杜喜風(fēng)， 胡志輝， 景敏潔， 王雅婷， 蘭麗珍

（山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，山西太原030001）

甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是最常見的內(nèi)分泌惡性腫瘤，且近年來其發(fā)病率呈逐年上升趨勢。約有10%～15%的PTC患者常出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，導(dǎo)致其標(biāo)準(zhǔn)治療的效果較差，預(yù)后不佳［1］。因此，研究PTC形成和發(fā)展的分子機制是十分必要的，對尋找PTC治療新藥，提高PTC患者的預(yù)后具有重要意義。

微小RNA（microRNA，miRNA，miR）是一類廣泛存在于真核細(xì)胞中由基因組編碼的長度約22個核苷酸的小型非編碼RNA，通過和靶基因mRNA堿基完全或不完全配對進而誘導(dǎo)沉默復(fù)合體降解mRNA或阻礙其翻譯，進而調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化、增殖和代謝等基本的生理過程［2］。大量研究已經(jīng)證實，異常表達的 miRNA 如 miR-105［3］、miR-300［4］等能夠從轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控各種致癌或抑癌基因的表達，從而調(diào)控多種惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。近期研究發(fā)現(xiàn)，miR-206 在多種癌癥中如乳腺癌［5］、肝癌［6］、胃癌［7］、喉癌［8］等有異常表達，表明它與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。Liu等［9］研究發(fā)現(xiàn)，miR-206的表達量在PTC組織中較正常組織中低。但miR-206對PTC具體生物功能及機制尚未闡明。

肝細(xì)胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）的受體c-Met是原癌基因編碼的一種190 kD的蛋白，是具有確定的致癌特性的受體酪氨酸激酶，在正常細(xì)胞發(fā)育和腫瘤發(fā)生中起重要作用。c-Met與HGF結(jié)合后，引起受體酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的自磷酸化，激活蛋白激酶，導(dǎo)致酪氨酸殘基磷酸化并激活PI3K/Akt/mTOR通路［10］。異常激活的c-Met/Akt/mTOR信號通路與甲狀腺癌、宮頸癌等多種惡性細(xì)胞的增殖和遷移密切相關(guān)［11-12］。然而，在PTC中，miR-206能否通過抑制c-Met/Akt/mTOR信號通路而發(fā)揮抑癌作用，鮮有相關(guān)報道。本研究旨在研究miR-206過表達對PTC細(xì)胞增殖和遷移的影響并探索其可能的機制，為PTC臨床靶向治療篩選新的分子干預(yù)靶點。

材料和方法

1 主要試劑

人甲狀腺乳頭狀癌K1細(xì)胞株購自歐洲細(xì)胞培養(yǎng)中心。DMEM/F12培養(yǎng)液購自HyClone；澳洲胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自 CellMax；LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen；TRIzol試劑購自北京聚合美生物科技有限公司；CCK-8和BCA蛋白濃度測定試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司；Transwell小室購自Corning；hsa-miR-206模擬物（hsa-miR-206 mimic）和陰性對照無關(guān)序列均購自上海吉瑪基因；反轉(zhuǎn)錄試劑盒All-in-OneTMmiRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit購自GeneCopoeia；實時熒光定量PCR試劑盒ChamQTMUniversal SYBR?qPCR Master Mix購自南京諾唯贊生物科技有限公司；雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒購自Promega；抗 c-Met、p-Met、AKT、p-AKT、mTOR、pmTOR和β-actin抗體均購自上海生工。

2 主要方法

2.1 K1細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 K1細(xì)胞用含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。將實驗分為3組，即空白（blank）組（未行任何轉(zhuǎn)染）、陰性對照（miR-NC）組（轉(zhuǎn)染陰性對照序列miR-NC）和實驗組（miR-206 mimic組；轉(zhuǎn)染miR-206 mimic）。在轉(zhuǎn)染前1 d，對細(xì)胞株進行傳代，且更換為無雙抗的培養(yǎng)基，計數(shù)9.0×105個K1細(xì)胞均勻接種于6孔板中培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合度約70%時，再行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。按照LipofectamineTM3000使用說明書，吸取miR-206 mimic和miR-NC（濃度均為50μmol/L）各4μL，溶解于100 μL Opti-MEM培養(yǎng)液為A液，同時吸取LipofectamineTM3000試劑4μL，溶解于100μL Opti-MEM培養(yǎng)液為B液，均靜置5 min。A液和B液混合，室溫靜置20 min后加入細(xì)胞培養(yǎng)板中，總體積為2 mL。于37℃、含5%CO2的孵箱中培養(yǎng)6 h后，更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞進行后續(xù)實驗。

2.2 RT-qPCR實驗 采用TRIzol法提取上述各組細(xì)胞的總RNA，測定RNA的濃度及純度后，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒All-in-OneTMmiRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以此cDNA為模板，采用RT-qPCR試劑盒進行實時熒光定量PCR以檢測miR-206表達量。引物均購自上海生工。miR-206的上游引物序列為5′-TGGAATGTAAGGAAGTGTGTGG-3′，下 游 引 物 序 列 為 5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′；內(nèi)參照U6的上游引物序列 為 5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，下游引物序列為 5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′。反應(yīng)體系包括：Universal SYBR?qPCR Master Mix試劑10μL，模板cDNA 2μL，上、下游引物（濃度均為10 μmol/L）各0.4μL，無RNA酶的雙蒸水7.2μL。擴增反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30 s；95℃10 s，60℃30 s，共40個循環(huán)。結(jié)果得出Ct值，采用2-ΔΔCt法計算各組miR-206的相對表達水平，以檢驗轉(zhuǎn)染效果。

2.3 CCK-8和活細(xì)胞計數(shù)實驗檢測細(xì)胞的增殖能力 將轉(zhuǎn)染24 h后的各組K1細(xì)胞分別接種于96孔板，細(xì)胞密度為每孔3×103個，每孔100μL，每組設(shè)3個重復(fù)孔。分別將細(xì)胞培養(yǎng)0、24、48和72 h后，終止培養(yǎng)；向各孔中加入10μL CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)1 h。用酶標(biāo)儀檢測各孔在波長450 nm處的吸光度（A450）。以時間為橫坐標(biāo)，A450值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長曲線。實驗重復(fù)3次。用0.04%臺盼藍對各組消化后的細(xì)胞染色，進行活細(xì)胞計數(shù)（活細(xì)胞數(shù)=總細(xì)胞數(shù)-著色的死細(xì)胞數(shù)），每個樣品計數(shù)3次。

2.4 Transwell實驗檢測細(xì)胞遷移能力 收集上述轉(zhuǎn)染后處于對數(shù)生長期的各組K1細(xì)胞，計數(shù)2×104個細(xì)胞，用200μL無血清培養(yǎng)基重懸，加入Transwell細(xì)胞培養(yǎng)板的小室上室，下室加入500μL含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液。每組設(shè)3個復(fù)孔。在37℃、含5%CO2的孵箱中孵育24 h后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕拭去微孔膜上層的細(xì)胞，用4%多聚甲醛溶液固定下層細(xì)胞20 min，PBS洗3次；再用0.1%結(jié)晶紫染色液室溫染色10 min，PBS洗3次；小室干燥后置于光學(xué)顯微鏡下觀察，隨機選取5個視野拍照、計數(shù)穿膜細(xì)胞。以穿膜細(xì)胞的相對數(shù)目表示腫瘤細(xì)胞的遷移能力。實驗重復(fù)3次。

2.5 雙螢光素酶報告基因?qū)嶒灆z測miR-206對c-Met基因的靶向作用 用TargetScan 7.1（www.targetscan.org/vert_71/）預(yù)測 miR-206 與其靶基因 3′端非翻譯區(qū)（3′-untranslated region，3′UTR）的結(jié)合位點。通過GenePharma合成野生型（pGL3-c-Met-3′UTR WT）和突變型（pGL3-c-Met-3′UTR MUT）c-Met螢光素酶報告載體。將K1細(xì)胞接種在24孔板中培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞密度約90%時，使用LipofectamineTM3000將 pGL3-c-Met-3′UTR WT 或 pGL3-c-Met-3′UTR MUT與miR-206 mimic或miR-NC共同轉(zhuǎn)染至K1細(xì)胞，每組設(shè)3個復(fù)孔，轉(zhuǎn)染48 h后，按雙螢光素酶活性檢測試劑盒說明書提供的方法，在單光子檢測儀上檢測，計算相對螢光素酶活性。相對螢光素酶活性=螢火蟲螢光素酶活性值/海腎螢光素酶活性值。實驗重復(fù)3次。

2.6 Western blot檢測相關(guān)蛋白的表達水平 收集轉(zhuǎn)染48 h后對數(shù)生長期的各組K1細(xì)胞，用RIPA蛋白裂解液抽提細(xì)胞全蛋白，冰上靜置30 min，離心后取上清液。BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。將SDS-PAGE分離后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)到聚偏二氟乙烯膜上。使用含5%脫脂奶粉和Tween 20的磷酸鹽緩沖液室溫封閉，分別加入對應(yīng)I抗，4℃過夜孵育；加入HRP標(biāo)記的II抗。采用增強化學(xué)發(fā)光法通過Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)成像，采用Quantity One分析軟件測定目的蛋白與相應(yīng)內(nèi)參照（β-actin）的灰度值，取其比值即為目的蛋白的相對表達量。實驗重復(fù)3次。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS23.0進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 轉(zhuǎn)染后實驗組K1細(xì)胞中miR-206的相對表達量升高

K1細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染miR-206 mimic后，RT-qPCR結(jié)果顯示，與空白組和陰性對照組相比較，實驗組miR-206的相對表達量顯著升高（P＜0.01），見圖1。

Figure 1.The expression level of miR-206 in the PTC K1 cells transfected with miR-206 mimic.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs blank group or miR-NCgroup.圖1 miR-206在甲狀腺乳頭狀癌K 1細(xì)胞中的表達水平

2 過表達miR-206抑制K1細(xì)胞的增殖能力

CCK-8實驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-206 mimic的實驗組中K1細(xì)胞的活力較空白組和陰性對照組明顯受到抑制（P＜0.01），見圖2A。在活細(xì)胞計數(shù)實驗中，實驗組存活K1細(xì)胞的數(shù)目較空白組和陰性對照組均明顯減少（P＜0.01），見圖2B。

3 過表達miR-206抑制K1細(xì)胞的遷移能力

Transwell實驗結(jié)果顯示，培養(yǎng)24 h后實驗組的遷移細(xì)胞數(shù)明顯低于空白組和陰性對照組（P＜0.01），見圖3。這表明過表達miR-206可抑制K1細(xì)胞的遷移能力。

Figure 2.The effect of miR-206 over-expression on the proliferation ability of PTCK1 cells.A：the cell viability was measured by CCK-8 assay；B：the living cell numbers were counted by the method of Trypan blue exclusion.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs blank group or miR-NCgroup.圖2 miR-206過表達對甲狀腺乳頭狀癌K 1細(xì)胞增殖能力的影響

Figure 3.The effect of miR-206 over-expression on the migration ability of PTC K1 cells（crystal violet staining，×100）.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs blank group or miR-NCgroup.圖3 miR-206過表達對甲狀腺乳頭狀癌K1細(xì)胞遷移能力的影響

4 K1細(xì)胞中miR-206靶向調(diào)控c-Met基因

通過TargetScan 7.1軟件檢索miR-206的靶基因，發(fā)現(xiàn)c-Met基因的3′UTR上存在1個潛在的miR-206結(jié)合位點，見圖4A。雙螢光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示，在K1細(xì)胞中，與空白組（0.97±0.07）和陰性對照組（0.96±0.03）相比，miR-206過表達能夠顯著抑制野生型c-Met3′UTR的相對螢光素酶活性（0.51±0.05），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；當(dāng)c-Met基因3′UTR中的miR-206結(jié)合位點發(fā)生突變后，miR-206過表達對靶基因的抑制作用消失，即miR-206 mimic轉(zhuǎn)染組的相對螢光素酶活性（0.99±0.08）與空白組和陰性對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性（P＞0.05），見圖4B。以上結(jié)果充分說明，miR-206通過與c-Met基因的3′UTR相互作用，負(fù)調(diào)控靶基因c-Met的表達。

Figure 4.c-Met gene was directly targeted by miR-206 in PTC K1 cells.A：schematic diagram of c-Met 3′UTR targeted by miR-206；B：luciferase activity of the WTc-Met 3′UTR was dramatically inhibited in miR-206 mimic group.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs blank group or miR-NCgroup.圖4 c-Met是miR-206的靶基因

5 過表達miR-206可抑制K1細(xì)胞c-Met/AKT/mTOR信號通路激活

Western blot實驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-206 mimic的K1細(xì)胞中，p-Met、p-AKT和p-mTOR的蛋白水平與空白組和陰性對照組相比均明顯降低（P＜0.01），而其總蛋白均未見明顯改變，見圖5。這提示miR-206過表達可抑制c-Met/AKT/mTOR信號通路激活，進而抑制K1細(xì)胞的增殖和遷移能力。

Figure 5.The protein levels of c-Met，p-Met，AKT，p-AKT，mTOR and p-mTOR after transfection with miR-206 mimic in PTCK1 cells.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs blank group or miR-NCgroup.圖5 轉(zhuǎn)染miR-206 mimic后，各組K1細(xì)胞中c-Met/AKT/mTOR通路相關(guān)蛋白的表達水平

討 論

甲狀腺癌是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一，女性發(fā)病率較男性高。而PTC為最常見的甲狀腺癌病理類型，約占甲狀腺癌的84%，它起源于濾泡上皮細(xì)胞，易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移［13］。miRNA是一類與惡性腫瘤密切相關(guān)的基因調(diào)控因子，且前期研究表明，多種miRNA在PTC細(xì)胞中均表達異常。miR-138-5p可能通過依賴性抑制LRRK2進而抑制PTC細(xì)胞增殖［14］；miR-497通過直接靶向調(diào)節(jié)AKT3抑制PTC細(xì)胞的活力和遷移［15］。盡管許多研究者對miRNA在PTC發(fā)生發(fā)展過程中的作用進行了大量研究，但由于其復(fù)雜性，PTC具體發(fā)病機制仍未完全闡明。

研究表明，miR-206可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等基本過程［16］。在許多人類惡性腫瘤中，miR-206發(fā)揮抑癌因子作用，例如在兒童急性髓系白血病中，miR-206通過靶向細(xì)胞周期蛋白D1發(fā)揮抑癌作用［17］；在前列腺癌細(xì)胞中，miR-206 與 ANXA2 mRNA結(jié)合可能調(diào)控EMT信號通路，從而抑制其侵襲轉(zhuǎn)移［18］。本研究通過對PTCK1細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染miR-206 mimic，發(fā)現(xiàn)實驗組miR-206的相對表達量較空白組和陰性對照組顯著升高，表明轉(zhuǎn)染成功。采用CCK-8和活細(xì)胞計數(shù)實驗檢測細(xì)胞增殖能力，以及Transwell實驗檢測細(xì)胞遷移能力，發(fā)現(xiàn)K1細(xì)胞的增殖和遷移能力均明顯受到抑制，表明miR-206可抑制甲狀腺乳頭狀癌K1細(xì)胞增殖和遷移能力。

PI3K/AKT/mTOR信號通路是膜受體信號向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要途徑之一，在細(xì)胞增殖、遷移以及凋亡等過程中發(fā)揮著重要作用［19］。c-Met與HGF相結(jié)合后，細(xì)胞內(nèi)發(fā)生自身磷酸化，可激活PI3K/AKT/mTOR信號通路，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生增殖、遷移等生物學(xué)反應(yīng)［20］。Zheng等［7］發(fā)現(xiàn) miR-206 可通過調(diào)控 c-Met基因表達，抑制胃癌細(xì)胞的增殖及遷移。在肝癌中，miR-206亦可靶向調(diào)控功能靶點c-Met和Cdk6，以介導(dǎo)其抑癌作用［21］。有研究表明，95%以上的PTC組織中發(fā)現(xiàn)c-Met蛋白高表達［22］。本研究結(jié)果顯示，在K1細(xì)胞中，miR-206通過與c-Met基因的3′UTR相互作用，進而負(fù)調(diào)控靶基因c-Met的表達；且證實過表達miR-206后，p-Met、p-AKT和p-mTOR蛋白表達水平均降低。這提示K1細(xì)胞的增殖和遷移能力受到抑制，可能是由過表達miR-206降低c-Met蛋白的表達水平，進而抑制下游AKT/mTOR信號通路的激活所致。

綜上所述，miR-206可抑制甲狀腺乳頭狀癌K1細(xì)胞的增殖和遷移能力，其作用機制可能與miR-206抑制c-Met/AKT/mTOR信號通路激活有關(guān)。這不僅為研究miR-206抑制PTC增殖和轉(zhuǎn)移的具體機制提供了新的實驗依據(jù)，而且miR-206/c-Met或可成為PTC臨床靶向治療中一個新的分子干預(yù)靶點。