李博文，趙寧東，趙立華，何思潔1, ，張麗珍，李順林，張 潔，鄭 雪，龍 琴，張仲凱*，李 靖

(1．西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650224； 2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所, 云南省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室, 農(nóng)業(yè)部西南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室， 云南 昆明 650223； 3.文山學(xué)院化學(xué)與工程學(xué)院，云南 文山 663000；4.中國科學(xué)院昆明植物研究所，云南 昆明 650201)

【研究意義】煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)隸屬于披蓋病毒科煙草花葉病毒屬，是發(fā)現(xiàn)最早、危害最廣的植物病毒，可侵染包括單子葉植物和雙子葉植物在內(nèi)的800多種植物[1-2]。TMV 嚴重危害煙草、辣椒等多種經(jīng)濟作物，甚至造成煙草區(qū)域內(nèi)的毀種、絕收，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了巨大的經(jīng)濟損失，被列世界十大病毒首位[3-4]。然而，目前尚沒有理想的抗TMV途徑。研究表明，生物源農(nóng)藥的研發(fā)是防治該病害的重要途徑之一。因此從植物中尋找抗 TMV 活性物質(zhì)具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】多脂大戟(Euphorbiaresinifera) 為大戟屬植物，原產(chǎn)歐洲，非洲亦產(chǎn)，英國、前蘇聯(lián)等也有分布，為多年生灌木狀草本，主要含有萜類、黃酮類、鞣質(zhì)類等化學(xué)成分[5-6]。前人研究顯示因其活性成分具有抗腫瘤、抑菌消炎、驅(qū)寒止痛、促消化等功效，臨床常用于治療濕寒性或黏液質(zhì)性疾病，如風(fēng)濕、癌癥、癱瘓、抽搐、腹水等疾病[7]，但其主要活性成分大戟脂具有毒性，臨床上應(yīng)緊慎使用[8]。截止目前未發(fā)現(xiàn)其活性成分抗TMV的研究報道。對于TMV的防治，使用從植物中提取的活性物質(zhì)為有效成分的植物源抗病毒劑是主要的防治方法。有研究發(fā)現(xiàn)靛紅的丙酮縮合物3-丙酮基-3-羥基羥吲哚 (3-Acetonyl-3-hydroxyoxindole, AHO) 通過激活特異的miRNAs和PR10基因的表達誘導(dǎo)煙草的SAR抵御TSWV侵染[9]。趙立華等發(fā)現(xiàn)腫柄菊中提取的倍半萜類化合物Tagitinin C和1β-methoxydiversifolin-3-0-methyl ether能通過抑制TMV CP基因和RdRp基因的復(fù)制阻止TMV侵染[10]。近年來不斷從植物中提取到新的抗TMV化合物，例如黃酮、二萜類化合物、生物堿、吡唑等都具有良好的抗TMV活性[11-15]。目前市售的能有效抑制 TMV 侵染的生物源農(nóng)藥以植物中提取的安托芬和毒氟磷為主[16-17]。【本研究切入點】TMV防治一般采用選育抗病品種、物理防治、化學(xué)藥劑防治等方法。化學(xué)藥劑防治效果好，但在田間對作物會產(chǎn)生一定的毒害，也不易降解；而從植物中提取的活性物質(zhì)為有效成分的植物源抗病毒劑具有環(huán)境兼容性好、安全、開發(fā)成本低等優(yōu)點，因此近年來植物源抗病毒劑的研究日益受到人們重視。為此，本實驗從多脂大戟中分離的 11 種抗病毒先導(dǎo)化合物進行煙草抗TMV活性試驗，以寧南霉素作為對照，應(yīng)用預(yù)防試驗和防控試驗2 種篩選方法，旨在為TMV的有效防控奠定基礎(chǔ)?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究采用枯斑法對從多脂大戟中分離的11種化合物進行抗 TMV 活性測定。通過對化合物在防控實驗和預(yù)防實驗中的活性檢測，以期發(fā)現(xiàn)多脂大戟二萜類化合物中可作為抗TMV病毒病害環(huán)保型生物源農(nóng)藥研發(fā)的先導(dǎo)化合物。

1 材料與方法

1.1 供試材料

11種化合物來自中國科學(xué)院昆明植物研究所李順林研究員課題組，化合物名稱、結(jié)構(gòu)圖詳見表1。寧南霉素購于黑龍江德強生物股份有限公司。

寄主植物心葉煙(Nicotianaglutinosa)、K326(Nicotianatabacumcv. K326)、TMV 毒源由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所植物病毒室保存提供。

表1 化合物名稱

續(xù)表1 Continued table 1

編號Number化合物名稱Name of compound結(jié)構(gòu)圖StructureHZ-12(化合物3)Euphorblin BHZ-13A(化合物4)Euphorblin QHZ-15A(化合物5)Euphorblin IHZ-16(化合物6)Euphorblin LHZ-17(化合物7)Euphorblin HHZ-22(化合物8)Euphorblin A

續(xù)表1 Continued table 1

編號Number化合物名稱Name of compound結(jié)構(gòu)圖StructureHZ-31(化合物9)euphorbia factor RL 4HZ-54(化合物10)sooneuphanone DHZ-55A(化合物11)epi-kansenonol

1.2 TMV 提取液的提純制備

參考Gooding的方法[18]，選取接種 TMV 21dpi 的K326病葉進行提純。

1.3 化合物溶劑的制備

用二甲基亞砜(DMSO)將11個化合物分別溶解成濃度為10 mg/mL的母液，再用ddH2O稀釋成100 μg/mL。寧南霉素用ddH2O稀釋成濃度為80 μg/mL(參照說明書)。

1.4 防控實驗

防控實驗設(shè)11 個處理，化合物1到化合物11分別為處理1到處理11，各處理選取長勢一致、生長健壯的真葉期(5～6葉期)心葉煙葉片，人工摩擦接種 TMV，10 min后用ddH2O噴洗，24 h后再均勻涂抹化合物制劑(用量1 mL)，10 min后再用ddH2O噴洗。試驗設(shè)陽性對照2個和空白對照1個，其中陽性對照(CK1)為先涂抹TMV，24 h后涂抹H2O，用于計算抑制率；陽性對照(CK2)為先摩擦接種TMV，24 h后涂抹寧南霉素；空白對照(CK3)為先涂抹H2O，24 h后涂抹DMSO。煙苗生長于無蟲溫室中；每組處理重復(fù)3次。2～3 dpi，接種葉片出現(xiàn)枯斑，調(diào)查統(tǒng)計枯斑數(shù)，并按下式計算抑制率：

抑制率=(C-T)/C×100 %

式中,C：陽性對照枯斑平均數(shù)，T：處理枯斑平均數(shù)。

1.5 預(yù)防實驗

預(yù)防實驗設(shè) 11 個處理，化合物1到化合物11分別為處理1到處理11，各處理先用不同化合物制劑涂抹真葉期(5～6葉期)心葉煙葉片，10 min后用ddH2O沖洗，6 h后摩擦接種 TMV，10 min 后再用ddH2O噴洗。試驗設(shè)陽性對照2個和空白對照1個，其中陽性對照(CK1)為涂抹H2O，6 h后涂抹TMV；陽性對照(CK2)為先涂抹寧南霉素，6 h后摩擦接種TMV；空白對照(CK3)為先涂抹DMSO，6 h后涂抹清水。煙苗生長于無蟲溫室中。每組處理重復(fù)3次。2～3 dpi ，接種葉片出現(xiàn)枯斑，調(diào)查統(tǒng)計枯斑數(shù)，并計算抑制率。

2 結(jié)果與分析

2.1 化合物的防控作用

從圖1～2可見，在防控試驗(接種 TMV， 24 h 后涂抹化合物制劑)中所使用的11種化合物制劑對 TMV 表現(xiàn)出不同程度的防控效果，化合物5、化合物8、化合物9和化合物10對TMV的抑制率分別為47.16 %、29.98 %、30.82 %、25.69 %，有一定抑制TMV侵染的活性，但未超過對照藥劑寧南霉素的抑制率52.89 %；但化合物1(HZ-7，Euphorblin E) 的抑制率為67.54 %，超過了對照藥劑寧南霉素的，圖1也可看出其枯斑數(shù)少于對照，表明化合物1(HZ-7，Euphorblin E)有較好的防控效果。

A：陽性對照(CK1)；B：陽性對照(CK2)；C：化合物1處理(HZ-7)A: Positive control 1(CK1); B: Positive control 2 (CK2)；C: Treatment of compound1 (HZ-7)圖1 防控實驗接種效果Fig.1 Effect of inoculation in curative experiment

1～11：化合物1至化合物11；CK2：陽性對照2(寧南霉素)1-11: Compound1-compound11; CK2: Positive control 2 (Ningnanmycin)圖2 防控實驗中不同化合物對TMV的抑制率Fig.2 Inhibition rate of TMV with different compound in curative experiment

2.2 化合物的預(yù)防作用

預(yù)防實驗(涂抹化合物制劑，6 h后接種TMV)先通過涂抹化合物制劑誘導(dǎo)寄主的抗性，使植物處于“Priming”狀態(tài)進而抵御病原菌的侵染。由圖3～4可見，在預(yù)防試驗中所使用的11種化合物制劑對 TMV 表現(xiàn)出不同程度的防控效果，化合物3、化合物4、化合物6和化合物11對TMV的抑制率分別為43.30 %、37.29 %、21.21 %、25.00 %，有一定抑制TMV侵染的活性，活性未超過對照藥劑寧南霉素的抑制率58.21 %，但化合物1(HZ-7，Euphorblin E)的抑制率為72.30 %，超過對照藥劑寧南霉素的，圖3也可看出枯斑數(shù)少于對照，表明化合物1(HZ-7，Euphorblin E)有較好的預(yù)防效果，且預(yù)防效果優(yōu)于防控效果。

3 討 論

多脂大戟作為藥材，起主要作用的是其分泌物大戟脂(Euphorbium)，大戟脂具有強烈的刺激性，具有強烈瀉下，催噴嚏，抑制牙齒或神經(jīng)產(chǎn)生的疼痛，治療關(guān)節(jié)疼痛等作用[19]。目前對于多脂大戟化學(xué)成分的相關(guān)報道很少，也沒有抗植物病毒方面的研究，故大戟脂化學(xué)成分上還有很大的研究空間，有必要對其開展系統(tǒng)研究，挖掘其潛在的生物活性。

A：陽性對照(CK1)；B：陽性對照(CK2)；C：化合物1處理(HZ-7)A: Positive control 1(CK1); B: Positive control 2 (CK2)；C: Treatment of compound 1 (HZ-7)圖3 預(yù)防試驗接種Fig.3 Effect of inoculation in control experiment

1～11：化合物1至化合物11；CK2：陽性對照2(寧南霉素)1-11: Compound1-compound11; CK2: Positive control 2 (Ningnanmycin)圖4 預(yù)防實驗中不同化合物處理對TMV的抑制率Fig.4 Inhibition rate of TMV with different compound treatments in protective experiment

煙草作為中國重要經(jīng)濟作物，一直產(chǎn)生著巨大的經(jīng)濟效益，而煙草花葉病毒是危害其產(chǎn)量和質(zhì)量的主要病因，防治此病成為煙草產(chǎn)業(yè)的重中之重，目前對于TMV的防治中，高效、綠色無污染的植物源抗病毒劑較少，開發(fā)出低毒、高效、廣譜的植物源抗病毒制劑迫在眉睫。本研究中發(fā)現(xiàn)，分離自多脂大戟的11個化合物對TMV有一定的抑制活性。其中對TMV抑制活性最高的化合物為HZ-7(Euphorblin E)，在防控作用和預(yù)防作用抑制率分別為67.54 %和72.30 %(濃度為100 μg/mL)，均顯著高于對田間病毒病有明顯防控效果的對照藥劑寧南霉素，寧南霉素作為一種廣譜殺菌劑，目前生產(chǎn)上應(yīng)用比較廣泛[20-21]。本研究中篩選的多脂大戟化合物對 TMV有一定的抑制活性，且HZ-7的抑制活性高于對照藥劑寧南霉素，同時預(yù)防作用優(yōu)于防控作用，可作為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中生物源藥劑研發(fā)的先導(dǎo)化合物，具有重大的學(xué)術(shù)和經(jīng)濟意義。

4 結(jié) 論

通過對多脂大戟中提取的11個Lathyrane-type類二萜化合物進行活性測定。結(jié)果表明，其中HZ-7(Euphorblin E)對TMV 抑制活性最高，在防控作用和預(yù)防作用中抑制率分別為67.54 %和72.30 %(濃度為100 μg/mL)，均顯著高于對照藥劑寧南霉素。此研究可為抗TMV生物藥劑的研發(fā)提供先導(dǎo)化合物，并為開展綠色防控體系提供重要的材料基礎(chǔ)。