顏彥，吳琳，林道銳

結(jié)腸癌是一種常見的惡性腫瘤，發(fā)病率和死亡率都較高，近年來隨著我國高脂肪低纖維飲食結(jié)構(gòu)的變化，結(jié)腸癌成為了消化道最常見的惡性腫瘤之一[1-2]。由于結(jié)腸癌位置低，其位置深入盆腔，解剖關系復雜，傳統(tǒng)的手術治療往往無法將腫瘤徹底清除，因此患者術后復發(fā)率高[3]。放化療法雖然對患者有不錯的治療效果，但其毒副作用明顯，不僅嚴重影響患者的生活質(zhì)量，同時有些患者因承受不了化療的痛苦而選擇終止治療，對患者的康復十分不利[4-5]。目前常用的腫瘤化療輔助藥物有奧沙利鉑(oxaliplatin，L-OHP)，使用L-OHP可以有效抑制腫瘤細胞的增殖并促進腫瘤細胞的凋亡[6-7]，但大量使用L-OHP有一定的副作用，因此尋求對結(jié)腸癌新的治療藥物是目前研究的重點。花青素又稱花色素，是自然界一類廣泛存在于植物中的水溶性天然色素[8]。研究表明花青素主要是通過清除自由基抗氧化作用，抑制腫瘤細胞增殖和誘導腫瘤細胞凋亡[9-10]。但目前關于花青素協(xié)同奧沙利鉑對結(jié)腸癌細胞的增殖和凋亡作用效果的研究較少。本文旨在研究花青素協(xié)同奧沙利鉑對人結(jié)腸癌HCT116細胞增殖及凋亡的影響，以期了解花青素協(xié)同奧沙利鉑對人結(jié)腸癌HCT116細胞增殖及凋亡的機制。

1 材料與方法

1.1 主要細胞

人結(jié)腸癌HCT116細胞購自中國科學院細胞庫。

1.2 主要試劑與儀器

花青素(純度>98)購自天津科密歐有限公司；奧沙利鉑(國藥準字：H20000337；規(guī)格：50 mg)江蘇恒瑞藥業(yè)股份有限公司；青霉素鈉購自哈藥集團制藥總廠；RPMI1640 培養(yǎng)基購自廣州威佳科技有限公司；青霉素鈉購自哈藥集團制藥總廠；A Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒(貨號：BB-4101；批號：BB-4101)購自BestBio-貝博公司；磷酸緩沖液PBS購自天津科密歐有限公司；Smad2抗體(貨號：sc-101153；批號：20190103)、Smad3抗體(貨號：sc-133098；批號：20190105)、Bcl-2抗體(貨號：sc-7382；批號：20181201)、Bax抗體(貨號：sc-7480；批號)、Ki67抗體(貨號：sc-23900；批號:20181203)購自美國Santa Cruz公司。

TGL-16M低溫離心機購自濟南來寶醫(yī)療器械有限公司；光學顯微鏡購自東莞市同創(chuàng)儀器有限公司；酶聯(lián)免疫檢測儀購自北京諾亞威儀器儀表有限公司；熒光分光光度計購自上海儀電分析儀器有限公司；流式細胞儀購自賽默飛世爾科技有限公司；細胞培養(yǎng)箱購自美國Forma公司；蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜儀購自美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 分組干預 體外培養(yǎng)人結(jié)腸癌HCT116細胞，并分為：對照組、花青素組、奧沙利鉑組、聯(lián)合組。對照組細胞使用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)；花青素組使用無血清培養(yǎng)加含有100 g/L的花青素培養(yǎng)；奧沙利鉑組使用無血清培養(yǎng)加含有0.010 g/L的奧沙利鉑培養(yǎng)；聯(lián)合組使用無血清培養(yǎng)加含有100 g/L的花青素及0.010 g/L的奧沙利鉑培養(yǎng)。

1.3.2 細胞培養(yǎng) 將人結(jié)腸癌HCT116細胞培養(yǎng)于含10%FBS、100 U/mL 青霉素和100 U/mL鏈霉素RPMI1640 培養(yǎng)基中，保存在溫度為37 ℃、CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.3.3 MTT法檢測細胞的增殖情況 將對數(shù)生長期的人結(jié)腸癌HCT116細胞接種于孔板中分別用含花青素(30 g/L、60 g/L、90 g/L、120 g/L、150 g/L)、奧沙利鉑(0.003 g/L、0.006 g/L、0.009 g/L、0.012 g/L、0.015 g/L)、聯(lián)合用藥(花青素30 g/L+奧沙利鉑0.003 g/L、花青素60 g/L+奧沙利鉑0.006 g/L花青素90 g/L+奧沙利鉑0.009 g/L花青素120 g/L+奧沙利鉑0.012 g/L花青素150 g/L+奧沙利鉑0.015 g/L)培養(yǎng)液預處理1 d。在接種的孔板中加入MTT溶液。4 h后去除上清，加入DMSO震蕩至結(jié)晶物完全溶解后溶解。分別48 h時波長為570 nm處溶解的溶劑的檢測光密度(OD)值。

1.3.4 克隆形成實驗檢測細胞生長 取對數(shù)生長期人結(jié)腸癌HCT116細胞，制作1×103個/mL單細胞懸液，六孔板中加入2.6 mL的細胞培養(yǎng)液，置于培養(yǎng)箱中平衡后，每孔加入0.4 mL的細胞懸液(約400個細胞)，2周后微鏡下可見明顯克隆形成，結(jié)晶紫染色后拍照，并計算克隆形成率。

1.3.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡情況 取對數(shù)生長期人結(jié)腸癌HCT116細胞，使用恒溫離心機保持4 ℃，離心5 min收集細胞；收集細胞后加入100 μL Binding Buffer重懸細胞并加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，輕輕混勻；室溫避光孵育15 min并加入400 μL Binding Buffer使用流式細胞儀檢測期人結(jié)腸癌HCT116細胞凋亡情況。

1.3.6 Western blot 檢測蛋白表達水平 將人結(jié)腸癌HCT116細胞1×105個/孔板接種至6孔板，每個濃度設置5個重復孔，使用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測各孔蛋白總量。將樣本經(jīng)10%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳在100 V條件下分離，按照凝膠面積0.65 mA/cm2的恒定電流轉(zhuǎn)移1.5 h至PVDF膜后使用5%的脫脂奶粉恒溫封閉2 h，加入稀釋比例為1∶500的兔抗人Ki 67、Bcl-2、Bax、TGF、p-Smad2、Smad2、p-Smad3、Smad3抗體，在4 ℃條件下孵育過夜，TBST漂洗后加入二抗孵育1.5 h；曝光后以β-actin為內(nèi)參蛋白，目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值為相對蛋白表達水平，實驗重復3次。

1.4 統(tǒng)計學方法

本研究數(shù)據(jù)處理采用軟件為SPSS 22.0，作圖采用軟件為GraphPad Prism5，多組間比較使用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t法；若P<0.05則表明數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計學意義，本研究所有檢驗均為雙側(cè)檢驗。

2 結(jié)果

2.1 花青素協(xié)同奧沙利鉑對人結(jié)腸癌HCT116細胞生長的影響

由MTT實驗可以發(fā)現(xiàn)，48 h奧沙利鉑處理人結(jié)腸癌HCT116細胞半數(shù)致死濃度(IC50)為0.010 g/L，花青素對人結(jié)腸癌HCT116細胞IC50為100 g/L，花青素聯(lián)合奧沙利鉑對人結(jié)腸癌HCT116細胞IC50為：花青素60 g/L、奧沙利鉑0.006 g/L，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖1。

圖1 花青素協(xié)同奧沙利鉑對人結(jié)腸癌HCT116細胞生長的影響

2.2 花青素協(xié)同奧沙利鉑對人結(jié)腸癌HCT116細胞增殖的影響

由克隆形成實驗和蛋白質(zhì)實驗可以發(fā)現(xiàn)，相比對照組，花青素組和奧沙利鉑組細胞克隆形成率、Ki67蛋白表達水平顯著降低(P<0.001)；相比花青素組和奧沙利鉑組，聯(lián)合組細胞克隆形成率、Ki67蛋白表達水平顯著降低(P<0.001)，見圖2。

圖2 花青素協(xié)同奧沙利鉑對人結(jié)腸癌HCT116細胞增殖的影響 A:克隆形成實驗結(jié)果；B:增殖蛋白Ki67檢測結(jié)果；與對照組相比,**P<0.01；與花青素組或奧沙利鉑組相比,##P<0.01

2.3 花青素協(xié)同奧沙利鉑對人結(jié)腸癌HCT116細胞凋亡的影響

由流式細胞儀檢測人結(jié)腸癌HCT116細胞凋亡和蛋白質(zhì)印跡實驗發(fā)現(xiàn)，相比對照組，花青素組和奧沙利鉑組人結(jié)腸癌HCT116細胞凋亡率、Bax蛋白性對表達顯著升高，Bcl-2蛋白相對表達顯著降低(P<0.01)；相比花青素組和奧沙利鉑組，聯(lián)合組細胞人結(jié)腸癌HCT116細胞凋亡率、Bax蛋白性對表達顯著升高，Bcl-2蛋白相對表達顯著降低(P<0.01)，見圖3。

2.4 花青素協(xié)同奧沙利鉑對人結(jié)腸癌HCT116細胞TGF-βsmad信號通路的影響

由蛋白質(zhì)印跡實驗可以發(fā)現(xiàn)，相比對照組，花青素組和奧沙利鉑組p-Smad2、p-Smad3、Smad2、Smad3、TGF蛋白相對表達水平顯著升高(P<0.01)；相比花青素組和奧沙利鉑組，聯(lián)合組p-Smad2、p-Smad3、Smad2、Smad3、TGF蛋白相對表達水平顯著升高(P<0.01)，見圖4。

3 討論

目前結(jié)腸癌患者多使用放化療的治療方案，但化療和放療均會給患者帶來較多的痛苦及不良反應，尋找合適的輔助藥物減少患者的痛苦具有重要的臨床意義。現(xiàn)階段研究相關的藥物主要可以通過抑制結(jié)腸癌的惡性增殖、侵襲及遷移等相關惡性生物學特征起到輔助治療的效果。奧沙利鉑和花青就是兩種較為常見的輔助藥物，對部分癌細胞具有一定的抑制作用，本研究檢測了青素協(xié)同奧沙利鉑對人結(jié)腸癌HCT116細胞增殖及凋亡的影響。使用奧沙利鉑處理人結(jié)腸癌HCT116細胞，48 h后，半數(shù)致死濃度為0.010 g/L；使用花青素處理人結(jié)腸癌HCT116細胞，48 h后，半數(shù)致死濃度為100 g/L；故本實驗花青素組和分別選用100 g/L，奧沙利鉑組0.010 g/L聯(lián)合組使用花青素組和分別選用100 g/L+奧沙利鉑組0.010 g/L進行后續(xù)實驗。

細胞有絲分裂是其增殖基礎，其中Ki67是一種核抗原[11]，Ki67是一種細胞核內(nèi)與細胞分裂增殖相關的蛋白抗原，其表達水平反映細胞增殖的敏感指標同時這種基因在維持結(jié)構(gòu)方面起著重要作[12]。同時Ki67對維持DNA結(jié)構(gòu)穩(wěn)定及細胞有絲分裂過程中發(fā)揮重要作用，其表達程度與腫瘤細胞的增殖活性密切相關，表達水平越高腫瘤細胞增殖能力越強[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，相比對照組，花青素組和奧沙利鉑組細胞克隆形成率、Ki67蛋白表達水平顯著降低，相比花青素組和奧沙利鉑組，聯(lián)合組細胞克隆形成率、Ki67蛋白表達水平顯著降低。說明使用花青素和奧沙利鉑均可以有效抑制人結(jié)腸癌HCT116細胞的增殖，且聯(lián)合用藥效果顯著優(yōu)于單一使用藥物。這可能是因為兩者聯(lián)合使用可以有效抑制增殖相關蛋白的表達，實現(xiàn)抑制結(jié)腸癌細胞的增殖。熊非等[14]研究表明,奧沙利鉑可以有效抑制增殖相關蛋白Ki67的表達實現(xiàn)抑制結(jié)腸癌細胞的增殖，與本研究得出的結(jié)論相一致。

圖3 花青素協(xié)同奧沙利鉑對人結(jié)腸癌HCT116細胞凋亡的影響 A:流式細胞儀檢測結(jié)腸癌細胞凋亡情況；B:凋亡相關蛋白表達情況；與對照組相比,**P<0.01；與花青素組或奧沙利鉑組相比,##P<0.01

圖4 花青素協(xié)同奧沙利鉑對人結(jié)腸癌HCT116細胞TGF-βsmad信號通路的影響 與對照組相比,**P<0.01；與花青素組或奧沙利鉑組相比,##P<0.01

激活細胞的凋亡途徑是抑制腫瘤細胞增殖的有效途徑之一，細胞凋亡指細胞為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的有序死亡過程，而腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程往往伴隨有細胞凋亡抑制的情況[15]。Bcl-2家族也是一種常見的凋亡控制基因，其中主要的基因包括Bcl-2和Bax，Bcl-2是抑凋亡基因，Bax是促凋亡基因[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，相比花青素組和奧沙利鉑組，聯(lián)合組細胞人結(jié)腸癌HCT116細胞凋亡率、Bax蛋白性對表達顯著升高，Bcl-2蛋白相對表達顯著降低。說明使用花青素組和奧沙利鉑可以顯著促進人結(jié)腸癌HCT116細胞的凋亡，且兩種藥物聯(lián)合使用效果更好。張瑩等[17]研究表明,奧沙利鉑可以有效提高結(jié)腸癌細胞相關凋亡基因Bax的表達，抑制抑凋亡基因Bcl-2的表達，促進其凋亡與本研究得出的結(jié)論相一致。

Smads家族蛋白是一種可以參與TGF-β家族在細胞內(nèi)信號傳導的一種蛋白質(zhì)[18]。這種蛋白為受體激活型蛋白，當Smads2/3與TGF-β的Ⅰ型受體結(jié)合形成受體復合物，會在磷酸化后從受體復合物上釋放出來，與胞漿內(nèi)的smad4結(jié)合形成低聚體復合物，轉(zhuǎn)移到細胞核內(nèi)激活相應啟動子的活性介導細胞的凋亡[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，相比對照組和單一用藥的兩組，聯(lián)合組p-Smad2、p-Smad3、Smad2、Smad3、TGF蛋白相對表達水平顯著升高[19]。說明使用花青素組和奧沙利鉑可以促進TGF-β/Smad信號通路，且兩種藥物聯(lián)合使用效果更好。李素云等[20]研究表明，通過調(diào)控結(jié)腸癌細胞TGF-β/Smad信號通路相關蛋白的表達可以有效抑制結(jié)腸癌細胞的惡性生物學特征，與本研究得出的結(jié)論相一致。

綜上所述花青素協(xié)同奧沙利鉑可以促進人結(jié)腸癌HCT116細胞的凋亡并抑制其增殖，且作用效果顯著優(yōu)于使用單一藥物，其作用機制可能是通過調(diào)節(jié)TGF-β/Smad信號通路實現(xiàn)，但本研究涉及到聯(lián)合用藥的濃度梯度較少，在后續(xù)的實驗中將進一步增加不同的濃度梯度進行實驗。