王婭娜，王 嬋，王 雙

細粒棘球絳蟲病又稱包蟲病，是一種人獸共患寄生蟲病，在我國的中西部畜牧業(yè)地區(qū)流行較廣[1]。2017年在四川成都市召開了全國包蟲病防控技術(shù)研討會，互相交流包蟲病的防控經(jīng)驗，希望盡快找出對包蟲病有效的防控措施。人們一直對疫苗防控包蟲病給予厚望[2-3]，雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些包蟲疫苗候選分子，但是目前尚無一種疫苗推廣應(yīng)用。主要原因是由于包蟲蟲體發(fā)育階段多(包括六鉤蚴、細粒棘球蚴、成蟲、蟲卵)，蟲體體積大，成分復雜，以及人們對包蟲疫苗誘導機體的免疫感染機制不明確所致。前期研究發(fā)現(xiàn)抗原Eg10能夠誘導小鼠產(chǎn)生特異性抗體[4]，但在免疫小鼠后進行攻擊感染的實驗中，小鼠體內(nèi)包囊數(shù)目及體積均高于對照組[5]。為了探究原因，通過體外培養(yǎng)DC，模擬疫苗進入機體，對抗原提呈細胞捕獲抗原這一過程進行研究。

1 材料與方法

1.1材料 6～8周C57BL/ 6雄鼠購自寧夏醫(yī)科大學實驗動物中心。包蟲囊液(hydatid fluid HF)取自寧夏醫(yī)科大學附屬醫(yī)院外科手術(shù)的包蟲病患者，術(shù)中無菌從包囊中抽取，分裝、凍存于-20 ℃。重組表達菌株Eg10/pET28a/BL21由寧夏醫(yī)科大學科學技術(shù)研究中心包蟲病實驗室提供。

1.2主要試劑 Triton114及紅細胞裂解液購自Solarbio；RPMI1640、1%的青霉素和鏈霉素購自美國Gibico公司；胎牛血清、PBS購自美國Hyclone公司； LPS(Escherichiacolistrain 0111:B4)、FITC-dextran、蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟(PMSF)購自美國Sigma公司；絲裂霉素C購自德國Merk公司；熒光染料羧基熒光素雙乙酸鹽，琥珀酰亞胺酯(CFSE)購自美國Introvgen公司；IPTG、甲叉雙丙烯酰胺、丙烯酰胺購自Promega 公司；蛋白、酵母提取物購自O(shè)XOID 公司；考馬斯亮蘭購自BIOMOL 公司；L-谷氨酰胺、β-巰基乙醇、咪唑購自Amersco公司；蛋白純化樹脂購自Roche公司；Mouse IL-6、Mouse IL-10、Mouse IFN-γ、Mouse IL-12p70ELISA 檢測試劑盒購自杭州聯(lián)科生物；anti-mouse CD11c-PE、anti-mouse CD80-FITC、anti-mouse CD40-PE-Cyanin5、anti-mouse MHCII-PE-cyanin5、anti-mouse CD86-FITC、IL-4、巨噬細胞粒細胞集落刺激因子(GM-CSF)、Treg細胞檢測試劑盒購自eBioscience；CD4+T-FITC磁珠提取試劑盒購自Miltenyi公司；內(nèi)毒素檢測試劑盒ToxinSensorTM Chromogenic LAL Endotoxin Assay Kit購自Genescript公司；細胞培養(yǎng)板12孔、24孔、96孔購自Corning公司；其它化學試劑為國產(chǎn)分析純。

1.3 方 法

1.3.1抗原的純化 按照羅氏親和層析法說明書，Ni2+親和層析純化Eg10。因細胞培養(yǎng)中加入的蛋白為無菌的可溶性蛋白，因此對Eg10和HF進行0.45 μm過濾除菌、BSA定量及內(nèi)毒素檢測。

1.3.2小鼠BMDC的獲取及培養(yǎng) C57BL/6 6～8 w 2只雄鼠采用頸椎脫臼處死，無菌獲取股、脛骨的骨髓細胞。紅細胞裂解4～7 min，離心1 000 r/min，棄上清，計數(shù)。用含10% 胎牛血清(fetal bovine serum FBS)，50 μmol/L β-巰基乙醇，2 mmol/L谷氨酰胺，5 ng/mL IL-4，10 ng/mL GM-CSF培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度，按2×106/mL接種到12孔細胞培養(yǎng)板中，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)，于3 d、5 d進行半量換，補充IL-4及GM-CSF的量。培養(yǎng)至第7 d，收集BMDC。

1.3.3Eg10致敏DC的濃度及時間的優(yōu)化 收集第7 d的BMDC，用不含GM-CSF、IL-4的10% FBS培養(yǎng)液稀釋至1×106/mL，接種24孔細胞培養(yǎng)板中，分別用Eg10 0.1 μg、1 μg、10 μg的濃度致敏DC，同時觀察不同濃度下致敏DC在6 h、20 h、48 h表面分子表達情況，從而篩選出最佳濃度及最佳時間。

1.3.4BMDC的分組 收集第7 d的BMDC，用不含GM-CSF、IL-4的10% FBS培養(yǎng)液稀釋至1×106/mL，接種24孔細胞培養(yǎng)板中，分6組。 HF組為陰性對照組(加入HF 30 μg/mL)、Eg10組(加入抗原Eg10 1 μg/mL)、LPS陽性對照組(加入LPS 100 ng/mL)、RPMI 1640為control組，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)20 h；聯(lián)合組Eg10+LPS組(加入抗原Eg10 1 μg/mL和 LPS 100 ng/mL)和HF+LPS組(加入HF 30 μg/mL和 LPS 100 ng/mL)，先加入Eg10或HF 37 ℃，5% CO2培養(yǎng)20 h后，再加入LPS培養(yǎng)20 h。

1.3.5BMDC細胞表面分子的檢測 收集第7 d的各組DC，分別加各組表面分子抗體anti-mouse MHCⅡ-PE-Cy5、anti-mouse CD80-FITC、anti-mouse CD11c-PE、anti-CD40-PE-cy5、anti-mouse CD86-FITC，加入含2%PFA500 μL，設(shè)立空白對照，4 ℃,避光,30 min，Guava流式細胞儀檢測BMDC表面分子表達。每個樣本檢測細胞不少于1×104。

1.3.6 形態(tài)學觀察

1.3.6.1掃描電鏡的觀察 DC的表面形態(tài)培養(yǎng)第7 d，收集各組DC，取1×105的DC制備爬片，37 ℃培養(yǎng)20 h，2.5%戊二醛固定1 h，1%鋨酸再固定0.5 h，30%～100%乙醇梯度脫水，加入叔丁醇，真空泵干燥處理，真空離子噴鍍鉑金膜，掃描電鏡日立S-3400N觀察各組DCs的表面形態(tài)。各組隨機視野選100個DC，統(tǒng)計細胞表面有突起的細胞和無突起的細胞數(shù)量進行比較(突起<3記為無突起)。再從各組DC表面含有突起細胞中隨機選20個，對突起的數(shù)目計數(shù)。

1.3.6.2透射電鏡觀察BMDC的超微結(jié)構(gòu) 培養(yǎng)第7 d，各組收集DC 3×106，離心1 000 r/min，10 min，棄上清，迅速加入2.5% 戊二醛固定2 h，PBS洗滌3 次，每次10 min，用1% 鋨酸后固定1 h，PBS洗滌2 次，每次10 min，30%～100%乙醇梯度脫水，每次10 min，再用環(huán)氧丙烷置換2 次，每次0.5 h，最后用環(huán)氧樹脂618包埋，Leica UC7型超薄切片機切片，醋酸鈾-枸櫞酸鉛染色，透射電鏡日立H-7650B觀察DC的超微結(jié)構(gòu)。

1.3.7吞噬能力測定培養(yǎng) 第7 d，收集各組DC，加入右旋多糖FITC-dextran (40 kDa 1 mg/mL)，37℃孵育1 h，1 000 r/min離心，加入2% PFA 500 μL，流式細胞儀檢測各組DCs吞噬FITC-dextran的含量。結(jié)果重復3次，每個樣本檢測細胞不少于1×104。吞噬能力的強弱通過FITC熒光強度來反應(yīng)。

1.3.8 T細胞增殖能力測定

1.3.8.1CD4+T 細胞的獲取及標記 C57 BL/6小鼠6～8 w脫頸處死，無菌條件取脾臟，制備脾細胞懸液，裂解紅細胞，按照CD4+磁珠說明書，獲取CD4+T細胞，1×107細胞加入CFSE(2.5～5 μmol/L)，37 ℃避光，15 min，終止反應(yīng)用預冷的FBS，10% FBS洗2 次。

1.3.8.2同種異體混合淋巴細胞培養(yǎng) DC作為刺激細胞2×105加入絲裂霉素C(25 μg/ mL)37 ℃，處理30 min，CD4+T細胞為效應(yīng)細胞，DC：CD4+T(按1∶10、1∶20、1∶50不同比例)培養(yǎng)，每孔終體積達200 μL，每樣本設(shè)復孔，在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)5 d，流式細胞儀檢測，以出現(xiàn)在背景熒光之前區(qū)域的熒光強度反應(yīng)T細胞的增殖能力，實驗重復3次。

1.3.8.3Treg細胞的含量按DC與CD4+T 1∶10進行培養(yǎng)5 d，通過Treg細胞檢測試劑盒，流式細胞儀檢測不同組中Treg細胞的含量(方法按照Mouse Regulatory T Cell Staining Kit #3)

1.3.9各組DC遷移能力的檢測 培養(yǎng)第7 d，收集各組DC，RPMI 1640洗2 次，除去血清白蛋白，按比例加入CFSE(終濃度為2.5～5 μmol/L)，混勻，37 ℃避光15 min，每5 min振蕩1次，然后用預冷的FBS終止反應(yīng)，37 ℃，5 min，1 200 r/min, 10 min，用含10% FBS洗2次，細胞計數(shù)2×105，注射小鼠足墊，48 h后，通過Cri Maestro小動物活體成像系統(tǒng)觀察DC的遷移能力，對不同組小鼠選取相同的感興趣區(qū)域ROI(Region Of Interest),進行熒光平均強度的比較。實驗重復4次，結(jié)果取平均值。

1.3.10細胞因子的檢測 培養(yǎng)第7 d，收集各組DCs的培養(yǎng)上清液，按照小鼠細胞因子IL-12p70，TNF-α、IL-6、IL-10試劑盒說明書，通過酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測上清液中各因子的含量，每個樣本設(shè)立3個復孔，通過雙波長570 nm和630 nm進行檢測。

2 結(jié) 果

2.1經(jīng)過Ni+親和層析柱可以純化出1條約31 kD的蛋白條帶(圖1)。

1：protein marker; 2：Eg10圖1 Eg10 Fig.1 Eg10 protien

2.2Eg10對DC致敏條件優(yōu)化 實驗中發(fā)現(xiàn)Eg10在濃度為1 μg/mL時致敏DC，DC表面分子MHCII, CD80,CD86的表達均與 0.1 μg和10 μg兩個濃度相比輕微上提，無統(tǒng)計學差異(t=0.80、1.72、0.92、1.93、0.53、1.83，P均>0.05)，見圖2A, 對于Eg10作用DC不同時間點比較發(fā)現(xiàn)，20 h組DC各表面分子均高于6 h和48 h組(t=4.09、7.48、6.12、8.76、7.37、3.08、2.09、4.87、5.9、1.88，P均<0.05)圖2B，之后實驗都采用Eg10 1 μg/mL致敏DC 20 h。

A.Eg10致敏DC的濃度優(yōu)化；B.Eg10致敏DC的時間優(yōu)化圖2 Eg10致敏DC調(diào)節(jié)的優(yōu)化Fig.2 Optimizing the conditions of DCs stimulated with Eg10

2.3DC表面分子表達 顯示HF組和Eg10組的表面分子CD80和CD40均與control組相比，無統(tǒng)計學差異(t=1.34、1.53、1.10、1.93，P均>0.05)。但是Eg10 的CD86的表達量高于其它組。各組DC先受到Eg10或HF的作用后，又加入LPS聯(lián)合刺激，顯示Eg10+ LPS和HF+LPS的DC表面分子表達量均不同程度的變化，尤以Eg10組顯著，MHCII和CD40提高，CD86的表達卻降低(表1)。

表1 各組DC表面分子表達%Tab.1 Fluorescence intensities for expression of surface molecular of DC stimulated with different antigens/%

2.4DC吞噬能力測定 發(fā)現(xiàn)Eg10組的吞噬FITC-dextran的能力高于其它各組, 除HF組均有統(tǒng)計學差異(t=3.16、10.56、3.87、8.18,P均<0.05)，聯(lián)合組中由于LPS加入，將Eg10的吞噬能力從25.06%降到18.21%，而對HF的影響更為明顯從21.785降到10.58%(圖3)。

2.5DC形態(tài)學變化 掃描電鏡觀察各組DC發(fā)現(xiàn)Eg10和HF組DC與control組相比，體積稍微增大，細胞表面褶皺增多，但是未見明顯的表面突起。說明Eg10和HF這兩種抗原均不能有效刺激DC成熟，LPS組DC呈現(xiàn)出成熟形態(tài)，表面褶皺明顯增多，突起清晰可見。在聯(lián)合組中通過LPS的加入DC表面呈現(xiàn)出不同的形態(tài)，體積拉長為梭形，Eg10+LPS組尤為明顯，并且可以觀察到細胞表面有突起產(chǎn)生(圖4-A)。各組隨機觀察100個細胞，并對細胞是否有表面突起進行計數(shù)，結(jié)果LPS陽性組表面突起數(shù)目占細胞百分比達到90%，HF、Eg10與control組之間無統(tǒng)計學差異(t=1.29、1.76,P均>0.05)。LPS的加入Eg10和HF組可以促進DC表面突起顯著增多，從18%和21%上提至61%和73%(表2)。同時對各組中含有突起的細胞的突起計數(shù)。結(jié)果與之前描述一致。LPS的加入不僅能夠促進更多的DC表面產(chǎn)生突起，還可以促進突起數(shù)目和長度的增加(表3)。進一步通過透射電鏡對各組DC的超微結(jié)構(gòu)進行觀察，發(fā)現(xiàn)Eg10組細胞內(nèi)的囊泡(vacuolesV)增多，線粒體mitochondria M) 體積增大，略腫脹，電子致密度變淺，同時與LPS組相比，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(rough endoplasmic reticulum RER)的含量明顯減少, 而且排列無規(guī)則。LPS組可以觀察到RER數(shù)目非常多，靠近細胞膜成排排列(圖4-B)。

注：紅色反應(yīng)的是吞噬FITC 右旋多糖的能力, 綠色反應(yīng)的是背景熒光圖3 各組DC吞噬能力的測定Fig.3 Phayocyticability in different DCs group

A. 掃描電鏡觀察不同組DC的形態(tài) B.透射電鏡觀察不同組DC的超微結(jié)構(gòu)圖4 電子顯微鏡觀察不同組DC的形態(tài)Fig.4 Morphology of different groups of DCs observed by electronic microscope

表2 不同組含有樹突的DC與不含樹突的DC數(shù)目的比較(每組隨機選100個DC)Tab.2 Number of DCs with dendrite and the number of DCswithout dendrite of different group comparantive (random selection 100 DCs in each group)

表3 各組含樹突的DC平均所含毛刺的數(shù)目比較(每組選取20個DC)Tab.3 DC with dendrites of different groupscomparative each other (selection 20 DC with dendrites in each group)

2.5T細胞增殖能力的測定 各組DC與T細胞均在1∶10的比例下能促進T細胞增殖。 HF與Eg10組無統(tǒng)計學差異，刺激T細胞增殖能力較弱，顯著低于LPS組，高于control組(圖5-A B)。通過流式檢測T細胞中Treg的含量發(fā)現(xiàn)，Eg10組的Treg的數(shù)目增加，HF組與control組無差異。LPS組略低于control組，也無統(tǒng)計學差異(圖5-C)。

A. DC與T細胞不同比例下，各組T細胞的增殖情況 B. 在1∶10的比例下各組T細胞的增殖能力 C. Treg在CD4+T細胞中所占比例圖5 各組DC對T細胞增殖能力的檢測及Treg細胞的含量檢測Fig.5 Effect of differentiated DCs on T-cell proliferation and Treg cell

2.6各組DC細胞在體內(nèi)的遷移發(fā)現(xiàn)HF組和Eg10組并未見到體內(nèi)有特異性熒光區(qū)域，只有注射了熒光標記細胞的腳墊上存在。除腳墊外的綠色熒光均為皮毛產(chǎn)生的非特異性熒光(圖6-A)。與對照組的ROI的熒光強度無差異(圖6-B)。

A. 不同組小鼠DC遷移能力的檢測;B. 感興趣區(qū)域的平均熒光強度的比較圖6 DC的遷移Fig.6 Migration of DC stimulated with different antigen

2.7各組DC上清中細胞因子含量的測定 HF組分泌大量IL-6和少量的IL-10；不分泌IL-12p70；與LPS聯(lián)合刺激，IL-6、IL-12p70和TNF-α的表達量均有提高，IL-10的表達量則下降。 Eg10組分泌的IL-10的表達量高于其它各組(t=12.32、10.83、9.26、7.80、12.26,P均<0.05)； IL-6的表達量與HF組之間無差異(t=2.035,P>0.05)；IL-12p70與TNF-α 的分泌量高于control組(t=3.93、3.19、3.14、3.42,P均<0.05)和HF組；加入LPS聯(lián)合刺激，IL-6及IL-10的表達量均下降，與之相反TNF-α 的表達量則顯著增高與HF+LPS組無差異, 而IL-12 p70 的分泌量變化不明顯(圖7)。

A. The level of TNF-α in supernatants of DCs B. The level of IL-10 in supernatants of DCs C. The level of 12p70 in supernatants of DCs D. The level of IL-6 in supernatants of DCs‘*’P<0.05, vs. control group;‘&’ P<0.05，vs. HF group;‘$’ P<0.05vs.LPS group；圖7 各組培養(yǎng)DC的上清中細胞因子的含量Fig.7 Expression of cytokines in DCs stimulated with different antigens

3 討 論

當寄生蟲或寄生蟲疫苗進入機體，最先捕獲它們的是DC。DC是目前所知的功能最強大的抗原提呈細胞，在白細胞中所占比例很小。它是連接機體固有免疫和獲得性免疫的橋梁，能很好的平衡免疫耐受和炎癥反應(yīng)[6-7]。研究發(fā)現(xiàn)無論宿主是鼠還是人，寄生蟲或寄生蟲的標志性分子均能直接誘導DC產(chǎn)生免疫反應(yīng)[8]。本研究就采用了細粒棘球絳蟲蟲體自身抗原Eg10和囊液混合抗原HF，觀察他們誘導DC產(chǎn)生的免疫應(yīng)答反應(yīng)。

Eg10是由559 個氨基酸殘基組成，位于原頭節(jié)表面的一種親水性蛋白，與多房棘球絳蟲10具有98.6%的高度同源性[9]，并且與參與真核細胞骨架的質(zhì)膜連接ERM蛋白家族有高同源性，推測其可能與蟲體的生長代謝有關(guān)[10]。

HF在實驗中作為陰性對照的抗原，通過以往的研究發(fā)現(xiàn)HF主要以抑制DC分泌IL-12p70，阻止Th0向Th1型細胞分化，而向Th2型細胞分化，參與寄生蟲逃避[11-12]。

對于優(yōu)化Eg10抗原致敏DC的時間過程中，我們發(fā)現(xiàn)該組DC 20 h的表面分子表達量明顯高于6 h和48 h的DC。推其原因：抗原作用DC 6 h，時間太短，不能很好的致敏DC，所以表達量較低，然而作用48 h，表達量反而下降，考慮是由于DC不能耐受Eg10的長時間作用，否則會導致死亡，數(shù)目減少，表面分子表達量下降。在實際觀察過程中我們已證實這個推測，抗原作用DC 48 h 的時候，培養(yǎng)孔中出現(xiàn)大量的細胞碎片，高倍鏡下可見活細胞中有大量空泡存在，可能是由于細胞內(nèi)很多結(jié)構(gòu)被破壞，同時透射電鏡結(jié)果也顯示，Eg10組DC細胞中囊泡增多，線粒體腫脹等現(xiàn)象。

在用掃描電鏡觀察不同組的DC形態(tài)中，我們觀察到了DC的不成熟，半成熟及成熟形態(tài)[13-14]。DC形態(tài)的不同即反應(yīng)不同的成熟程度，Diaz A發(fā)現(xiàn)不同成熟度的DC會導致其抗原提呈能力及誘導T細胞增殖能力的不同，并誘導不同的免疫反應(yīng)[15-16]。在我們的實驗中發(fā)現(xiàn)了一致的結(jié)果，Eg10和HF誘導DC成熟的能力非常弱，與HF陰性對照組相比，僅僅是增加了細胞表面的褶皺，而對增加細胞表面突起無作用，細胞表面的突起是T與DC之間的傳輸通路，突起的數(shù)目與DC激活T細胞的增殖能力成正相關(guān)[17]。因此它們對T細胞增殖能力無顯著提高，進一步檢測T細胞中Treg的含量，發(fā)現(xiàn)Treg所占比例增高。Treg細胞主要作用抑制固有免疫和獲得性免疫,并可分泌大量的抑制性炎性因子IL-10[18]。同時通過檢測DC上清中細胞因子發(fā)現(xiàn)Eg10組可誘導大量的IL-6, IL-10的產(chǎn)生。尤以IL-10的顯著，甚至高于HF組。它為寄生蟲生長、繁殖、存活提供了很好的環(huán)境，誘導機體產(chǎn)生免疫耐受反應(yīng)[19]。當加入LPS進行聯(lián)合刺激發(fā)現(xiàn)DC的形態(tài)從不成熟狀態(tài)轉(zhuǎn)為細胞兩極為梭形或蝌蚪狀的半成熟形態(tài)。細胞表面突起增加，表面分子MHCII、CD80、CD40上調(diào)，CD86下調(diào)。CD40作為是TNF受體家族中的一員，對DC成熟有促進作用[20]，CD86增高則激活Th2型反應(yīng)[21]，反則亦之。同時IL-10和IL-6的表達量降低，TNF-α含量的上提，均顯示DC的成熟度有所提高。

綜上所述，Eg10不能誘導DC成熟，可產(chǎn)生大量的Th2型細胞因子，提高T細胞中Treg細胞的含量，誘導機體產(chǎn)生Th2型免疫應(yīng)答。

利益沖突：無