蔡碧蓮，文亦磊，羅偉生

1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)(南寧 530001)；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院(南寧530023)

肝纖維化是由多種因素引起的肝細(xì)胞損傷或壞死，致使肝臟內(nèi)纖維結(jié)締組織發(fā)生異常增生，肝細(xì)胞內(nèi)外基質(zhì)異常沉積。據(jù)文獻(xiàn)記載[1]，引起肝纖維化的因素包括：肝細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)、藥物毒性損害、肝臟感染、肝臟血流異常、先天性異常和代謝障礙、膽汁流動(dòng)受阻等，這些因素均可導(dǎo)致膠原纖維合成、沉積、降解、吸收之間的動(dòng)態(tài)平衡遭到破壞，導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展。肝纖維化是各種肝病發(fā)展成肝硬化的必然經(jīng)過的病程過程。

建立高效、穩(wěn)定的動(dòng)物肝纖維化模型是進(jìn)一步開展臨床藥物研究的重要前提。本實(shí)驗(yàn)擬采用經(jīng)典皮下注射四氯化碳溶液和皮下注射四氯化碳溶液復(fù)合灌胃無水乙醇兩種復(fù)制模型進(jìn)行比較研究，探討兩種方法優(yōu)劣及造模前期和過程中的注意事項(xiàng)，為肝纖維化動(dòng)物實(shí)驗(yàn)選擇最佳造模方法提供依據(jù)，現(xiàn)總結(jié)如下。

材料與方法

1 材 料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SD大鼠30只，雄性，清潔級(jí)。體質(zhì)量80～100 g，由湖南醫(yī)科大學(xué)購(gòu)進(jìn)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(湘)2014-0011，墊料、飼料均由蘇州新區(qū)楓橋凈化設(shè)備有限公司提供，實(shí)驗(yàn)場(chǎng)所由廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。飼養(yǎng)條件：溫度23～25℃，空氣濕度50%～60%。用標(biāo)準(zhǔn)大鼠箱飼養(yǎng)，每箱5只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始造模。

1.2 主要試劑：四氯化碳[CCl4，批號(hào)：(津)XK-13-011-00034]；橄欖油；4%組織細(xì)胞固定液(批號(hào)：20190403)；水合氯醛(批號(hào)：181120)；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)測(cè)定試劑盒(批號(hào)：2001-0367)；天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)測(cè)定試劑盒(批號(hào)：2001-0367)；無水乙醇；75%醫(yī)用酒精；生理鹽水。

2 研究方法

2.1 肝纖維化模型建立：將30只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為三組：正常對(duì)照組10只、四氯化碳溶液復(fù)合乙醇組、10只四氯化碳溶液組10只。正常對(duì)照組：常規(guī)喂養(yǎng)。四氯化碳溶液復(fù)合乙醇組：用40%四氯化碳懸溶液(體積比為四氯化碳溶液∶橄欖油=2∶3)四肢皮下注射，劑量為0.3 ml/kg，2次/周，并從實(shí)驗(yàn)第2周開始經(jīng)口灌胃無水乙醇，劑量為1 ml/kg，隔天1次造模。四氯化碳溶液組：用40%四氯化碳懸溶液(體積比為四氯化碳溶液∶橄欖油=2∶3)四肢皮下注射，劑量為0.3 ml/kg，2次/周。大鼠每周稱體質(zhì)量1次，并按體質(zhì)量增長(zhǎng)而相應(yīng)調(diào)整造模藥物的劑量。

2.2 血生化檢查：造模第10周結(jié)束后，禁食24 h，腹腔注射劑量為0.3 ml/kg水合氯醛進(jìn)行麻醉，麻醉成功后立即打開腹腔，腹主動(dòng)脈采血，按照試劑盒說明書檢測(cè)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬門氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶(AST)含量。

2.3 組織染色及病理分級(jí)：肝組織標(biāo)本以4%組織細(xì)胞固定液固定、石蠟包埋，制作5 μm組織切片，進(jìn)行HE及Masson染色。顯微鏡下進(jìn)行觀察，肝纖維化病理分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參考[2]：S0級(jí)：無纖維化；S1級(jí)：部分門管區(qū)有纖維增生，有或無短的纖維隔膜；S2級(jí)：大多數(shù)門管區(qū)有纖維增生，有或無短的纖維隔膜；S3級(jí)：大多數(shù)門管區(qū)有纖維增生，偶見門管區(qū)以纖維橋連；S4級(jí)：門管區(qū)纖維橋連，同時(shí)伴有明顯的纖維橋連(門管與門管之間及門管與中心靜脈之間)；S5級(jí)：明顯的橋連[門管與門管和(或)門管與中心靜脈之間]，偶見結(jié)節(jié)(不完全硬化)；S6級(jí)：可能或明確的肝硬化。

結(jié) 果

1 大鼠一般情況 造模期間，正常對(duì)照組均表現(xiàn)活潑，毛發(fā)光澤，進(jìn)食正常，大小便正常，體質(zhì)量增長(zhǎng)速度較快；四氯化碳溶液復(fù)合乙醇組大鼠活動(dòng)度尚可，精神一般，反應(yīng)稍減弱，肌肉松弛，毛發(fā)較稀疏，食欲尚可，便少，體質(zhì)量緩慢增加；四氯化碳溶液組大鼠行為激進(jìn)，精神煩躁，毛發(fā)枯黃，食欲尚可，便少，體質(zhì)量緩慢增加。

2 不同造模方式的成功率和死亡率 各組造模大鼠均為10只，其中正常對(duì)照組、四氯化碳溶液復(fù)合乙醇組、四氯化碳溶液組造模大鼠非正常死亡分別為0只、2只及3只，死亡率分別為0%、20%、30%；各組造模周期結(jié)束后處死各組大鼠，HE及Masson染色發(fā)現(xiàn)正常對(duì)照組、四氯化碳溶液復(fù)合乙醇組、四氯化碳溶液組分別有0只、5只、3只大鼠肝組織達(dá)到了S5級(jí)以上(含S5級(jí))，成功率分別為0%、50%及30%；其中推測(cè)大鼠死亡原因是注射部位經(jīng)久不愈、潰爛、感染而亡，或大鼠之間撕咬致死。見表1。

表1 各組大鼠用藥后死亡及肝纖維化情況(只)

3 肝功能檢測(cè)結(jié)果 各組造模周期結(jié)束后，四氯化碳溶液復(fù)合乙醇組、四氯化碳溶液組大鼠血清ALT、AST的含量較正常對(duì)照組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；四氯化碳溶液復(fù)合乙醇組大鼠血清ALT、AST的含量與四氯化碳溶液組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但其含量較四氯化碳溶液組有明顯升高。見表2。

注：與正常對(duì)照組比較，*P<0.05

4 肉眼及鏡下對(duì)大鼠肝纖維化病變觀察 各組造模周期結(jié)束后，打開大鼠腹腔，肉眼觀察發(fā)現(xiàn)正常對(duì)照組大鼠無腹水，無腸系膜上血管增粗，肝臟表面光滑，質(zhì)地柔軟，邊緣鈍化。鏡下HE及Masson染色可見肝細(xì)胞索排列整齊，無炎細(xì)胞浸潤(rùn)，無脂肪變性，肝小葉結(jié)構(gòu)無明顯異常，肝血竇以中心靜脈為中心呈放射狀分布(圖1、2)；肉眼觀察發(fā)現(xiàn)四氯化碳溶液復(fù)合乙醇組(ISHAK評(píng)分達(dá)S5級(jí))大鼠出現(xiàn)腹水，腸系膜上血管增粗，肝臟外觀偏暗紅色，質(zhì)地較硬，肝臟表面凹凸不平，小結(jié)節(jié)樣改變，HE染色見正常肝細(xì)胞索排列紊亂，正常肝小葉結(jié)構(gòu)破壞并有明顯的橋連，門管與門管及門管與中心靜脈之間可見有假小葉形成，甚至肝硬化形成。Masson染色可見匯管區(qū)膠原纖維明顯增生，包繞正常肝組織，假小葉形成(圖3、4)；肉眼觀察四氯化碳溶液組發(fā)現(xiàn)大鼠腹水不多，腸系膜上血管稍增粗，肝臟表面較光滑，質(zhì)地較柔軟，鏡下HE及Masson染色可見肝細(xì)胞索排列紊亂，伴少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，正常肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞并有纖維間隔形成，部分可見有假小葉形成(圖5、6)。

討 論

據(jù)統(tǒng)計(jì)，在我國(guó)肝纖維化常以乙型或丙型病毒性肝炎遷延不愈所致[3]，其中約有20%～30%慢性肝炎患者最終會(huì)發(fā)展為嚴(yán)重的肝纖維化或肝硬化病變。研究發(fā)現(xiàn)，星狀細(xì)胞(HSC)是肝纖維化形成的關(guān)鍵。HSC活化后不僅細(xì)胞大量增殖，而且還表現(xiàn)為細(xì)胞個(gè)體分泌纖維能力增強(qiáng)，大量生成細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，并可自分泌TGF β1等細(xì)胞因子，維持自身活化狀態(tài)[4]。因此建立高效的肝纖維化動(dòng)物模型對(duì)臨床研究有著重要意義?，F(xiàn)在誘導(dǎo)肝纖維的動(dòng)物模型很多，因方法不同，所產(chǎn)生的機(jī)制不同，病理生理改變也不同。是否能成功地構(gòu)建大鼠肝纖維化模型對(duì)于研究肝纖維化的發(fā)病機(jī)制、發(fā)病經(jīng)過及如何治療肝纖維化的重要前提條件。實(shí)驗(yàn)者通過以下方法構(gòu)建大鼠肝纖維化模型，如：運(yùn)用刀豆素A[5]，進(jìn)行膽管結(jié)扎術(shù)[6-7]，注射豬血清或人血白蛋白[8-9]，利用血吸蟲感染[10-11]，采用酒精[12]、四氯化碳灌胃[13]。這些實(shí)驗(yàn)方式分別會(huì)引起免疫性肝損害、膽汁淤積、自身免疫性肝纖維化、感染、中毒性肝損害，從而形成肝纖維化模型。免疫誘導(dǎo)性肝纖維化模型持續(xù)時(shí)間明顯長(zhǎng)于肝毒性(如CCl4所制模型)誘導(dǎo)所致的肝纖維化模型。由于人類的慢性乙、丙型肝炎所致的肝纖維化多為免疫性損傷。因此，此種方法所造模型更接近于慢性病毒性肝炎所致的肝纖維化[14]。CCl4所構(gòu)建的肝纖維化動(dòng)物模型是這些方法中造價(jià)成本相對(duì)低廉且實(shí)施方法相對(duì)簡(jiǎn)易，并且是最經(jīng)典、最早、運(yùn)用最廣泛、也最受歡迎的方法之一。

本文所探討的兩種不同造模方法，在誘導(dǎo)肝纖維化過程中，產(chǎn)生機(jī)制如下：①據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[15]，四氯化碳作為一種選擇性肝毒性藥物，在肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，經(jīng)肝微粒體內(nèi)氧化酶的激活而產(chǎn)生自由基·CCl3，與肝細(xì)胞內(nèi)大分子發(fā)生共價(jià)結(jié)合，產(chǎn)生活性氧自由基和脂質(zhì)過氧化，致使正常肝細(xì)胞受到破壞，狄氏間隙內(nèi)的儲(chǔ)脂細(xì)胞釋放Ⅳ型膠原酶，該酶可降解Ⅳ型膠原，促進(jìn)肝纖維化形成。②乙醇在肝臟通過乙醇脫氫酶和微粒體乙醇氧化酶系統(tǒng)進(jìn)行氧化代謝產(chǎn)生毒性代謝產(chǎn)物乙醛。通過多種途徑如肝細(xì)胞損害、誘導(dǎo)免疫反應(yīng)、抑制三羧酸循環(huán)等損害肝臟結(jié)構(gòu)和破壞肝臟功能，刺激膠原蛋白形成。膠原蛋白的合成是促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生原因之一[16]。在乙醇致肝細(xì)胞損傷作用下用四氯化碳能加速肝細(xì)胞壞死，縮短造模時(shí)間[17]。從血清生化指標(biāo)分析：ALT升高，提示肝細(xì)胞損傷、細(xì)胞膜通透性增強(qiáng)。AST增高則反映肝細(xì)胞線粒體損傷。造模結(jié)束后，雖然四氯化碳溶液復(fù)合乙醇組大鼠血清ALT和AST的含量與四氯化碳溶液組大鼠血清ALT和AST的含量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但前者較后者有明顯的升高。從死亡率和成模率分析：四氯化碳溶液復(fù)合乙醇組大鼠死亡率較四氯化碳溶液組低，肝纖維化分期達(dá)5級(jí)以上(含S5級(jí))的成模率，四氯化碳溶液復(fù)合乙醇組大鼠較四氯化碳溶液組高。由此可推斷：四氯化碳溶液復(fù)合乙醇組構(gòu)建肝纖維化模型具有以下優(yōu)點(diǎn)：①肝纖維化程度較理想；②構(gòu)建肝纖維化周期短；③操作相對(duì)簡(jiǎn)便；④大鼠死亡率低。

在構(gòu)建肝纖維化模型中，筆者體會(huì)：①掌握熟練的操作技巧，避免將四氯化碳溶液注射至血管內(nèi)；②開始實(shí)驗(yàn)的大鼠體重應(yīng)控制在100 g左右，方便抓持大鼠，減少大鼠掙扎；③后期大鼠體重可達(dá)300～400 g，可用易拉罐，將大鼠套入其中，減少大鼠掙扎、傷人；④選用大鼠四肢皮下注射，輪替注射，可減少注射部位感染；⑤造模過程嚴(yán)格把控大鼠飼料投喂量，若投喂量過多后期大鼠肥碩，脂肪肝程度加重，不利于進(jìn)一步研究。