徐君毅,宋學(xué)民,以敏

結(jié)腸癌是一種常見的惡性腫瘤，發(fā)病率和死亡率都很高，近年來隨著我國高脂肪低纖維飲食結(jié)構(gòu)的變化，結(jié)腸癌成為了消化道最常見的惡性腫瘤之一[1,2]。目前治療結(jié)腸癌的方法較多，主要包括統(tǒng)開腹手術(shù)切除及化療、放療治療；雖然開腹手術(shù)有較為先進(jìn)的完整結(jié)腸系膜切除術(shù)等但術(shù)中出血量較多，有較多的并發(fā)癥等[3,4]。放化療法雖然對患者有不錯(cuò)的治療效果，但其毒副作用明顯，不僅嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，更有患者因承受不了化療輔助用而選擇終止治療，對患者的治療十分不利[5,6]，因此尋求相關(guān)的基因或因子抑制直腸癌細(xì)胞的惡性腫瘤特征顯得尤為重要。肝細(xì)胞核因子3β(HNF3β)又稱為FOXA2(forkhead box A2)，屬于肝細(xì)胞核因子(HNF)家族[7]。但目前關(guān)于HNF3β對結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞株細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的機(jī)制尚不完全統(tǒng)一。本文旨在研究HNF3β對結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞株細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的影響，以期了解其作用效果及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要細(xì)胞

結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞株購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.2 主要試劑與儀器

包含HNF3β蛋白全長的peDNA3.1質(zhì)粒購自由谷歌生物科技有限公司；HNF3β單克隆抗體(貨號：sc-6554)、E-cadherin(貨號：sc-8426)、N-cadherin抗體(貨號：sc-8424)、Ki67抗體(貨號：sc-6554)、Vimentin抗體(貨號：sc-6260)、JAK抗體(貨號：sc-376996)、STAT3抗體(貨號：sc-8019)購自美國Santa Cruz公司；PCNA抗體(貨號：ab29)購自艾博抗公司；RPMI1640 培養(yǎng)基購自廣州威佳科技有限公司；青霉素鈉購自哈藥集團(tuán)制藥總廠；磷酸緩沖液PBS購自天津科密歐有限公司；CCK 試劑盒購自上海撫生實(shí)業(yè)有限公司；胎牛血清購自杭州四季青公司；脂質(zhì)體LipofectamineⅢ3000購自Invitrogen公司；Transwell小室購自Corning Corstart公司。

TGL-16M低溫離心機(jī)購自濟(jì)南來寶醫(yī)療器械有限公司；光學(xué)顯微鏡購自東莞市同創(chuàng)儀器有限公司；酶聯(lián)免疫檢測儀購自北京諾亞威儀器儀表有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國Forma公司；蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜儀購自美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 分組干預(yù) 體外培養(yǎng)結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞株細(xì)胞，并分為對照組(Control)、HNF3β轉(zhuǎn)染組(HNF3β)和空轉(zhuǎn)質(zhì)粒組(NC)。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 將直腸癌SW480細(xì)胞培養(yǎng)于含10% FBS、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素RPMI 1640 培養(yǎng)基中，保存在溫度為37 ℃、CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。使用Lipofectaminel 3000轉(zhuǎn)染試劑在細(xì)胞對數(shù)生長期轉(zhuǎn)染pcDNA3.1質(zhì)粒。HNF3β轉(zhuǎn)染組將含有目的基因的質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染；空轉(zhuǎn)質(zhì)粒組使用空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，對照組不做任何處理。轉(zhuǎn)染過程依據(jù)轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行。

1.3.3 Western blot檢測蛋白表達(dá)水平 將對數(shù)期細(xì)胞按照1×105個(gè)接種至6空白，貼壁生長后使用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測各孔蛋白總量。將樣本經(jīng)10%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳在100 v條件下分離，按照凝膠面積0.65 mA/cm2恒定電流轉(zhuǎn)移1.5 h至PVDF膜后使用5%的脫脂奶粉很穩(wěn)封閉2 h，加入稀釋比例1∶500的HNF3β抗體E-cadherin抗體、N-cadherin抗體、Ki67抗體、Vimentin抗體、PCNA抗體、JAK抗體、STAT3抗體，在4 ℃條件下孵育過夜，TBST漂洗后使用稀釋比例為1∶2 000的辣根過氧化物沒標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗孵育1.5 h；曝光后以β-actin內(nèi)參蛋白，目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值為相對蛋白表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.4 采用克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞生長情況 取對數(shù)期直腸癌SW480細(xì)胞，制作1×103個(gè)/mL單細(xì)胞懸液，六孔板中加入2.6 mL的細(xì)胞培養(yǎng)液，置于培養(yǎng)箱中平衡后，每孔加入0.4 mL的細(xì)胞懸液(約400個(gè)細(xì)胞)，2周后微鏡下可見明顯克隆形成，結(jié)晶紫染色后拍照，并計(jì)算克隆形成率。

1.3.5 Transwell小室檢測各組細(xì)胞侵襲能力 取直腸癌SW480細(xì)胞在Transwell小室培養(yǎng) 24 h后，調(diào)整細(xì)胞數(shù)目為1×105個(gè)/ml并制成無 FBS 懸浮液，小室下層加入含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液，恒溫培養(yǎng)1 d后，隨機(jī)選取視野使用顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，同時(shí)統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)量。

1.3.6 劃痕實(shí)驗(yàn)法檢測人直腸癌SW480細(xì)胞遷移能力 取對數(shù)生長期直腸癌SW480細(xì)胞，使用槍頭在單層腸癌SW480細(xì)胞劃橫，拍照；培養(yǎng)1 d后顯微鏡下再次觀察拍照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究數(shù)據(jù)分析采用軟件為SPSS 22.0，作圖采用軟件為GraphPad Prism5，多組間比較使用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t法；若P<0.05則表明數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，本研究所有檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞HNF3β表達(dá)情況

由蛋白質(zhì)印記實(shí)驗(yàn)可以看出，相比對照組，HNF3β轉(zhuǎn)染組HNF3β蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01)，相比HNF3β轉(zhuǎn)染組空轉(zhuǎn)質(zhì)粒組HNF3β蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01)，見圖1。

圖1 各組細(xì)胞HNF3β表達(dá)情況 與對照組相比,**P<0.01；與HNF3β轉(zhuǎn)染組相比,##P<0.01

2.2 各組細(xì)胞增殖情況檢測結(jié)果

由圖2(A)細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)可以看出，相比對照組，HNF3β轉(zhuǎn)染組結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480克隆形成率顯著降低(P<0.01)，相比HNF3β轉(zhuǎn)染組空轉(zhuǎn)質(zhì)粒組結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480克隆形成率顯著升高(P<0.01)。由圖2(B)蛋白質(zhì)印記實(shí)驗(yàn)形成實(shí)驗(yàn)可以看出，相比對照組，HNF3β轉(zhuǎn)染組PCNA蛋白相對表達(dá)、Ki67蛋白相對表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)，相比HNF3β轉(zhuǎn)染組空轉(zhuǎn)質(zhì)粒組PCNA蛋白相對表達(dá)、Ki67蛋白相對表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)。

圖2 各組細(xì)胞增殖情況檢測結(jié)果 A:克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果；B:蛋白質(zhì)印記檢測增殖相關(guān)蛋白表達(dá)結(jié)果；與對照組相比,**P<0.01；與HNF3β轉(zhuǎn)染組相比,##P<0.01

2.3 各組細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移檢測結(jié)果

由圖3(A)Transwell小室實(shí)驗(yàn)可以看出，相比對照組，HNF3β轉(zhuǎn)染組結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480單位面積侵襲細(xì)胞數(shù)目顯著降低(P<0.01)，相比HNF3β轉(zhuǎn)染組，空轉(zhuǎn)質(zhì)粒組結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480單位面積侵襲細(xì)胞數(shù)目顯著升高(P<0.01)。由圖2蛋白質(zhì)印記實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲遷移相關(guān)蛋白可以看出，相比對照組，HNF3β轉(zhuǎn)染組E-cadherin蛋白相對表達(dá)水平顯著升高、N-cadherin蛋白相對表達(dá)、Vimentin蛋白相對表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)，相比HNF3β轉(zhuǎn)染組，空轉(zhuǎn)質(zhì)粒組E-cadherin蛋白相對表達(dá)水平顯著降低、N-cadherin蛋白相對表達(dá)、Vimentin蛋白相對表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)。

圖3 各組細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移檢測結(jié)果 A:Transwell小室結(jié)果；B:蛋白質(zhì)印記檢測侵襲、遷移相關(guān)蛋白表達(dá)結(jié)果；與對照組相比,**P<0.01；與HNF3β轉(zhuǎn)染組相比,##P<0.01

2.4 HNF3β對結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞JAK/STA信號通路影響檢測結(jié)果

由蛋白質(zhì)印記實(shí)驗(yàn)可以看出，相比對照組，HNF3β轉(zhuǎn)染組JAK1蛋白相對表達(dá)、STAT3蛋白相對表達(dá)顯著降低(P<0.01)，相比HNF3β轉(zhuǎn)染組，空轉(zhuǎn)質(zhì)粒組JAK1蛋白相對表達(dá)、STAT3蛋白相對表達(dá)顯著升高(P<0.01)，見圖4。

圖4 HNF3β對結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞JAK/STA信號通路影響檢測結(jié)果 與對照組相比,**P<0.01；與HNF3β轉(zhuǎn)染組相比,##P<0.01

3 討論

癌細(xì)胞的增殖是其重要的惡性生物學(xué)特征之一[8]，目前較為常見的細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白包括：PCNA和Ki67。其中PCNA是增殖細(xì)胞核抗原PNCA指數(shù)越高，細(xì)胞的分裂增殖越快，最終會(huì)讓細(xì)胞獲得無限增殖的能力并使細(xì)胞在形態(tài)和結(jié)構(gòu)機(jī)能上改變，達(dá)到細(xì)促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用[9]。Ki67是一種細(xì)胞周期相關(guān)核抗原，是細(xì)胞核內(nèi)與細(xì)胞分裂增殖相關(guān)的蛋白抗原，其表達(dá)水平反映細(xì)胞增殖的敏感指標(biāo)同時(shí)這種基因在維持結(jié)構(gòu)方面起著重要作用[10]。本研究通過克隆形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，相比對照組，HNF3β轉(zhuǎn)染組結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480克隆形成率顯著降低。同時(shí)通過蛋白質(zhì)印記實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，相比對照組，HNF3β轉(zhuǎn)染組PCNA蛋白相對表達(dá)、Ki67蛋白相對表達(dá)水平顯著降低。說明結(jié)直腸癌細(xì)胞導(dǎo)入HNF3β基因后細(xì)胞增殖能力顯著降低，其作用機(jī)理可能是通過抑制增殖相關(guān)蛋白的表達(dá)，抑制細(xì)胞的有絲分裂，導(dǎo)致細(xì)胞的細(xì)胞周期受到阻滯。盧浩[11]研究表明,HNF3B高表達(dá)可以抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖，與本研究得出的結(jié)論相一致。

細(xì)胞的侵襲和遷移能力也是癌細(xì)胞的重要惡性生物學(xué)特征之一[12]。細(xì)胞的侵襲和遷移受到上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial mesenchyml transition，EMT)的調(diào)節(jié)[13]。EMT是指上皮細(xì)胞能暫時(shí)喪失細(xì)胞極性獲得間質(zhì)細(xì)胞移動(dòng)能力。腫瘤細(xì)胞能夠通過細(xì)胞極性喪失，改變自身細(xì)胞形態(tài)與其他細(xì)胞分離[14-15]；同時(shí)通過下調(diào)細(xì)胞黏附因子E-鈣黏蛋白(E-Cadherin)的表達(dá)，促進(jìn)N-鈣黏蛋白(N-Cadherin)和Vimentin蛋白相對表達(dá)將角蛋白細(xì)胞骨架變?yōu)椴ㄐ渭?xì)胞骨架，使得細(xì)胞穿透胞間連接，增強(qiáng)細(xì)胞的侵襲能力[16]。本研究Transwell小室實(shí)驗(yàn)可以看出，相比對照組，HNF3β轉(zhuǎn)染組結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480單位面積侵襲細(xì)胞數(shù)目顯著降低，同時(shí)相比對照組，HNF3β轉(zhuǎn)染組E-cadherin蛋白相對表達(dá)水平顯著升高、N-cadherin蛋白相對表達(dá)、Vimentin蛋白相對表達(dá)水平顯著降低。說明HNF3β可以有效抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力，其作用機(jī)制可能是HNF3β可以通過調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的EMT過程，并通過抑制EMT過程中的蛋白表達(dá)，增加黏附相關(guān)蛋白的表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移相關(guān)。朱宏明等[17]研究表明，一種腫瘤細(xì)胞的EMT過程可有效抑制腫瘤的侵襲和遷移，與本研究得出的結(jié)論相一致。

JAK-STAT3信號通路可參與細(xì)胞分化、增殖、凋亡及免疫調(diào)節(jié)[18]。JAK-STAT信號通路主要依靠調(diào)控相關(guān)靶點(diǎn)的磷酸化水平達(dá)到激活和抑制的效果。STAT3的信號傳導(dǎo)具有內(nèi)在酪氨酸激酶活性的生長因子受體，如STAT3蛋白[19]。缺乏內(nèi)在酪氨酸激酶活性的受體，例如 IL-6可以聚集JAK家族成員使得自身磷酸化而激活，同時(shí)磷酸化受體胞漿區(qū)的酪氨酸殘基可以形成STAT3識別的SH2結(jié)構(gòu)域，促進(jìn)胞漿中相應(yīng)的STAT成員與之結(jié)合，并在JAK激酶的作用下形成同源或異源二聚體，激活細(xì)胞周期調(diào)節(jié)基因，達(dá)到調(diào)節(jié)腫瘤的效果。本研究發(fā)現(xiàn)，相比對照組，HNF3β轉(zhuǎn)染組JAK1蛋白相對表達(dá)、STAT3蛋白相對表達(dá)顯著降低。說明HNF3β可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，其作用機(jī)制可能是參與JAK-STAT3信號通路的調(diào)控，抑制相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而激活細(xì)胞周期調(diào)節(jié)基因?qū)崿F(xiàn)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。王霄等[20]研究表明，通過調(diào)節(jié)JAK-STAT3信號通路可以有效抑制細(xì)胞的增殖及遷移能力，與本研究得出的結(jié)論相一致。

綜上所述HNF3β是結(jié)直腸癌的抑癌基因，可能通過調(diào)控JAK/STAT3信號通路抑制SW480細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，但影響癌細(xì)胞的增殖和侵襲、遷移涉及到的信號通路和蛋白較多，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中將進(jìn)一步探討HNF3β對其他蛋白和信號通路的調(diào)節(jié)作用。