǎn)時(shí),EGFP 的蛋白表達(dá)水平降低的最明顯（圖2A），于是筆者初步選擇CTTN 作為miR-3685 的靶基因進(jìn)行后續(xù)的驗(yàn)靶實(shí)驗(yàn)。在HeLa 細(xì)胞中將miR-3685 結(jié)合CTTN 的3′UTR(WT)或(mut)序列克隆到pcDNA3-EGFP 報(bào)告系統(tǒng)中，并在HeLa 細(xì)胞中與pcDNA3/miR-3685 或ASOmiR-3685 分別共轉(zhuǎn)染。進(jìn)行Western blot 分析以評(píng)估CTTN 的EGFP 蛋白表達(dá)水平。miR-3685 與CTTN 野生型及其突變型之間的結(jié)合位點(diǎn)如圖2B所示。用pcDNA3-EGFP-CTTN-3′UTR 與pcDNA3/miR-3685 共轉(zhuǎn)時(shí)，Western blot 實(shí)驗(yàn)顯示EGFP 蛋白水平明顯降低，用pcDNA3-EGFP-CTTN-3′UTR與ASO-miR-3685 共轉(zhuǎn)時(shí), Western blot 實(shí)驗(yàn)顯示EGFP 蛋白水平有所升高（圖2C）, 用pcDNA3-EGFP-CTTN-3′UTR-mut 與pcDNA3/miR-3685 或ASO-miR-3685 共轉(zhuǎn)時(shí), Western blot 實(shí)驗(yàn)顯示EGFP 蛋白水平?jīng)]有明顯變化（圖2D）。筆者進(jìn)一步測(cè)量了CTTN 的mRNA 表達(dá)水平和內(nèi)源性蛋白表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)miR-3685 后，CTTN 的mRNA 表達(dá)水平和內(nèi)源性蛋白表達(dá)水平明顯降低，而過(guò)表達(dá)ASO-miR-3685 后，CTTN 的mRNA 表達(dá)水平和內(nèi)源性蛋白表達(dá)水平明顯升高(圖2E,F）。這些數(shù)據(jù)證明CTTN 是miR-3685 的直接靶標(biāo)，并且它的表達(dá)受miR-3685 的負(fù)調(diào)節(jié)。

圖2 在HeLa 細(xì)胞中驗(yàn)證CTTN 是miR-3685 的直接靶標(biāo)Fig 2 Verify that CTTN is a direct target of miR-3685 in HeLa cells

用Western blot 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證4 種候選靶基因（CTTN, PRKAR2B, ULK2，RERE）的EGFP 蛋白表達(dá)水平的變化(A)；miR-3685 與CTTN 野生型及突變型之間的結(jié)合位點(diǎn)(B)；pcDNA3-EGFP-CTTN-3′UTR 與pcDNA3/miR-3685 或ASO-miR-3685 共轉(zhuǎn),用Western blot 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證EGFP 蛋白水平的變化(C)；pcDNA3-EGFP-CTTN-3′UTR-mut 與pcDNA3/miR-3685 或ASO-miR-3685 共轉(zhuǎn)，用Western blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證EGFP 蛋白水平的變化(D)；在HeLa 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pcDNA3/miR-3685 或ASO-miR-3685 質(zhì)粒，用RT-qPCR 和Western blot 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CTTN 的mRNA（E）和內(nèi)源性蛋白表達(dá)水平（F）變化（**P＜0.01，***P＜0.001,ns:無(wú)顯著性差異）。

2.3 CTTN 對(duì)宮頸癌細(xì)胞遷移/侵襲、EMT 進(jìn)程、集落形成能力及細(xì)胞周期進(jìn)程的影響 CTTN 的過(guò)表達(dá)和敲降質(zhì)粒用于研究它們?cè)趯m頸癌細(xì)胞中的作用。通過(guò)RT-qPCR（圖3A）和Western blot（圖3B）實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其是否有效，結(jié)果表明質(zhì)粒均有效。Transwell 遷移/侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：過(guò)表達(dá)CTTN 促進(jìn)了HeLa 和SiHa 細(xì)胞的遷移/侵襲能力，而敲降CTTN 抑制了HeLa 和SiHa 細(xì)胞的遷移/侵襲能力（遷移：圖3C，侵襲：圖3D）。Western blot 實(shí)驗(yàn)（圖3E）、克隆形成實(shí)驗(yàn)(圖3F)及細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)(HeLa:圖3G,SiHa: 圖3H) 結(jié)果表明：過(guò)表達(dá)CTTN 可促進(jìn)HeLa 和SiHa 細(xì)胞的EMT 進(jìn)程、集落形成能力及細(xì)胞周期進(jìn)程，敲降CTTN，得到相反的結(jié)果。

圖3 CTTN 對(duì)宮頸癌細(xì)胞遷移/侵襲、EMT 進(jìn)程、集落形成能力及細(xì)胞周期進(jìn)程的影響Fig 3 Effects of CTTN on migration/invasion, EMT progression,colony formingability and cell cycle progression of cervical cancer cells

RT-qPCR 實(shí)驗(yàn)(A)和Western blot 實(shí)驗(yàn)（B）檢測(cè)CTTN 的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒及其敲降質(zhì)粒在HeLa 細(xì)胞中是否有效；過(guò)表達(dá)或敲降CTTN 對(duì)宮頸癌細(xì)胞遷移（C）/侵襲（D）能力的影響；Western blot 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證過(guò)表達(dá)或敲降CTTN 對(duì)宮頸癌細(xì)胞EMT 進(jìn)程的影響（E）；克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CTTN 對(duì)宮頸癌細(xì)胞集落形成能力的影響（F）；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CTTN 對(duì)HeLa（G）和SiHa（H）細(xì)胞的周期進(jìn)程的影響（*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001）。

3 討論

miRNA 在組織和細(xì)胞中通常都是異常表達(dá)的，這表明它們?cè)谂R床應(yīng)用中可作為診斷、治療或預(yù)后的生物標(biāo)志物[13]。比如，在肝癌中低表達(dá)的miR-193a-5p 與其患者的生存期縮短有關(guān)[14]，在結(jié)直腸癌細(xì)胞中，miR-25-3p 可促進(jìn)結(jié)直腸細(xì)胞的血管通透性和血管生成，表明其具有潛在的癌癥進(jìn)展價(jià)值[15]。miR-21siRNA 干擾載體可以抑制宮頸癌Hela 細(xì)胞中miR-21 基因的表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞凋亡,延緩細(xì)胞周期進(jìn)程[16]。本研究?jī)?nèi)容揭示了miR-3685 可以抑制宮頸癌細(xì)胞的遷移、侵襲、EMT 進(jìn)程、細(xì)胞增殖以及細(xì)胞周期進(jìn)程。這些結(jié)果為miR-3685 的功能作用提供了新的見(jiàn)解。

最近，有研究報(bào)道稱，在結(jié)腸癌細(xì)胞中，CTTN 可以通過(guò)invadopodia 形成而募集FMNL2 來(lái)加速肌動(dòng)蛋白聚合和內(nèi)體運(yùn)動(dòng)[17]，還有報(bào)道表明在結(jié)直腸癌中CTTN 可以通過(guò)激活EGFR-MAPK 途徑來(lái)促進(jìn)細(xì)胞的增殖[18]。同時(shí)，一些特異性miRNA 也可以調(diào)節(jié)CTTN 的表達(dá)，例如，miR-182 可以通過(guò)調(diào)節(jié)CTTN的表達(dá)從而抑制肺癌的轉(zhuǎn)移、侵襲和增殖能力[19]，miR-542-3p 通過(guò)抑制cortactin 的表達(dá)抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲[20]。在本研究?jī)?nèi)容中，揭示了CTTN 可以促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的遷移、侵襲能力及生長(zhǎng)。還揭示了miR-3685 對(duì)CTTN 的負(fù)性調(diào)控作用。

總之，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果首次證明了在宮頸癌中miR-3685 可以通過(guò)抑制CTTN 的表達(dá)而發(fā)揮抑癌作用。本研究強(qiáng)調(diào)了miR-3685-CTTN 軸在宮頸癌發(fā)病機(jī)制中的重要性。miR-3685 負(fù)調(diào)控CTTN 的表達(dá)可以為宮頸癌的治療及預(yù)防提供新的參考方向。