李成軍，董梅，任法新

心肌細(xì)胞凋亡在急性心肌梗死（AMI）心肌損傷的病理演變過程中占有重要地位，有效抑制急性心肌缺血后的心肌細(xì)胞凋亡是治療的主要策略[1]。抑制心肌細(xì)胞凋亡還可緩解心肌損傷、促進(jìn)心臟功能恢復(fù)，利于患者的長期預(yù)后。傷害性信息與即刻早期基因（immediate early gene，c-fos）蛋白在受到外界刺激后會發(fā)生過表達(dá)，并通過與JUN/AP-1轉(zhuǎn)錄因子形成緊密但非共價連接的復(fù)合物調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄，研究顯示在AMI后c-fos水平顯著升高，與心肌損傷有關(guān)[2]。白藜蘆醇（RSV）從葡萄皮/種子、虎杖根等中藥中提取出一種多酚類化合物，具有強(qiáng)大的抗氧化作用，RSV具有保護(hù)大鼠心血管功能的作用[3]。本文主要分析RSV通過c-fos通路對AMI大鼠心肌損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗動物、試劑和材料SPF級的SD大鼠（雄性，220～250 g，南京金陵醫(yī)院）。蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒、酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒、TUNEL凋亡試劑盒（碧云天公司，中國）。酶標(biāo)儀（Model 680，Bio-Rad，美國）。RIPA裂解緩沖液（Beyotime，北京）。BCA蛋白測定試劑盒（北京Applygen公司）。ECL試劑盒（Amersham，美國）?？贵w（Abcam公司，美國）。PVDF膜（Bio-Rad公司，美國）。小動物超聲成像儀（麟得科學(xué)儀器有限公司，中國）。BX-42光學(xué)顯微鏡（Olympus Corporation，日本）。

1.2 動物分組、建模和干預(yù)48只SD大鼠隨機(jī)分為3組（n=16）：Sham組、AMI組和AMI+RSV組。AMI組和AMI+RSV組大鼠根據(jù)參考文獻(xiàn)方法[4]建立AMI模型，建模方法：大鼠腹腔注射1%戊巴比妥（劑量為3 ml/kg）麻醉后，連接心電圖，常規(guī)剪開胸腔暴露心臟，使用6/0線在左心耳下約2 mm處的冠狀動脈（冠脈）前降支結(jié)扎，結(jié)扎成功后大鼠心電圖顯示QRS波增寬，結(jié)扎30 min后取出絲線再灌注，縫合胸腔，術(shù)后護(hù)理包括注射80 000單位青霉素抗感染2/d，連續(xù)3 d。Sham組打開胸腔但不結(jié)扎，縫合胸腔后注射青霉素。建模后AMI+RSV組大鼠使用RSV灌胃干預(yù)，劑量為10 mg·kg/d，1/d，連續(xù)7 d，第8 d行后續(xù)檢測。以灌胃等劑量生理鹽水作為對照。

1.3 觀察指標(biāo)及方法

1.3.1 大鼠心功能指標(biāo)檢測通過腹腔注射1%戊巴比妥（劑量為3 ml/kg），連接超聲成像儀行心臟超聲，根據(jù)儀器說明書檢測左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）及左室內(nèi)壓力最大變化率（±dp/dtmax）。

1.3.2 心肌損傷標(biāo)志物大鼠麻醉后處死，將血樣2000 rpm下離心20 min取上清液，使用ELISA試劑盒檢測肌酸激酶（CK-MB）和乳酸脫氫酶（LDH），加入抗體后通過酶標(biāo)儀檢測吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算CK-MB和LDH濃度。

1.3.3 HE染色將心肌組織經(jīng)過梯度酒精脫水、透明處理后包埋至蠟塊中，冷凍后切成4 μm厚切片。將組織脫蠟并水化，用3%過氧化氫甲醇溶液封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性。使用蒸鍋在95℃下于0.01 M檸檬酸鹽緩沖液（PH=6.0）中對切片進(jìn)行熱誘導(dǎo)的抗原回收。通過HE染色試劑盒加入蘇木紫和伊紅染料染色觀察心肌組織病變情況。

1.3.4 TUNEL染色通過TUNEL凋亡試劑盒檢測心肌細(xì)胞凋亡率。將心臟固定后切片，加入試劑。顯微鏡下觀察凋亡情況，凋亡率=（綠色熒光陽性細(xì)胞/視野中總細(xì)胞×100%）。

1.3.5 Western blot通過Western blot檢測心肌組織中p-ERK、ERK和c-fos蛋白水平，將組織在液氮下研磨后通過RIPA試劑裂解，應(yīng)用BCA法測量總蛋白含量。通過SDS-PAGE分離等量的總蛋白（120 V下電泳90 min），轉(zhuǎn)移到PVDF膜上（50 V，120 min），在5%脫脂牛奶的封閉溶液中封閉。將PDVF膜與anti-p-ERK、anti-ERK和anti-c-fos（1：500稀釋），4℃孵育過夜，加入1：5000稀釋的HRP偶聯(lián)二抗在室溫下孵育1 h。使用ECL試劑盒可視化蛋白條帶，GAPDH作為內(nèi)參，使用ImagePD軟件對蛋白條帶的灰度進(jìn)行定量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理所有實驗設(shè)立3個復(fù)孔。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）表示。統(tǒng)計分析使用SPSS 19.0軟件，進(jìn)行單因素方差分析，兩兩比較使用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠LVEF和±dp/dtmax水平比較AMI組大鼠LVEF、±dp/dtmax水平顯著低于Sham組（P＜0.05），AMI+RSV組LVEF、±dp/dtmax水平顯著高于AMI組（P＜0.05）（表1）。

表1 各組大鼠LVEF和±dp/dtmax比較

2.2 各組大鼠心肌損傷標(biāo)志物水平比較AMI組CKMB（107.54±13.62 kU/L）和LDH（131.28±18.64 kU/L）水平顯著高于Sham組（33.68±5.41 U/L，67.46±9.04 kU/L）（P＜0.05）。AMI+RSV組CKMB（74.22±10.38 kU/L）和LDH（98.76±15.93 kU/L）顯著低于AMI組（P＜0.05）（表2）。

2.3 心肌HE染色結(jié)果Sham組心肌細(xì)胞形態(tài)正常、排解緊密。AMI組心肌細(xì)胞形狀發(fā)生改變，出現(xiàn)炎性浸潤和細(xì)胞丟失。AMI+RSV組心肌細(xì)胞形態(tài)和排列恢復(fù)，細(xì)胞丟失顯著減少（圖1）。

2.4 各組心肌細(xì)胞凋亡情況比較如圖2所示，藍(lán)色為細(xì)胞核染色，棕色染色為凋亡細(xì)胞，AMI組的凋亡率（38.75%±4.36%）顯著高于Sham組（4.54%±0.58%）（P＜0.05），AMI+RSV組心肌細(xì)胞凋亡率（19.67%±4.18%）顯著低于AMI組（P＜0.05）。

表2 各組CK-MB和LDH水平比較（kU/L）

圖1 HE染色檢測心肌組織損傷情況（×200）

圖2 TUNEL染色檢測心肌細(xì)胞凋亡情況（×200）

2.5 各組c-fos通路水平比較與Sham組比較，AMI組p-ERK/ERK和c-fos蛋白水平顯著升高（P＜0.05），AMI+RSV組p-ERK/ERK和c-fos蛋白水平顯著低于AMI組（P＜0.05）（表3、圖3）。

表3 各組p-ERK/ERK和c-fos蛋白水平比較

圖3 Western blot檢測p-ERK/ERK和c-fos蛋白水平

3 討論

AMI會引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致活性氧的產(chǎn)生增加以及有害細(xì)胞信號的激活，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞中促炎細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞向梗塞區(qū)域浸潤，引起心肌細(xì)胞損傷[5]，中藥在AMI治療中取得了一定進(jìn)展。RSV主要從毛葉藜蘆根和葡萄葉中分離得到，是一種非黃酮類多酚化合物，具有抗血小板、抗氧化應(yīng)激、抗凋亡和抗炎作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)RSV具有保護(hù)心肌細(xì)胞改善心臟功能的作用[6]。本研究發(fā)現(xiàn)使用RSV干預(yù)的大鼠細(xì)胞形態(tài)和排列恢復(fù)，血清中CK-MB、LDH水平和心功能指標(biāo)均顯著改善。說明RSV可保護(hù)心肌細(xì)胞損傷，改善AMI后大鼠心功能。最近研究發(fā)現(xiàn)RSV可促進(jìn)AMI大鼠心臟神經(jīng)重塑，改善心功能[7]。且通過調(diào)節(jié)心肌縫隙連接蛋白43改善AMI后心律失常[8]。Cheng等[9]發(fā)現(xiàn)RSV可通過調(diào)節(jié)Nrf2 / ARE途徑減輕心肌缺血再灌注損傷所致的炎癥和氧化應(yīng)激，這些均提示RSV具有緩解AMI后心肌損傷和保護(hù)心功能的作用，但具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

在急性缺血階段，心肌細(xì)胞死亡是心功能損傷和丟失的重要原因，并且是梗死面積的主要決定因素[10，11]。抑制心肌梗死后心肌細(xì)胞凋亡是緩解心肌損傷和保護(hù)心功能的重要方法[12]。本研究結(jié)果顯示在AMI建模7 d后，心肌細(xì)胞凋亡顯著增多，而RSV可緩解心肌細(xì)胞的凋亡。心肌細(xì)胞凋亡受到多種通路的調(diào)節(jié)，在AMI后，ERK/c-fos的激活會引起炎性反應(yīng)，損傷心肌細(xì)胞；同時炎性反應(yīng)進(jìn)一步引起心肌細(xì)胞凋亡，加重心功能損傷[13]。而抑制c-fos相關(guān)通路會緩解凋亡[14]。本結(jié)果顯示AMI大鼠心肌細(xì)胞凋亡水平及p-ERK/ERK和c-f蛋白水平均顯著升高，而使用RSV干預(yù)后明顯減少凋亡并抑制c-fos相關(guān)通路。Lu等[15]研究發(fā)現(xiàn)RSV具有抑制凋亡緩解氧化應(yīng)激損傷的作用。此外，也有研究顯示RSV具有抑制ERK/c-fos通路的作用[16]。Thiel等[17]研究結(jié)果顯示RSV通過調(diào)節(jié)ERK通路調(diào)控c-fos表達(dá)。提示RSV可通過調(diào)節(jié)c-fos相關(guān)通路抑制凋亡。

綜上所述，RSV通過調(diào)節(jié)c-fos通路抑制AMI模型大鼠的心肌細(xì)胞凋亡，緩解心肌細(xì)胞損傷并發(fā)揮保護(hù)AMI后心功能的作用。關(guān)于RSV調(diào)節(jié)c-fos通路和調(diào)控心肌細(xì)胞凋亡的相關(guān)機(jī)制需進(jìn)一步研究。