陸小華 朱小慶 袁洪新 儲玉山

[摘要]目的 探討APE1基因-141T/G和148Asp/Glu位點單核苷酸多態(tài)性與肝細(xì)胞癌（簡稱“肝癌”）不同臨床表型的相關(guān)性。方法 選取2018年1月1日～12月31在南通大學(xué)附屬醫(yī)院介入放射科住院的125例初診肝癌患者作為研究對象，提取基因組DNA，采用panel高通量數(shù)據(jù)分析進(jìn)行APE1基因分型，分析各基因型與肝癌臨床表型的關(guān)聯(lián)性。結(jié)果 -141位點雜合突變基因型TG的患者較野生型TT患者出現(xiàn)較晚分期的風(fēng)險增加（OR=4.513，95%CI：1.411～14.445，P<0.05），純合突變基因型GG較野生型TT患者出現(xiàn)較晚分期的風(fēng)險增加（OR=4.444，95%CI：1.217～16.233，P<0.05），突變基因型TG+GG較野生型TT患者出現(xiàn)較晚分期的風(fēng)險增加（OR=4.491，95%CI：1.457～13.848，P<0.05）;148位點各基因型分期風(fēng)險無明顯關(guān)聯(lián)（P>0.05）。-141位點雜合突變基因型TG的患者較野生型TT患者發(fā)生門脈侵犯的風(fēng)險增加（OR=3.091，95%CI：1.019～10.064，P<0.05），純合突變基因型GG患者較野生型TT患者發(fā)生門脈侵犯的風(fēng)險增加（OR=3.789，95%CI：1.025～14.009，P<0.05），突變基因型TG+GG較野生型TT患者發(fā)生門脈侵犯的風(fēng)險增加（OR=3.302，95%CI：1.061～10.276，P<0.05）;148位點各基因型發(fā)生門脈侵犯的風(fēng)險無明顯關(guān)聯(lián)（P>0.05）。-141位點各基因型發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險無明顯關(guān)聯(lián)（P>0.05）;148位點純合突變基因型GG患者較野生型TT患者發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險增加（OR=3.500，95%CI：1.018～12.03，P<0.05）。-141位點純合突變基因型GG的患者較野生型TT患者發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的風(fēng)險增加（OR=5.667，95%CI：1.074～29.891，P<0.05）;148位點各基因型發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的風(fēng)險無明顯關(guān)聯(lián)（P>0.05）。結(jié)論 APE1基因單核苷酸多態(tài)性與肝癌BCLC分期、門靜脈侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等臨床表型之間存在相關(guān)性。

[關(guān)鍵詞]APE1;肝細(xì)胞癌;單核苷酸多態(tài)性;臨床表型

[中圖分類號] R735.7? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-4721（2020）5（a）-0013-05

Study on the correlation between single nucleotide polymorphisms of APE1 gene and clinical phenotype of hepatocellular carcinoma

LU Xiao-hua? ?ZHU Xiao-qing▲? ?YUAN Hong-xin? ?CHU Yu-shan

Department of Interventional Radiology， Affiliated Hospital of Nantong University， Jiangsu Province， Nantong? ?226001， China

[Abstract] Objective To investigate the correlation between the single nucleotide polymorphisms of APE1 gene at the locus of -141T/G and 148Asp/Glu and different clinical phenotypes of hepatocellular carcinoma. Methods A total of 125 patients newly diagnosed with hepatocellular carcinoma who were hospitalized in the Interventional Radiology Department of the Affiliated Hospital of Nantong University from January 1 to December 31， 2018 were selected as the research objects to extract genomic DNA. The panel high-throughput data analysis was adopted to conduct APE1 genotyping and the correlation between each genotype and the clinical phenotype of hepatocellular carcinoma was analyzed. Results At locus -141， patients with heterozygous mutant genotype TG had an increased risk of later stage than patients with wild-type TT （OR=4.513， 95%CI： 1.411-14.445， P<0.05）， the patients with homozygous mutant genotype GG had an increased risk of later stage than patients with wild-type TT （OR=4.444， 95%CI： 1.217-16.233， P<0.05）， and the risk of later stage in patients with mutant genotype TG+GG was higher than that in patients with wild type TT （OR=4.491， 95%CI： 1.457-13.848， P<0.05）. There was no significant difference in the risk of stages of each genotype at locus 148 （P>0.05）. At locus -141， patients with heterozygous mutant genotype TG had an increased risk of portal vein invasion compared with patients with wild-type TT （OR=3.091， 95%CI： 1.019-10.064， P<0.05）， the patients with homozygous mutant genotype GG had an increased risk of portal vein invasion compared with patients with wild-type TT （OR=3.789， 95%CI： 1.025-14.009， P<0.05）， and the risk of portal vein invasion in patients who carried the mutant genotype TG+GG was higher than that in patients with wild type TT （OR=3.302， 95%CI： 1.061-10.276， P<0.05）. There was no significant difference in the risk of portal vein invasion among all genotypes at locus 148 （P>0.05）. There was no significant difference in the risk of lymph node metastasis among genotypes at locus -141 （P>0.05）. At locus 148， patients with homozygous mutation GG had an increased risk of lymph node metastasis compared patients with wild-type TT （OR=3.500， 95%CI： 1.018-12.03， P<0.05）. At locus -141， patients with homozygous mutation GG had an increased risk of distant metastasis compared with patients with wild-type TT （OR=5.667， 95%CI： 1.074-29.891， P<0.05）. There was no significant difference in the risk of distant metastasis among all genotypes at locus 148 （P>0.05）. Conclusion The single nucleotide polymorphisms of APE1 gene are correlated with clinical phenotypes of hepatocellular carcinoma such as BCLC stage， portal vein invasion， lymph node metastasis and distant metastasis.

[Key words] APE1; Hepatocellular carcinoma; Single nucleotide polymorphism; Clinical phenotype

肝細(xì)胞癌，簡稱肝癌，是最常見的惡性腫瘤和腫瘤致死病因之一，嚴(yán)重威脅人們的生命健康。流行病學(xué)研究證實，遺傳因素在肝癌的發(fā)病和轉(zhuǎn)歸中占據(jù)重要地位[1]。目前臨床工作中，肝癌臨床表型是制定治療方案、判斷療效及預(yù)后的一項重要參考指標(biāo)。單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）在人類基因組中廣泛存在，作為第三代遺傳標(biāo)記，關(guān)聯(lián)疾病遺傳易感性，影響疾病進(jìn)程等。自1996年發(fā)現(xiàn)至今，其不僅已應(yīng)用于流行病學(xué)預(yù)判不同疾病的罹患風(fēng)險，還有望成為臨床工作中評價疾病療效及預(yù)后的重要指標(biāo)[2]。已有大量關(guān)于SNP與肝癌發(fā)生及轉(zhuǎn)歸存在明顯關(guān)聯(lián)性的報道[3-9]。目前已知多數(shù)環(huán)境致癌物通過外源性和內(nèi)源性DNA損傷物質(zhì)與細(xì)胞DNA共價結(jié)合，引起DNA損傷，從而導(dǎo)致基因突變和細(xì)胞癌變，最終導(dǎo)致腫瘤等相關(guān)疾病的發(fā)生。作為DNA修復(fù)系統(tǒng)中最主要的一種修復(fù)途徑，堿基切除修復(fù)（base excision repair，BER）在修復(fù)DNA損傷、維持DNA完整性中起著重要作用[10]。本研究選取BER途徑中的關(guān)鍵基因之一，即脫嘌呤脫嘧啶核酸內(nèi)切酶基因（apurinic/apyrimidinic endonuclease 1，APE1），探尋該基因SNP與肝癌臨床表型之間是否存在相關(guān)性。已有報道顯示該基因SNP與多種腫瘤的易感性存在關(guān)聯(lián)[5]，但針對該基因SNP與腫瘤臨床表型相關(guān)性的報道不多。通過查找dbSNP數(shù)據(jù)庫，筆者發(fā)現(xiàn)存在于APE1基因中的近20個SNP位點中，最小等位基因頻率（minor allele frequency，MAF）>5%的SNP僅有兩個，分別是啟動子區(qū)-141T/G（rs1760944）和第5外顯子148Asp/Glu（rs1130409），因此選擇這兩個位點進(jìn)行相關(guān)研究。通過分析以上兩個位點多態(tài)性與肝癌臨床表型[巴塞羅那分期（Barcelona clinic liver cancer，BCLC）、門靜脈侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移]的關(guān)系，以期發(fā)現(xiàn)該基因SNP在肝癌病情進(jìn)展中所發(fā)揮的作用，從分子生物學(xué)層面為臨床實際工作中制定治療方案及判斷預(yù)后帶來幫助，現(xiàn)報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2018年1月1日～12月31在南通大學(xué)附屬醫(yī)院介入放射科住院的125例新確診擬行介入治療的成年肝癌患者作為研究對象，收集入組者的臨床資料，采集外周靜脈血樣本（EDTA抗凝管，3 ml左右）。排除標(biāo)準(zhǔn)：①非初診肝癌患者;②體力狀況評分（PS）≥3分患者。其中男100例（80.0%），女25例（20.0%）;年齡39～92歲，平均（61.20±1.21）歲;BCLC A期17例（13.6%），B期72例（57.6%），C期36例（28.8%）;有門靜脈侵犯30例（24.0%），無門靜脈侵犯95例（76.0%）;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移27例（21.6%），無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移98例（78.4%）;有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移17例（13.6%），無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移108例（86.4%）。所有病例均依據(jù)《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范（2017年版）》診斷標(biāo)準(zhǔn)加以確診，其中116例符合肝癌臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，9例符合肝癌病理學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)。臨床分期按照BCLC標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期。所有研究對象資料的收集和血樣標(biāo)本的獲得均符合醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的規(guī)定。

1.2方法

1.2.1主要儀器和試劑? 臺式離心機(jī)（Pico-21，Thermo Fisher公司）;漩渦混合器（GL-88B，其林貝爾儀器制造有限公司）;混勻型干式恒溫器（TND03-H-H，Thermo Fisher公司）;電泳槽（DYCZ-21，北京市六一儀器廠）;Ezup柱式血液基因組DNA抽提試劑盒（B518253，上海生工公司）;Synergy LX MULTI-Mode Microplate Reader（BioTek公司）。

1.2.2基因位點分型? （1）DNA抽提：使用上海生工Ezup柱式血液基因組DNA抽提試劑盒提取基因組DNA，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。?）SNP分型：采用panel高通量數(shù)據(jù)分析進(jìn)行基因分型。步驟如下。①使用cutadapt軟件去除3′端序列adaptor，并切除reads 5′端及3′端前10個堿基;②使用prinseq-lite軟件去除平均質(zhì)量值<20的序列;③用bwa軟件將reads1及reads2采用pair-end mapping方式比對到靶區(qū)域序列中;④做SNP及Indel calling，采用的軟件為自寫perl腳本，對reads1及reads2上的序列進(jìn)行校正，overlap區(qū)域堿基相同且質(zhì)量>20的用于計算;⑤找出靶區(qū)域SNP/Indel位點;⑥對SNP、Indel位點進(jìn)行注釋，注釋包括snpdb、基因注釋、氨基酸注釋等，注釋采用annovar軟件。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用χ2檢驗比較不同臨床表型中各基因型的頻率分布差異，以比值比（odds ratio，OR）及其95%可信區(qū)間（confidence interval，CI）表示相關(guān)基因型與肝癌臨床表型的關(guān)聯(lián)強(qiáng)度，并以性別、年齡等因素對P值、OR值進(jìn)行校正。所有統(tǒng)計檢驗均為雙側(cè)檢驗，以P<0.05判定為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 APE1基因-141位點SNP與肝癌臨床表型的關(guān)聯(lián)分析

在BCLC分期方面，該位點雜合突變基因型TG的患者較野生型TT患者出現(xiàn)較晚分期的風(fēng)險增加（OR=4.513，95%CI：1.411～14.445，P<0.05），純合突變基因型GG較野生型TT患者出現(xiàn)較晚分期的風(fēng)險增加（OR=4.444，95%CI：1.217～16.233，P<0.05），突變基因型TG+GG較野生型TT患者出現(xiàn)較晚分期的風(fēng)險增加（OR=4.491，95%CI：1.457～13.848，P<0.05）;在門脈侵犯方面，攜帶該位點雜合突變基因型TG的患者較野生型TT患者發(fā)生門脈侵犯的風(fēng)險增加（OR=3.091， 95%CI：1.019～10.064，P<0.05），純合突變基因型GG患者較野生型TT患者發(fā)生門脈侵犯的風(fēng)險增加（OR=3.789，95%CI：1.025～14.009，P<0.05），突變基因型TG+GG較野生型TT患者發(fā)生門脈侵犯的風(fēng)險增加（OR=3.302，95%CI：1.061～10.276，P<0.05）;在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面，該位點各基因型發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險無明顯關(guān)聯(lián)（P>0.05）;在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移方面，該位點純合突變基因型GG的患者較野生型TT患者發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的風(fēng)險增加（OR=5.667，95%CI：1.074～29.891，P<0.05）;該位點其他基因型與野生型TT患者發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的風(fēng)險無明顯關(guān)聯(lián)（P>0.05）（表1）。

2.2 APE1基因148位點SNP與肝癌臨床表型的關(guān)聯(lián)分析

該位點各基因型與BCLC分期、門靜脈侵犯、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移發(fā)生風(fēng)險無明顯關(guān)聯(lián)（P>0.05）;攜帶該位點純合突變基因型GG患者較野生型TT患者發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險增加（OR=3.500，95%CI：1.018～12.03，P<0.05），而該位點其他基因型與野生型TT患者發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險無明顯關(guān)聯(lián)（P>0.05）（表2）。

3討論

APE1又稱為氧化還原因子1（Ref-1），定位于14號核苷酸，3′端不翻譯區(qū)（216個核苷酸）和一個polyA尾構(gòu)成。轉(zhuǎn)錄區(qū)長度約為216 kb，包含5個外顯子和4個內(nèi)含子，其中第一個外顯子為非編碼區(qū)。脫嘌呤嘧啶（AP）位點是DNA最常見的損傷位點之一，在正常生理狀態(tài)下，人體一個細(xì)胞每天約有10 000個脫嘌呤位點和500個脫嘧啶位點產(chǎn)生。除自發(fā)脫嘌呤脫嘧啶作用外，烷化劑、氧自由基、電離輻射等因素也可引起DNA損傷，形成AP位點。如不能對其進(jìn)行修復(fù)，可妨礙DNA復(fù)制，引起基因突變、染色體微衛(wèi)星不穩(wěn)定性或細(xì)胞凋亡，甚至導(dǎo)致腫瘤的產(chǎn)生。BER途徑是細(xì)胞對包括烷化劑和氧化劑在內(nèi)的多種環(huán)境致癌物所引起的DNA損傷進(jìn)行修復(fù)的主要途徑。目前已知該途徑由APE1、OGG1、XRCC1、TDG、MBD4、MYH、NTH1、MPG等在內(nèi)的37個基因組成，共同發(fā)揮作用。APE1作為BER途徑中的關(guān)鍵基因之一，具有DNA修復(fù)以及氧化還原雙重功能，可調(diào)節(jié)多種轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合活性，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等反應(yīng)。該基因在修復(fù)DNA損傷、維持DNA完整性中起著重要作用。其功能異常與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[11]。

目前國內(nèi)外文獻(xiàn)報道中，針對APE1基因SNP與腫瘤疾病的相關(guān)研究主要集中在肺癌、肝癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌等腫瘤的易感性方面[12-16]，而與腫瘤臨床表型的相關(guān)性研究甚少。目前僅發(fā)現(xiàn)白介素-8（IL-8）、HJURP、XPG等基因SNP與肝癌臨床表型相關(guān)性的研究報道[17-19]。而臨床實踐中，針對不同的臨床表型，治療方案不盡相同，并以其作為判斷療效及預(yù)后的重要參考依據(jù)。因此，對APE1基因SNP與肝癌臨床表型相關(guān)性的研究，有助于臨床制定肝癌治療方案，判斷療效及預(yù)后，具有較高的臨床參考價值和現(xiàn)實意義。

本研究以APE1基因-141T/G（rs1760944）和148Asp/Glu（rs1130409）SNP為切入點，探討其與肝癌不同臨床表型的相關(guān)性，從而為臨床制定治療方案，判斷預(yù)后帶來幫助。本研究結(jié)果顯示，與-141位點野生基因型TT相比較，該位點突變基因型TG、GG出現(xiàn)較晚BCLC分期、發(fā)生門脈侵犯的風(fēng)險顯著增加，該位點純合突變基因型GG較野生基因型TT發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的風(fēng)險顯著增加（P<0.05），而該位點SNP與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無明顯關(guān)聯(lián)（P>0.05）。148位點純合突變基因型GG患者較野生基因型TT患者發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險顯著增加（P<0.05），而該位點SNP與BCLC分期、門靜脈侵犯、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無明顯關(guān)聯(lián)（P>0.05）。提示攜帶兩位點野生基因型的患者較突變基因型患者可能有更好的臨床預(yù)后。通過檢測這兩個位點的基因型，從分子生物學(xué)水平預(yù)判肝癌不同臨床表型，包括BCLC分期、門靜脈侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等，從而對患者治療方案的制定及預(yù)后進(jìn)行綜合判斷。雖然本研究得出陽性結(jié)果，但由于樣本量偏少，可能存在選擇偏倚，且肝癌的生物學(xué)行為受到腫瘤的異質(zhì)性、器官微環(huán)境不同等諸多因素的影響，另外，本研究僅對關(guān)聯(lián)性表象加以分析，未深入研究相關(guān)機(jī)制，因此本研究只能視為初步研究。在今后的工作中，將不斷擴(kuò)充樣本量，擴(kuò)大樣本范圍，增加相關(guān)機(jī)制研究，簡化檢測流程，并注意減少相關(guān)因素的干擾，以期獲得更有質(zhì)量、更有說服力的研究成果。

綜上所述，APE1基因SNP與肝癌患者的BCLC分期、門靜脈侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等臨床表型存在相關(guān)性，檢測相關(guān)位點基因型有可能對肝癌患者制定治療方案及預(yù)后判斷帶來幫助。

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（收稿日期：2020-02-19? 本文編輯：任秀蘭）