金月波

（遼寧農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，遼寧 營(yíng)口 115009）

我國(guó)是世界上人口最多的國(guó)家之一，而半數(shù)以上人口的主食是稻米，可見我國(guó)對(duì)稻米市場(chǎng)需求量十分巨大。確保水稻生產(chǎn)穩(wěn)定的重要措施之一就是合理的施肥種植技術(shù)[1]?；试谝欢ǖ某潭群蜁r(shí)間上對(duì)我國(guó)農(nóng)業(yè)增產(chǎn)增收起了巨大的作用，但化肥與農(nóng)藥的過度使用和依賴，造成了土壤環(huán)境難以修復(fù)的破壞[2-3]，肥料利用率低下、農(nóng)業(yè)成本高[4-7]。同時(shí)施肥過量還常會(huì)產(chǎn)生糧食安全問題[8-9]。阻礙了農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展。微生物是解決農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展問題的突破口，微生物肥料將成為引領(lǐng)未來肥料產(chǎn)業(yè)發(fā)展的新方向，支撐中國(guó)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的必然選擇[10]。本研究是從水稻田分離篩選優(yōu)良的自生固氮菌、溶磷細(xì)菌和解鉀細(xì)菌，旨在提高水稻產(chǎn)量，改善水稻品質(zhì)，降低化學(xué)肥料使用量，保護(hù)農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境。

1 試驗(yàn)材料

1.1 土壤樣品的采集

分離細(xì)菌的土樣采自遼寧省盤錦市郊區(qū)養(yǎng)蟹水稻田。采用10點(diǎn)取樣，除去表土，將附有根際土壤的水稻根裝入無菌袋中，并編號(hào)、記錄采集地點(diǎn)、日期。帶回實(shí)驗(yàn)室密封保存3個(gè)月后進(jìn)行促生菌的分離。

1.2 水稻種子

豐優(yōu)301（購于沈陽市沈北新區(qū)種子公司）。

1.3 培養(yǎng)基

所用化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純制品。

1.3.1 阿須貝培養(yǎng)基

Ashby無氮培養(yǎng)基：甘露醇10g，KH2PO40.2g，MgSO4·7H2O，0.2g，NaCl 0.2g，CaSO4·2H2O 0.2g，CaCO35g，pH7.2，蒸餾水1 000mL。121℃滅菌20min。

1.3.2 硅酸鹽細(xì)菌篩選培養(yǎng)基

鉀長(zhǎng)石粉（200目）2.0g，甘露醇10.0g，NaH2PO40.5g，MgSO40.2g，NaCl 0.2g，CaSO40.2g，CaCO31.0g，pH7.4～7.6，蒸餾水1 000mL。121℃滅菌20min。

1.3.3 磷細(xì)菌篩選培養(yǎng)基

蔗糖10.0g，Ca3（PO4）25.0g，NaCl 0.3g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03g，（NH4）2SO40.5g，KCl 0.3g，MnSO4·4H2O 0.03g，MgSO4·7H2O 0.3g，pH7.0～7.4，蒸餾水1 000mL。121℃滅菌20min。

2 試驗(yàn)方法

2.1 水稻根際細(xì)菌的分離與純化

取附有土壤的水稻根須，剪斷放入裝有225 mL無菌水的三角瓶中，制成菌懸液，采用10倍梯度稀釋法稀釋成系列菌懸液。

2.1.1 自生固氮菌的分離與純化

將不同稀釋度的菌懸液分別涂到阿須貝無氮培養(yǎng)基平板上，3次重復(fù)。28℃培養(yǎng)48h，挑取平板上生長(zhǎng)旺盛的菌落。采用交叉劃線法分離純化3～4次，傳代5次。保藏。

2.1.2 硅酸鹽細(xì)菌的分離與純化

將不同稀釋度的菌懸液分別涂到硅酸鹽細(xì)菌培養(yǎng)基平板上，3次重復(fù)。28℃培養(yǎng)48h，挑取平板上生長(zhǎng)旺盛的光滑透明油滴狀菌落。采用交叉劃線法分離純化3～4次，傳代5次。保藏。

2.1.3 溶磷細(xì)菌的分離與純化

將不同稀釋度的菌懸液分別涂到磷細(xì)菌篩選培養(yǎng)基平板上，3次重復(fù)。28℃培養(yǎng)48h，挑取溶磷圈大的菌落。采用交叉劃線法分離純化3～4次，傳代5次保藏。

2.2 水稻根際細(xì)菌的復(fù)篩

2.2.1 自生固氮菌的篩選

將篩選得到的自生固氮菌菌株搖瓶培養(yǎng)，凱氏定氮法測(cè)其固氮酶活性[11]，選取固氮酶活性高的菌株。

2.2.2 硅酸鹽細(xì)菌的篩選

將篩選得到的硅酸鹽細(xì)菌菌株搖瓶培養(yǎng)，原子吸收法[12]測(cè)其發(fā)酵液中可溶性鉀的含量，選取解鉀活性高的菌株。

2.2.3 溶磷細(xì)菌的篩選

將篩選得到的溶磷細(xì)菌菌株搖瓶培養(yǎng)， 鉬銻抗比色法[13]測(cè)其溶磷活性大小，選取溶磷活性高的菌株。

2.3 水稻根際細(xì)菌的平皿栽培試驗(yàn)

每個(gè)直徑9 cm的平皿加入20g滅菌的河沙，分別加入阿須貝無氮液體培養(yǎng)基、硅酸鹽細(xì)菌液體培養(yǎng)基以及磷細(xì)菌篩選液體培養(yǎng)基15 ml，混勻。分別接種對(duì)水稻生長(zhǎng)有較好促生效果的固氮、解鉀、溶磷菌株，不接菌作空白對(duì)照。每皿10粒水稻種子，3次重復(fù)，置于28℃光照培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)，每天噴水3～4次，觀察水稻長(zhǎng)勢(shì)，播種15 d后收獲，將苗貼培養(yǎng)基處剪下，測(cè)定株高、鮮重和干重。

2.4 篩選所得菌株的初步鑒定

2.4.1 菌株的形態(tài)及染色試驗(yàn)

將自生固氮菌、硅酸鹽細(xì)菌、溶磷細(xì)菌分別接種在阿須貝無氮培養(yǎng)基、硅酸鹽細(xì)菌培養(yǎng)基、磷細(xì)菌篩選培養(yǎng)基上，培養(yǎng)16～24h，進(jìn)行革蘭氏染色；在光學(xué)顯微鏡下觀察個(gè)體形態(tài)。培養(yǎng)36h進(jìn)行芽孢、莢膜和鞭毛染色[14]。

2.4.2 菌株的生理生化特性

對(duì)菌株進(jìn)行唯一碳源試驗(yàn)、唯一氮源試驗(yàn)、檸檬酸鹽試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)（M.R.）、V.P.試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、纖維素分解試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、接觸酶試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、氧化酶試驗(yàn)、H2S試驗(yàn)、糖醇發(fā)酵試驗(yàn)及細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性觀察[15～16]。

3 結(jié)果與分析

3.1 水稻根際細(xì)菌的篩選結(jié)果

用稀釋平板涂布法對(duì)水稻植株根際土壤樣品進(jìn)行細(xì)菌分離，共得到13株在阿須貝無氮培養(yǎng)基上旺盛生長(zhǎng)的細(xì)菌，15株在硅酸鹽細(xì)菌培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好的細(xì)菌，8株在磷細(xì)菌篩選培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好的細(xì)菌。經(jīng)多次傳代培養(yǎng)后，部分菌株活性減弱或喪失，最終獲得自生固氮菌2株，編號(hào)為N02、N11；硅酸鹽細(xì)菌3株，編號(hào)為K01、K06、K09；溶磷菌1株，編號(hào)為P07。各菌株分別接入相應(yīng)無氮、解鉀、溶磷液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，測(cè)得各菌株固氮、解鉀、溶磷效果見圖1、2、3。由圖1可見，N02和N11均有固氮能力，N11的固氮效果最好，固氮量為2.37μg/m l，對(duì)照組無固氮能力。由圖2可見，硅酸鹽細(xì)菌K01解鉀能力最強(qiáng)，菌液含鉀量高達(dá)55.9μg/ml。由圖3可見，溶磷菌P07菌液含磷量為69.0μg/m l，比對(duì)照高158.4%。選擇N11、K01、P07菌株進(jìn)行下一步水稻平板栽培試驗(yàn)。

3.2 水稻根際細(xì)菌的平皿栽培試驗(yàn)結(jié)果

由表1可見，接種了N11的水稻株高比對(duì)照增加了29.08%，鮮重增加了30.84%，干重增加了19.45%。說明N11菌株對(duì)水稻苗期生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。

圖1 固氮菌的固氮情況

圖2 硅酸鹽細(xì)菌的解鉀情況

圖3 溶磷菌的溶磷情況

表1 接種固氮菌的水稻平皿試驗(yàn)結(jié)果

由表2可見，接種了K01菌株的水稻株高增加了13.32%，鮮重增加了10.04%，干重增加了11.42%。說明K01菌株對(duì)水稻苗期生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。

表2 接種硅酸鹽細(xì)菌的水稻平皿試驗(yàn)結(jié)果

由表3可見，接種了P07的水稻株高比對(duì)照增加了14.20%，鮮重增加了8.19%，干重增加了14.46%。說明P07菌株對(duì)水稻苗期生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。

表3 接種溶磷細(xì)菌的水稻平皿試驗(yàn)結(jié)果

3.3 菌株初步鑒定結(jié)果

將自生固氮菌N11、硅酸鹽細(xì)菌K01、溶磷菌P07進(jìn)行形態(tài)和生理生化鑒定，各菌株的菌體形態(tài)特征、菌落特征及革蘭氏染色結(jié)果見表4。

表4 菌株的菌體形態(tài)特征、菌落特征及革蘭氏染色

菌株N11接觸酶實(shí)驗(yàn)、淀粉水解實(shí)驗(yàn)、VP實(shí)驗(yàn)、細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性實(shí)驗(yàn)、產(chǎn)H2S實(shí)驗(yàn)陽性，能利用淀粉、甘露醇、蘋果酸，初步確定屬于固氮菌屬菌株。菌株K01接觸酶實(shí)驗(yàn)、檸檬酸鹽實(shí)驗(yàn)、硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)、過氧化氫實(shí)驗(yàn)、VP實(shí)驗(yàn)、細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性實(shí)驗(yàn)及葡萄糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)陽性，初步確定屬于芽孢桿菌屬。菌株P(guān)07硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)、氧化酶實(shí)驗(yàn)、接觸酶實(shí)驗(yàn)、甲基紅實(shí)驗(yàn)、產(chǎn)H2S實(shí)驗(yàn)、細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性實(shí)驗(yàn)陽性，能利用葡萄糖，初步確定屬于假單孢菌屬。

4 結(jié)論與討論

4.1 結(jié)論

試驗(yàn)從水稻根際土壤中分離得到自生固氮菌13株，硅酸鹽細(xì)菌15株，溶磷菌8株，經(jīng)多次傳代、液體培養(yǎng)復(fù)篩，確定固氮、解鉀、溶磷能力最強(qiáng)的菌株N11、K01、P07進(jìn)行水稻平皿栽培試驗(yàn)，根據(jù)對(duì)水稻株高、鮮重和干重的結(jié)果比較，各菌株對(duì)水稻苗期生長(zhǎng)均有促進(jìn)作用。菌株初步種屬鑒定結(jié)果：菌株N11、K01、P07分別屬于固氮菌屬、芽孢菌屬和假單孢菌屬。

4.2 討論

據(jù)統(tǒng)計(jì)，2015年遼寧省稻田養(yǎng)殖面積達(dá)81 533.3 hm2，盤錦稻田養(yǎng)蟹面積達(dá)52 533.3 hm2，已成為我國(guó)北方最大的河蟹養(yǎng)殖基地，營(yíng)口、錦州、丹東等地區(qū)也有一定規(guī)模的稻田養(yǎng)殖[17]。本研究所用土壤樣品采自盤錦養(yǎng)蟹稻田，目的是分離、篩選出適應(yīng)養(yǎng)蟹稻田生態(tài)環(huán)境、對(duì)養(yǎng)蟹稻田水稻具有明顯促生作用的自生固氮菌、溶磷細(xì)菌和解鉀細(xì)菌。所采土壤樣品密封保存3個(gè)月后進(jìn)行促生菌的分離篩選，目的是通過自然篩選排除不易長(zhǎng)期保存的劣質(zhì)性狀菌株，以減少不必要的工作負(fù)擔(dān)。

在平皿上表現(xiàn)出對(duì)水稻苗期生長(zhǎng)有促進(jìn)作用的各菌株，能否在環(huán)境更為復(fù)雜的水稻土壤中迅速生長(zhǎng)繁殖、能否相互協(xié)同促進(jìn)水稻生長(zhǎng)發(fā)育、彼此能否產(chǎn)生拮抗作用，還有待于進(jìn)一步研究。