陳小鳳，黃如葵，梁家作，黃玉輝，馮誠誠，黃熊娟，劉杏連，秦 健，琚茜茜

(1.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，廣西 南寧 530007；2.廣西蔬菜育種與新技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530007)

【研究意義】苦瓜(MomordicacharantiaL.)起源于東南亞的熱帶地區(qū)，廣泛分布于熱帶、亞熱帶及溫帶地區(qū)，資源類型豐富。以往我國作物種質(zhì)資源研究的重點(diǎn)多在收集、保存與鑒定等方面，對(duì)高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、多抗、高效等關(guān)鍵功能基因的發(fā)掘與利用滯后，造成特有基因資源流失嚴(yán)重[1]，而苦瓜特有基因資源的流失會(huì)使苦瓜遺傳基因基礎(chǔ)變窄。輻照誘變是創(chuàng)制新種質(zhì)的有效途徑之一，已在蔬菜中成功選育出優(yōu)良品種或優(yōu)良育種材料[2-3]。花粉包含植物的性細(xì)胞，具有旺盛的分裂能力和對(duì)60Co-γ射線敏感的優(yōu)點(diǎn)[4]。因此，分析苦瓜花粉的輻照效應(yīng)及授粉后對(duì)其后代表型性狀的影響，對(duì)創(chuàng)制苦瓜新種質(zhì)以拓寬苦瓜基因來源具有重要意義?！厩叭说难芯窟M(jìn)展】種子、植株和花粉均可作為輻照材料，但對(duì)輻照的敏感性不同，其中最敏感的是具有旺盛分裂能力的分生組織和性細(xì)胞，而處于休眠狀態(tài)的干種子具有很大的輻照抗性，但由于易獲取，方便輻照操作，因此仍是輻照育種中利用最普遍的輻照材料，其相應(yīng)的輻照效應(yīng)研究也最多[4]。黃如葵等[5]用60Co-γ射線照射苦瓜干種子，發(fā)現(xiàn)以輻照劑量600～700 Gy處理苦瓜干種子的發(fā)芽率、出苗率和成苗率較佳，并認(rèn)為成苗率是確定輻照劑量可靠而敏感的測定指標(biāo)；采用分子標(biāo)記結(jié)合田間篩選培育獲得苦瓜純雌單株116株，雌花率≥50 %的強(qiáng)雌性單株162株，輻照效果明顯。已有研究表明，利用分裂旺盛的愈傷組織為輻照材料創(chuàng)制新種質(zhì)可獲得較佳的效果[6]，但苦瓜的組織培養(yǎng)技術(shù)尚未完全成熟，愈傷組織難以分化不定芽[7-8]，無法進(jìn)行分裂旺盛組織輻照以創(chuàng)制新種質(zhì)。在葫蘆科蔬菜中，輻照花粉授粉的目的多為獲得單倍體，不是進(jìn)行輻照后代性狀選擇[9-11]。【本研究切入點(diǎn)】花粉是有花植物的雄性生殖細(xì)胞，攜帶有植物體一半的染色體，輻照可能使花粉攜帶的染色體產(chǎn)生變異，并通過授粉授精而發(fā)育成突變的種子，進(jìn)而通過選擇變異后代來創(chuàng)制新種質(zhì)，但目前以60Co-γ射線進(jìn)行苦瓜花粉輻照處理的研究未見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】利用不同劑量60Co-γ射線進(jìn)行苦瓜花粉輻照，從花粉萌發(fā)率和輻照1代(M1)單瓜種子數(shù)等方面分析其輻照效應(yīng)，并觀測和記錄田間種植輻照花粉授粉輻照1～5代(M1～M5)的表型性狀，探討苦瓜花粉輻照效應(yīng)與其后代表型變異間的關(guān)系，為創(chuàng)制苦瓜新種質(zhì)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為苦瓜高代自交系MC6、MC9和MC143，由廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所提供，按照《植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測試指南 苦瓜》(NY/T2354-2013)中有關(guān)苦瓜性狀描述，可將其輻照前的基本性狀列于表1。

1.2 花粉輻照方法及花粉萌發(fā)率測定

花粉輻照處理于2014年9月在廣西南寧市廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院示范基地進(jìn)行。在15：00左右采集各苦瓜材料將于次日開放的雄花，裝入防水袋中，立即帶至廣西輻照中心進(jìn)行60Co-γ射線輻照，輻照劑量設(shè)100、150、200、250、300和350 Gy處理，以未輻照雄花的苦瓜材料為對(duì)照(0 Gy)。將輻照過的雄花保存在25 ℃、相對(duì)濕度43 %條件下，次日早上待花藥散粉后，將混合花粉均勻涂入含10 %蔗糖、0.02 %硼酸和0.8 %瓊脂的培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)皿置于25 ℃的黑暗條件下進(jìn)行花粉萌發(fā)試驗(yàn)，以花粉管長度超過花粉粒直徑為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn),3次重復(fù)。每個(gè)培養(yǎng)皿任取10個(gè)視野統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率[12]。

花粉萌發(fā)率(%)=萌發(fā)的花粉粒數(shù)/該視野總花粉粒數(shù)×100

表1 供試苦瓜材料輻射前的基本性狀

1.3 輻照花粉的授粉

在取雄花的當(dāng)天下午，將要受粉的雌花套袋，次日早上用輻照過的雄花授粉并作好標(biāo)記，繼續(xù)套袋隔離至座果。同一材料的雄花授同一材料的雌花，每個(gè)輻照處理均授粉23朵雌花。待果實(shí)自然成熟后，統(tǒng)計(jì)成熟種子數(shù)，取平均數(shù)為最終的單瓜種子數(shù)。

1.4 苦瓜表型性狀觀測及記錄

2015年8月至2018年8月在廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院里建科研基地進(jìn)行田間觀測記錄。田間種植150、200和250 Gy60Co-γ輻照花粉處理的M1種子。因枯萎病發(fā)病嚴(yán)重，150和250 Gy輻照花粉處理的植株死亡，未獲得種子，而200 Gy輻照花粉處理的植株成活并獲得種子。因此，本研究田間種植輻照劑量為200 Gy花粉授粉的后代，并將其M2產(chǎn)生表型性狀變異的植株連續(xù)種植至M5，進(jìn)行單株自交授粉，單瓜采收，按《植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測試指南 苦瓜》中的方法進(jìn)行相關(guān)性狀觀測和記錄，具體為田間隨機(jī)種植變異株后代20株，果皮色、果實(shí)形狀、瘤狀突起大小、瘤狀突起頂形狀、棱長、果實(shí)橫徑和單果重量等性狀指標(biāo)為取主蔓上第2個(gè)生長正常的商品瓜進(jìn)行觀測，本研究僅統(tǒng)計(jì)出現(xiàn)變異的指標(biāo)；以30 %植株開始采收第一個(gè)商品瓜為采收始期，按標(biāo)準(zhǔn)品種進(jìn)行分級(jí)，對(duì)照為輻照前材料。

變異率(%)=變異株數(shù)∕成活株數(shù)×100

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2007對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同60Co-γ輻照劑量對(duì)苦瓜花粉萌發(fā)率和授粉后M1單瓜種子數(shù)的影響

圖1顯示，3個(gè)苦瓜材料的花粉萌發(fā)率均隨著60Co-γ射線輻照劑量的增加而下降，至輻照劑量為350 Gy時(shí)，MC6、MC9和MC143的花粉萌發(fā)率分別由對(duì)照的89.3 %、92.8 %、95.5 %分別降至0.8 %、0.3 %和0.4 %(圖1-A)；所有輻照劑量處理的花粉均能刺激果實(shí)膨大，且高劑量和低劑量處理均出現(xiàn)正常發(fā)育和發(fā)育遲緩的果實(shí)，但單瓜平均種子數(shù)隨著輻照劑量的增加而減少(圖1-B)，至輻照劑量在300 Gy以上時(shí)，果實(shí)中的種子沒有發(fā)育成熟的胚，只有種殼，說明利用輻照花粉授粉的方法進(jìn)行苦瓜新種質(zhì)創(chuàng)制時(shí)，花粉的輻照劑量不宜高于300 Gy。

2.2 60Co-γ輻照苦瓜花粉授粉對(duì)其后代表型性狀的影響

2.2.1 對(duì)性型的影響60Co-γ輻照花粉授粉后，MC6的M2出現(xiàn)強(qiáng)雄變異株，連續(xù)種植3代后，仍表現(xiàn)較強(qiáng)雄性狀，至M5后獲得該性狀的穩(wěn)定后代(圖2-A)，變異率為0.88 %(表2)。MC9的M2出現(xiàn)了全雌性狀植株(圖2-B)，利用300 mg/L AgNO3對(duì)全雌變異株進(jìn)行誘雄處理[13]，結(jié)果表現(xiàn)出3種情形，一是出現(xiàn)兩性花(圖2-C)，二是同時(shí)出現(xiàn)兩性花和正常的雄花(圖2-D)，三是全部表現(xiàn)為正常雌花，至M5時(shí)，第1和第3種情況的植株依然表現(xiàn)全雌性狀，第3種情況誘雄后未出現(xiàn)兩性花是由于誘雄不成功導(dǎo)致；第2種情況在M3有全雌和強(qiáng)雌的分離現(xiàn)象，再種植后全雌性狀穩(wěn)定至M5，全雌性狀的總變異率僅為1.97 %(表2)，說明全雌性狀能穩(wěn)定遺傳給后代。MC143的M2未出現(xiàn)性型變異的單株(表2)。

2.2.2 對(duì)后代果實(shí)皮色的影響 表3顯示，60Co-γ輻照苦瓜花粉授粉后，MC6的M2單株出現(xiàn)果實(shí)皮色為綠白的變異(圖3-B)，變異率為2.63 %，但M3單株后果實(shí)皮色由綠白變回對(duì)照(圖3-A)的淺綠白色(圖3-C)，不能穩(wěn)定遺傳給后代，變異率降為0；MC9的M2單株出現(xiàn)果實(shí)皮色由其對(duì)照(圖3-D)的綠色變?yōu)闇\綠色的變異(圖3-E)，且該性狀穩(wěn)定至M5，變異率為0.66 %；MC143的M2單株未出現(xiàn)果實(shí)皮色變異。說明60Co-γ輻照苦瓜花粉授粉能引起部分基因型苦瓜后代果實(shí)皮色發(fā)生變異，有些變異能穩(wěn)定地遺傳給后代，有些變異可能不是由基因變異引起，不能穩(wěn)定遺傳給后代。

圖1 不同輻照劑量對(duì)苦瓜花粉萌發(fā)率及授粉后對(duì)其M1單瓜種子數(shù)的影響Fig.1 Effects of different irradiation dosages on the germination rate of bitter gourd pollen and single-fruit seed number in M1 plants

表2 60Co-γ輻照苦瓜花粉授粉對(duì)其后代性型的影響

注：-表示未變異，下同。

Note:- represented no variation，the same as below.

表3 60Co-γ輻照苦瓜花粉授粉對(duì)其后代果實(shí)皮色的影響

A：MC6強(qiáng)雄變異株的枝條；B：MC9全雌變異株的枝條；C：MC9兩性花(箭頭所指為成熟雄蕊)；D：MC9同時(shí)出現(xiàn)兩性花和正常雄花的枝條(箭頭所指為未開放的兩性花和雄花)A：A branch of the muant，MC6，with strong male tendency；B：A branch of the gynoecious mutant，MC9；C：Monoecious flowers of MC9(Arrow refers to mature stamen)；D：A branch with both monoecious and male flowers(Arrow refers to an unopened monoecious flower and a male flower，respectively)圖2 2個(gè)苦瓜材料后代的性型變異代表Fig.2 Representative photos of sexual variation in the two tested bitter gourds

A：MC6的對(duì)照淺綠白色果實(shí)；B：MC6的M2變異株的綠白色果實(shí)；C：MC6變異株綠白色果實(shí)恢復(fù)為淺綠白色果實(shí)；D：MC9的對(duì)照綠色果實(shí)；E：MC9的M2變異株的淺綠色果實(shí)A：Pale green-white fruit of the wild type MC6；B：Variation on green-white fruit in M2 plants of MC6；C：Green-white fruit return to pale green-white fruit on MC6 plants；D：Green fruit of wild type MC9；E：Pale green fruit in M2 plants of MC9圖3 2個(gè)苦瓜材料后代果實(shí)皮色的變異代表Fig.3 Representative photos of fruit color variation in the two tested bitter gourds

表4 60Co-γ輻照苦瓜花粉授粉對(duì)其后代果實(shí)長度的影響

表5 60Co-γ輻照苦瓜花粉授粉對(duì)其后代果實(shí)形狀的影響

2.2.3 對(duì)后代果實(shí)長度的影響 表4顯示，60Co-γ輻照苦瓜花粉授粉后，MC9的M2單株出現(xiàn)果實(shí)長度變短～中(15～20 cm)的變異(圖4-B)，變異率為3.29 %，但至M3單株后果實(shí)長度由短～中變回輻照前的短(圖4-A)，不能穩(wěn)定遺傳給后代，變異率降為0；MC6和MC143的M2單株未出現(xiàn)果實(shí)長度變異。說明60Co-γ輻照苦瓜花粉授粉后，其后代果實(shí)長度未發(fā)生穩(wěn)定變異。

2.2.4 對(duì)后代果實(shí)形狀的影響 表5顯示，60Co-γ輻照苦瓜花粉授粉后，MC143的M2單株出現(xiàn)果實(shí)形狀為卵形(圖4-D)和近球形(圖4-E)的變異，變異率為5.26 %，但至M3單株后果實(shí)形狀變回輻照前的紡錘形(圖4-C)，不能穩(wěn)定遺傳給后代，變異率降為0；MC6和MC9的M2單株未出現(xiàn)果實(shí)形狀變異。說明60Co-γ輻照苦瓜花粉授粉后，其后代果實(shí)形狀未發(fā)生穩(wěn)定變異。

2.2.5 對(duì)后代收獲始期的影響 表6顯示，60Co-γ輻照苦瓜花粉授粉后，MC6的M2單株出現(xiàn)收獲始期為中和晚的變異，變異率為1.77 %，其中收獲始期為中的變異株在不同季節(jié)種植其收獲始期表現(xiàn)有所不同，但變化不明顯，而收獲始期為晚的變異株至M5后收獲始期穩(wěn)定為65～70 d，劃分為晚熟類型，變異率降為0.88 %；MC9的M2單株出現(xiàn)收獲始期為中～晚的變異，變異率為2.63 %，至M3單株后收獲始期轉(zhuǎn)回輻射前的極早～早，且部分植株雌花節(jié)位甚至比對(duì)照低，變異率降為0；MC143的M2單株未出現(xiàn)收獲始期變異。說明60Co-γ輻照苦瓜花粉授粉能引起部分基因型苦瓜后代出現(xiàn)收獲始期的變異，有些變異能穩(wěn)定地遺傳給后代，有些變異可能不是由基因變異引起，不能穩(wěn)定遺傳給后代。

A：MC9的對(duì)照果實(shí)長度；B：MC9的M2變異株的變長果實(shí)；C：MC143的對(duì)照紡錘形果實(shí)；D：MC143的M2變異株的卵形果實(shí)；E：MC143的M2變異株的近球形果實(shí)A：Fruit length of the wild type MC9；B：Longer fruit on M2 plants of MC9；C：Spindle-shaped fruit of the wild type MC143；D：Oval fruit on M2 plants of MC143；E：Globose fruit of M2 plants of MC143圖4 2個(gè)苦瓜材料后代的果實(shí)長度和果實(shí)形狀變異代表Fig.4 Representative photos of fruit length and shape of the two bitter gourds tested

表6 60Co-γ輻照苦瓜花粉授粉對(duì)其后代果實(shí)收獲始期的影響

表7 60Co-γ輻照苦瓜花粉授粉對(duì)其后代表型性狀變異率的影響

注：“其中”表示果實(shí)皮色變異中包括性型和收獲始期的變異。

Note:‘Wherein’ indicates that the fruit color variation includes both sexual type and mature time variation.

2.3 60Co-γ輻照苦瓜花粉授粉對(duì)其M2和M5表型性狀變異率的影響

表7顯示，MC6、MC9和MC143的花粉經(jīng)60Co-γ輻照授粉后，M2的總變異率分別為3.54 %、8.55 %和5.26 %，至M5總變異率分別降為0.88 %、2.63 %和0，變異率降低主要是由于果形、果實(shí)皮色和收獲始期等經(jīng)田間種植后又恢復(fù)至輻照前的性狀，如MC143產(chǎn)生果形變異和MC6產(chǎn)生果皮色變異的植株，說明60Co-γ輻照劑量為200 Gy時(shí)，可使不同類型苦瓜M2產(chǎn)生某些表型性狀變化，但有些變化可能不是由基因變異引起，不能穩(wěn)定地遺傳給后代。

3 討 論

誘變具有使突變性狀較快穩(wěn)定的特點(diǎn)，是創(chuàng)造新種質(zhì)、選育新品種的有效途徑，在作物品種遺傳改良上占有重要地位。蔬菜誘變育種始于20世紀(jì)50年代，已先后育成番茄、辣椒、甜瓜和黃瓜等蔬菜新品種[14]，但利用花粉作為輻照材料進(jìn)行苦瓜雙倍體后代變異選擇等的相關(guān)研究未見報(bào)道。本研究結(jié)果表明，苦瓜花粉萌發(fā)率隨著60Co-γ射線輻照劑量的增加而下降，經(jīng)輻照的花粉授粉后均能使果實(shí)膨大，且平均單瓜種子數(shù)隨著輻照劑量的增加而減少，當(dāng)輻照劑量為300和350 Gy時(shí)，未收獲到有胚種子，說明苦瓜花粉萌發(fā)率與果實(shí)膨大無相關(guān)性。

低劑量射線照射作物的花粉可有效克服遠(yuǎn)緣雜交的不親和性，促進(jìn)種間、屬間遠(yuǎn)緣雜交[15-17]。葫蘆科蔬菜利用輻照花粉授粉的目的是獲得單倍體植株[9-11]，但未見對(duì)其后代進(jìn)行變異選擇的報(bào)道。本研究選用3種類型苦瓜花粉進(jìn)行輻照后授粉，對(duì)其后代變異表型性狀進(jìn)行田間鑒定，結(jié)果表明，200 Gy劑量60Co-γ射線輻照花粉授粉能有效促使MC6、MC9和MC143苦瓜的M2表型性狀產(chǎn)生變異，總變異率為3.54 %～8.55 %，種植至M5時(shí)，總變異率降低為0～2.63 %。變異率變低一是由于苦瓜的花芽分化受溫度和光照影響，雌性狀況和收獲始期等性狀發(fā)生改變[18]；二是果實(shí)皮色受光照影響，使同一個(gè)苦瓜的遮陽部分與充分暴露在陽光下的部分著色存在較大差異；三是由于在M2時(shí)測定的果實(shí)長度是單株變異，未取得《植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測試指南 苦瓜》中規(guī)定的主蔓上第二個(gè)商品瓜的平均測量值，導(dǎo)致數(shù)值出現(xiàn)較大偏差。因此，不能穩(wěn)定遺傳給后代苦瓜性狀的變異是否真正由基因變異引起，還有待研究證實(shí)。

4 結(jié) 論

以不同劑量60Co-γ射線進(jìn)行苦瓜花粉輻照可獲得苦瓜果皮色和性型變異株的穩(wěn)定后代，說明輻照花粉授粉也是苦瓜輻照誘變育種的有效途徑之一，其中200 Gy輻照苦瓜花粉后授粉能使部分基因型苦瓜產(chǎn)生穩(wěn)定變異，而利用輻照花粉授粉的方法進(jìn)行苦瓜新種質(zhì)創(chuàng)制時(shí)，花粉的輻照劑量不宜高于300 Gy。