楊紅梅，許 飛，鄭皆煒，向 東，虞 茜，曹鎖春△

1．江蘇省常州市中心血站，江蘇常州 213004；2.上海市血液中心，上海 200050

不規(guī)則抗體是指除抗-A、抗-B紅細(xì)胞以外的血型抗體。不規(guī)則抗體是導(dǎo)致溶血性輸血反應(yīng)、新生兒溶血病、疑難配血及血型鑒定困難的主要原因[1-2]。對(duì)獻(xiàn)血員和患者進(jìn)行抗體篩選，可避免因?yàn)檎也坏较嗪系难航o患者而延誤治療，因此抗體篩查試驗(yàn)在臨床配血中非常重要。引起臨床疑難交叉配血最常見(jiàn)的抗體是Rh血型系統(tǒng)的相關(guān)不規(guī)則抗體，該系統(tǒng)不規(guī)則抗體可單獨(dú)存在，也可以聯(lián)合其他抗體的形式存在。本實(shí)驗(yàn)室在工作中發(fā)現(xiàn)1例抗-E合并抗-Dia引起的交叉配血不合，現(xiàn)將試驗(yàn)分析過(guò)程報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 患者韓某，女，30歲，因“月經(jīng)量多10余年，彩超發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜增厚等”經(jīng)門(mén)診收入院，既往有妊娠史、流產(chǎn)史，抗體篩查陽(yáng)性，特需配懸浮紅細(xì)胞4個(gè)單位而送常州市中心血站輸血研究室進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。

1.2試劑與儀器 抗-A/B單克隆抗體(上海血液生物，批號(hào)：20180818)；抗-D(IgM)單克隆抗體(北京金豪，批號(hào)：2018110104)；ABO血型反定型紅細(xì)胞(北京金豪，批號(hào)：20190601013)；進(jìn)口譜細(xì)胞(匈牙利，批號(hào)：731911)；進(jìn)口譜細(xì)胞(Sanquin，批號(hào)：8000257144)；國(guó)產(chǎn)譜細(xì)胞(上海血液生物，批號(hào)：20190530)；抗人球蛋白試劑(上海血液生物，批號(hào)：20185001);抗-IgG(上海血液生物，批號(hào)：20185102);抗-C3d(上海血液生物，批號(hào)：20185202);抗-Dia(CE公司，批號(hào)：MDiaM024);抗-C(上海血液生物，批號(hào)：20183003)；抗-c(上海血液生物，批號(hào)：20183102)；抗-E(上海血液生物，批號(hào)：20193201)；抗-e(上海血液生物，批號(hào)：20183301)；抗體篩選細(xì)胞(上海血液生物，批號(hào)：20197026)。聚凝胺試劑由臺(tái)灣貝索企業(yè)有限公司提供。久保田KA-2200血清學(xué)專(zhuān)用離心機(jī)；37 ℃恒溫水浴箱；盧湘儀TD4低速自動(dòng)平衡離心機(jī)；博訊抗人球蛋白卡。

1.3試管法鑒定 ABO正反定型、Coombs試驗(yàn)、抗體鑒定、交叉配血及微柱法進(jìn)行抗體特異性鑒定及交叉配血。所有試驗(yàn)均嚴(yán)格按照文獻(xiàn)[3]的方法和試劑操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

2 結(jié) 果

2.1血型鑒定(試管法) ABO正反定型結(jié)果見(jiàn)表1，血型為A型。

表1 患者ABO正反定型結(jié)果

注：4+表示凝集強(qiáng)度；0表示陰性。

2.2抗體篩選(試管法) 醫(yī)院送檢單顯示抗體篩選試驗(yàn)陽(yáng)性，提示有不規(guī)則抗體存在。筆者進(jìn)一步做不規(guī)則抗體篩查發(fā)現(xiàn)篩選Ⅰ、Ⅲ細(xì)胞在鹽水介質(zhì)中無(wú)凝集，在聚凝胺和抗人球蛋白介質(zhì)中均凝集，結(jié)果見(jiàn)表2，其中在聚凝胺介質(zhì)下的凝集強(qiáng)度達(dá)到2+，提示該抗體對(duì)聚凝胺介質(zhì)敏感。

表2 患者血清與抗篩細(xì)胞反應(yīng)格局與結(jié)果(批號(hào)：20197026)

注：+表示極小的細(xì)胞凝集混合眾多游離紅細(xì)胞；0表示陰性；1+、2+表示凝集強(qiáng)度。

2.3鑒定抗體其特異性(試管法——抗人球蛋白和聚凝胺介質(zhì)) 從篩選試驗(yàn)格局中初步推斷血清中存在Rh系統(tǒng)血型抗體，進(jìn)一步鑒定抗體特異性。國(guó)產(chǎn)譜細(xì)胞和進(jìn)口譜細(xì)胞在鹽水介質(zhì)均出現(xiàn)凝集。進(jìn)口譜細(xì)胞在聚凝胺介質(zhì)2、4、9號(hào)出現(xiàn)凝集，在抗人球蛋白介質(zhì)中2、4、7、9號(hào)出現(xiàn)凝集。國(guó)產(chǎn)譜細(xì)胞在聚凝胺介質(zhì)2、4、5、6號(hào)出現(xiàn)凝集，在抗人球蛋白介質(zhì)中2、3、4、5、6號(hào)出現(xiàn)凝集。對(duì)照進(jìn)口譜細(xì)胞格局表和國(guó)產(chǎn)譜細(xì)胞初步判斷為抗-E合并抗-Dia不能排除抗-Cw；試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3、4。進(jìn)一步做Rh系統(tǒng)和Diego系統(tǒng)抗原表型分型試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表5。該患者Rh分型為CCee，Diego系統(tǒng)分型為Di(a-)，與血清中相應(yīng)抗體基本吻合，仍需采用吸收放散試驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步排除是否存在抗-Cw。

表3 患者血清與進(jìn)口譜細(xì)胞反應(yīng)格局及結(jié)果(REAGENS，批號(hào)：731911)

注：+表示極小的細(xì)胞凝集混合眾多游離紅細(xì)胞；0表示陰性；1+、2+表示凝集強(qiáng)度；s表示稍強(qiáng)；w表示稍弱。

表4 患者血清與國(guó)產(chǎn)譜細(xì)胞反應(yīng)格局及結(jié)果(批號(hào)：20190530)

注：+表示極小的細(xì)胞凝集混合眾多游離紅細(xì)胞；0表示陰性；/表示未檢測(cè)；1+表示凝集強(qiáng)度；s表示稍強(qiáng)；w表示稍弱。

表5 患者Rh抗原分型和Diego抗原分型結(jié)果

注：1+、2+、3+、4+表示凝集強(qiáng)度；0表示陰性。陽(yáng)性對(duì)照S3細(xì)胞為篩選細(xì)胞中的Ⅲ號(hào)細(xì)胞；Diego系統(tǒng)陽(yáng)性對(duì)照細(xì)胞為國(guó)產(chǎn)譜細(xì)胞3號(hào)細(xì)胞。

2.4吸收放散試驗(yàn) 該患者Rh基因分型為CCDee，Diego系統(tǒng)分型為Di(a-)。不同血型系統(tǒng)抗體在譜細(xì)胞試驗(yàn)中可能會(huì)有干擾而影響反應(yīng)格局，為了進(jìn)一步確定抗體特異性，于是對(duì)患者標(biāo)本進(jìn)行吸收放散試驗(yàn)，挑選E抗原陽(yáng)性、Dia抗原陰性的細(xì)胞混合液(進(jìn)口譜細(xì)胞2號(hào)和4號(hào))與患者血清采用熱吸收酸放散方法(37 ℃ 30 min),將放散液與吸收后的血清進(jìn)一步進(jìn)行譜細(xì)胞試驗(yàn)，見(jiàn)表6，試驗(yàn)結(jié)果表明患者血清中確實(shí)存在抗-E和抗-Dia。為排除抗-Cw，選擇了Sanquin譜細(xì)胞中的1、2、6號(hào)細(xì)胞檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)1、2號(hào)譜細(xì)胞均為陰性，6號(hào)陽(yáng)性；說(shuō)明血清中未檢出抗-Cw，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表7。

2.5抗-Dia和抗-E效價(jià)測(cè)定 采用試管法對(duì)血清倍比稀釋(準(zhǔn)備2排試管)，第1管血清50 μL，第2管為血清50 μL與50 μL生理鹽水混合液，將第2管中的50 μL混合液移置第3管，以此類(lèi)推。第1排試管效價(jià)測(cè)定所用細(xì)胞為進(jìn)口譜細(xì)胞7號(hào)與國(guó)產(chǎn)譜細(xì)胞3號(hào)細(xì)胞混合液；第2排效價(jià)測(cè)定所用細(xì)胞為進(jìn)口譜細(xì)胞2號(hào)與國(guó)產(chǎn)譜細(xì)胞4號(hào)細(xì)胞混合液。向相應(yīng)的試管中加入混合細(xì)胞量50 μL，整個(gè)體系為100 μL，分別做室溫、37 ℃抗人球蛋白介質(zhì)下抗-E和抗-Dia的抗體效價(jià)。結(jié)果在抗人球蛋白介質(zhì)中抗-E、抗-Dia效價(jià)分別為2、4；試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表8。本實(shí)驗(yàn)室以出現(xiàn)±的最高稀釋倍數(shù)為最終效價(jià)。

表6 吸收放散譜細(xì)胞試驗(yàn)結(jié)果(進(jìn)口譜2號(hào)和4號(hào))

注：0表示陰性；1+、2+表示凝集強(qiáng)度；w表示稍弱。

表7 患者血清與部分譜細(xì)胞反應(yīng)結(jié)果

注：+表示極小的細(xì)胞凝集混合眾多游離紅細(xì)胞；0表示陰性；/表示未檢測(cè)；1+表示凝集強(qiáng)度。

表8 抗-E和抗-Dia效價(jià)測(cè)定

注：J7+G3為匈牙利譜7號(hào)+國(guó)產(chǎn)譜細(xì)胞3號(hào)紅細(xì)胞混合液；G4+J2為國(guó)產(chǎn)譜細(xì)胞4號(hào)與匈牙利譜2號(hào)紅細(xì)胞混合液；0表示陰性；±表示弱陽(yáng)性；1+、2+表示凝集強(qiáng)度；w表示稍弱。

2.6交叉配血試驗(yàn) 根據(jù)疑難配血申請(qǐng)單篩選2袋獻(xiàn)血者條碼為9001819233675/9001819233675、A型、RhD陽(yáng)性、其他血型為“CCee且Di(a-)”的血樣做主次側(cè)交叉配血試驗(yàn)，在鹽水、聚凝胺、抗人球蛋白3種介質(zhì)中均無(wú)凝集、無(wú)溶血，可輸注上述懸浮紅細(xì)胞4個(gè)單位。跟蹤該患者，血紅蛋白上升了25 g/L左右，輸血效果良好。

3 討 論

臨床上交叉配血不合的原因眾多，在進(jìn)行血液篩查的每個(gè)環(huán)節(jié)都可能導(dǎo)致配血不合。在輸血前的血液檢測(cè)中，不規(guī)則抗體篩選陽(yáng)性是導(dǎo)致不合的常見(jiàn)現(xiàn)象。Rh血型系統(tǒng)在輸血工作中的重要性?xún)H次于ABO血型系統(tǒng)。當(dāng)抗體性質(zhì)為IgG類(lèi)，優(yōu)先考慮Rh血型系統(tǒng)抗體，這是因?yàn)镽h血型系統(tǒng)抗原性強(qiáng)度僅次于ABO血型系統(tǒng)?？?E是RhD陽(yáng)性者最易產(chǎn)生的抗體，往往抗-c會(huì)伴隨著抗-E同時(shí)出現(xiàn)。該患者Rh抗原分型為CCDee，缺乏E和c抗原，妊娠、流產(chǎn)等過(guò)程受免疫刺激導(dǎo)致產(chǎn)生了免疫性抗-E和抗-c，當(dāng)再次輸血時(shí)就可能會(huì)出現(xiàn)交叉配血不合[4-6]。Diego血型系統(tǒng)包含21個(gè)抗原，其中Dia和Dib、Wra和Wrb兩對(duì)等位基因是最具有臨床意義的抗原[7]。在Diego血型系統(tǒng)中，Dia抗原是相對(duì)低頻抗原，Dib抗原是相對(duì)高頻抗原。有文獻(xiàn)報(bào)道中國(guó)漢族Dia抗原頻率約為10%且大多數(shù)人表型為Di(a-b+)。Diego血型抗體都是免疫產(chǎn)生，屬于IgG性質(zhì)，只能借助抗人球蛋白介質(zhì)試驗(yàn)才能檢出，酶法和補(bǔ)體均不能增強(qiáng)反應(yīng)；一般抗-Dia引起的輸血反應(yīng)多為遲發(fā)型和溫和型。本案例在試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，抗-Dia在聚凝胺介質(zhì)中未見(jiàn)凝集，抗人球蛋白介質(zhì)中出現(xiàn)2+凝集強(qiáng)度；而抗-E在聚凝胺介質(zhì)中格局清晰。當(dāng)血清中出現(xiàn)Diego血型抗體時(shí)，往往會(huì)伴隨1種或2種以上的抗體，此時(shí)混合抗體使得紅細(xì)胞破壞程度增加，導(dǎo)致出現(xiàn)溶血性輸血反應(yīng)臨床癥狀。因此應(yīng)根據(jù)抗體性質(zhì)采用靈敏度和特異度相適宜的檢測(cè)方法，對(duì)于兩種及以上的混合抗體要結(jié)合吸收放散試驗(yàn)等方法鑒定清楚以確保結(jié)果準(zhǔn)確、快速，最大限度避免輸血反應(yīng)，保障臨床輸血安全。不規(guī)則抗體陽(yáng)性的患者一旦輸注含有相應(yīng)抗原的紅細(xì)胞，抗原抗體在補(bǔ)體的參與下發(fā)生免疫反應(yīng)，導(dǎo)致輸注的紅細(xì)胞溶解破壞，嚴(yán)重時(shí)甚至危及生命。因此輸血前應(yīng)盡可能了解患者輸血史、妊娠史、用藥史，及時(shí)發(fā)現(xiàn)有臨床意義的抗體，以選擇其抗原陰性的血液，保證輸血安全有效[8-10]。

(志謝：在此感謝上海市血液中心血型參比實(shí)驗(yàn)室老師們的遠(yuǎn)程指導(dǎo)！)