張根生，陳曉明，2，黃國忠，陳濟(jì)寬，張紅城，2

（1. 哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150076；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蜜蜂研究所，北京 100093；3. 龍陵縣黃氏蜂業(yè)有限公司，云南 保山 678300）

葫蘆蜂（Vespa velutinaLepeletier）[1]，又叫黃腳胡蜂。原產(chǎn)于中國、印度北部和東南亞的熱帶和亞熱帶地區(qū)，后來引入法國西南部，進(jìn)而在歐洲各國傳播[2]。葫蘆蜂具有很高的資源價(jià)值，體現(xiàn)在很多方面。生態(tài)壞境方面，可以為野生植物傳粉[3]和捕食農(nóng)林害蟲[4]；食用價(jià)值方面，含有豐富的營養(yǎng)素，亦可作為保健食品[5]；藥用價(jià)值方面，葫蘆蜂既具有抗炎作用，又具有抗衰老功效[6]。因此，葫蘆蜂的養(yǎng)殖、生產(chǎn)和銷售產(chǎn)業(yè)鏈正在如火如荼地構(gòu)建，已經(jīng)達(dá)到一定的產(chǎn)業(yè)化規(guī)模。但是，市售的葫蘆蜂幼蟲和蛹通常呈現(xiàn)黃褐色，影響消費(fèi)者的購買欲望。在昆蟲中，多酚氧化酶（PPO） 是誘發(fā)黑化反應(yīng)的主要酶，對于防止病原微生物入侵和傷口愈合至關(guān)重要[7-8]。昆蟲中的多酚氧化酶是3 型含銅蛋白（type 3 copper protein），該蛋白的活性中心有2 個(gè)銅結(jié)合位點(diǎn)，每個(gè)銅結(jié)合位點(diǎn)由3 個(gè)保守的組氨酸螯合銅離子形成[8]。

酶促褐變的控制主要有化學(xué)方法和物理方法2 種?；瘜W(xué)方法按照控制機(jī)理又可分為直接抑制和間接抑制。直接抑制是指抗褐變劑直接作用于PPO 分子，通過螯合PPO 活性中心銅離子而使其失去活性，如高興祥等人[9]用曲酸抑制甜菜夜蛾中的PPO。間接抑制是指抗褐變劑與褐變中間產(chǎn)物或底物反應(yīng)形成絡(luò)合物，從而其避免與PPO 接觸以達(dá)到抑制褐變的目的，如1 mmol/L 半胱氨酸能明顯抑制家蠶中的多酚氧化酶活性[10]。物理方法主要包括熱處理和非熱處理2 種方式。因?yàn)闊崽幚頃?huì)導(dǎo)致營養(yǎng)成分和風(fēng)味的損失，所以越來越多地用非熱處理鈍化PPO。但是非熱處理技術(shù)幾乎沒有應(yīng)用在昆蟲上，而在更加常見的海產(chǎn)品和果蔬上應(yīng)用較多。李秀霞等人[11]利用超高壓鈍化南美白對蝦的多酚氧化酶。結(jié)果表明，鈍化效果隨著超高壓壓強(qiáng)的增大而逐漸增大，超過350 MPa/10 min 超高壓處理能有效鈍化多酚氧化酶活性。肖建等人[12]利用高密度CO2鈍化哈密瓜汁中的PPO，處理后的PPO 酶活最大下降了約79%。

酶促褐變抑制的另外一種延伸就是物理方法結(jié)合化學(xué)方法，如超聲波聯(lián)合抗壞血酸可顯著抑制鮮切蘋果果肉褐變率及多酚氧化酶的活性，抑制率分別高達(dá)46%和98%[13]。單獨(dú)使用蘋果酸（10，20，30 mmol/L） 或超聲波處理都無法有效鈍化PPO，但兩者結(jié)合的鈍化效果明顯強(qiáng)于單獨(dú)使用的效果[14]。這種非熱處理聯(lián)合抗褐變劑的方法能保證食品的感官品質(zhì)和營養(yǎng)價(jià)值，但是幾乎很少用于昆蟲。因此，采用超高壓聯(lián)合抗壞血酸抑制葫蘆蜂幼蟲中的多酚氧化酶，通過SDS 電泳和Native 電泳篩選出多酚氧化酶條帶，并對該條帶做了質(zhì)譜分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葫蘆蜂幼蟲，云南省龍陵縣黃氏蜂業(yè)有限公司提供；二水合磷酸二氫鈉、十二水合磷酸氫二鈉，Sigma 公司提供；鄰苯二酚、L - 抗壞血酸，上海麥克林生化科技有限公司提供；預(yù)染蛋白Maker （NO.26616）、NativeMark （LC0725），美國Thermo Fisher公司提供；NovexR 4- 12%Tris- 甘氨酸凝膠、Novex R Tris- 甘氨酸SDS 上樣緩沖液（2x）、NovexR Tris-甘氨酸Native 上樣緩沖液（2x）、NovexR Tris- 甘氨酸SDS 電泳緩沖液 （10x）、Novex R Tris- 甘氨酸Native 電泳緩沖液（10x），Invitrogen 公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

AL104 型電子天平、SevenEasy 型pH 計(jì)，梅特勒- 托利多儀器（上海） 有限公司產(chǎn)品；Milli- Q Intergral 型超純水一體化系統(tǒng)，美國Merk Millipore公司產(chǎn)品；UP- 250 型超聲波細(xì)胞破碎機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司產(chǎn)品；Sorvall Biofuge Startos型臺(tái)式離心機(jī)、Orbitrap Fusion 質(zhì)譜儀，美國Thermo Fisher 公司產(chǎn)品；SY21- K 型電熱恒溫水浴鍋，北京長風(fēng)儀器儀表公司產(chǎn)品；UV- 2550 型紫外分光光度計(jì)，日本島津公司產(chǎn)品；HPP.W1 系列超高壓設(shè)備，天津華泰森淼生物工程技術(shù)股份有限公司產(chǎn)品；DYY- 6C 型電泳儀，北京市六一儀器廠產(chǎn)品；XCell SureLockTM Mini- Cell and Xcell 型蛋白垂直電泳槽，Invitrogen 公司產(chǎn)品；IKAR C- MAG HP10 型數(shù)顯加熱板，德國IKA 公司產(chǎn)品；TS- 2 型脫色搖床，江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司產(chǎn)品；電泳圖像掃描儀，美國Bio- Rad 公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 PPO 的制備

參照Shi X L 等人[15]制備粗酶液，并稍作修改。取4.0 g 凍存的葫蘆蜂幼蟲樣品，加入20 mL 預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（50 mmol/L，pH 值7，溫度4 ℃） 冰浴研磨，之后迅速放入冰浴的離心管中，然后用超聲波細(xì)胞破碎機(jī)勻漿破碎2 min，勻漿液于4 ℃下浸提30 min 后于4 ℃下以轉(zhuǎn)速10 000 r/min 離心20 min，用16 層紗布過濾，上清液即為粗酶液，于- 80 ℃下備用，測定前冷水浴溶解。

1.3.2 PPO 活力的測定

參照Sadawarte A K 等人[16]的方法并略有改進(jìn)。以鄰苯二酚為底物，將濃度50 mmol/L 磷酸鹽緩沖液2 mL （pH 值6.0） 與濃度20 mmol/L 的鄰苯二酚1 mL混合均勻，于30 ℃下預(yù)熱10 min，然后加入30 ℃預(yù)熱2 min的酶液200 μL，混勻后，于波長420 nm 處每10 s 記錄一次吸光度的變化，連續(xù)記錄90 s。共做3 次平行。最后，酶活力用單位時(shí)間內(nèi)吸光度變化的平均值（ΔA/min） 來表征。

1.3.3 抗壞血酸對PPO 的抑制

體系中依次加入30 ℃預(yù)熱過的濃度50 mmol/L磷酸鹽緩沖液2 mL （pH 值6.0）、濃度20 mmol/L 的鄰苯二酚1 mL、不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)（W/W） 的抗壞血酸100 μL （0，0.08%，0.16%，0.24%，0.32%，0.40%）和酶液200 μL，酶活力測定方法同1.3.2，空白對照組以超純水100 μL 代替抗壞血酸。酶被抗壞血酸處理前后酶活力變化以剩余酶活力表示。

式中：Ax——抗壞血酸處理后的酶活力；

A0——新鮮樣品的酶活力。

1.3.4 抗壞血酸聯(lián)合超高壓對PPO 的抑制

吸取1.2 mL 酶液裝入7 cm×12 cm 的PE 薄膜包裝袋中，用封口機(jī)熱封口。用重物栓將包裝袋放置于超高壓處理釜中，壓強(qiáng)設(shè)為300 MPa，時(shí)間設(shè)為5，10，15，20，25 min。處理后的樣品放入- 80 ℃?zhèn)溆?，測定前冷水浴溶解。反應(yīng)體系中依次加入30 ℃預(yù)熱過的50 mmol/L 磷酸鹽緩沖液2 mL （pH 值6.0）、20 mmol/L 的鄰苯二酚1 mL，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.16%、0.24%的抗壞血酸100 μL 和酶液200 μL，酶活力測定方法同1.3.2，空白對照組以100 μL 超純水代替抗壞血酸。酶被抗壞血酸處理前后酶活力變化以剩余酶活力 表示。

1.3.5 非還原SDS- PAGE 電泳

參照Zhang Y 等人[17]的方法并稍有修改。將粗酶液與等體積的SDS 上樣緩沖液混合均勻，但不加熱也不加還原劑。電泳在恒定電壓（225 V） 下進(jìn)行，直到溴酚藍(lán)前沿開始從凝膠中耗盡。一塊凝膠用考馬斯亮藍(lán)R- 250 染色；另一塊凝膠先在濃度50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 值6.0） 中預(yù)平衡20 min，然后加入濃度10 mmol/L 4- 甲基鄰苯二酚在30 ℃下進(jìn)行活性染色。用電泳圖像掃描儀記錄染色后的結(jié)果。

1.3.6 Native 電泳

參照Del Valle Loto F 等人[18]的方法并稍有修改。將粗酶液與等體積的Native 上樣緩沖液混合均勻。電泳在恒定電壓（225 V） 下進(jìn)行，直到溴酚藍(lán)前沿開始從凝膠中耗盡。一塊凝膠用考馬斯亮藍(lán)R- 250染色；另一塊凝膠切割成2 個(gè)部分，一部分先在濃度50 mmol/L 磷酸鹽緩沖液（pH 值6.0） 中預(yù)平衡20 min，然后加入濃度10 mmol/L 4- 甲基鄰苯二酚在30 ℃下進(jìn)行活性染色。用電泳圖像掃描儀記錄染色后的結(jié)果。另一部分做LC- MS 質(zhì)譜分析，不染色。

1.3.7 LC- MS 質(zhì)譜分析

（1） 蛋白條帶脫色及還原烷基化。將Native 電泳不進(jìn)行染色的條帶按照活性染色染出的條帶同位置進(jìn)行切割，裝于EP 管中。首先，向離心管中加入濃度為0.025 mol/L 的DTT，常溫靜置1h 后將多余的DTT 吸出；再加入無水乙腈，脫去蛋白條帶中多余的水分，反復(fù)操作直至條帶縮小變白；除去多余的無水乙腈并進(jìn)行真空干燥。然后，將蛋白條帶浸沒于濃度為0.055 mol/L的碘乙酰胺中，常溫靜置1 h 后將多余的碘乙酰胺吸出；再加入無水乙腈，脫去蛋白條帶中多余的水分，反復(fù)操作直至條帶縮小變白，除去多余的無水乙腈并進(jìn)行真空干燥。

（2） 蛋白條帶酶解。將烷基化的蛋白條帶浸入25%的甲酸中，然后加入胃蛋白酶，放入4 ℃冰箱中。待蛋白條帶充分吸脹后除去多余酶液，置于37 ℃恒溫箱中消化16 h。將酶解后的肽段用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%三氟乙酸和質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%丙酮的萃取液200 μL 于37 ℃下萃取1 h，收集上清液置于新的EP 管中；重復(fù)萃取2 次，并將收集的上清液合并，最后將上清液經(jīng)真空離心蒸發(fā)濃縮器濃縮至大約40 μL。

（3） 蛋白條帶的質(zhì)譜分析。將收集的上清濃縮液裝入新的EP 管中，于4 ℃下以轉(zhuǎn)速12 000 r/min離心10 min，取上清液30 μL 用于質(zhì)譜分析。儀器為Easy- nLC 1000 與Orbitrap Fusion 質(zhì)譜耦合；色譜柱為Acclaim PepMap C18色譜柱 （100 μm×2 cm，3 μm）；流動(dòng)相A 為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%甲酸的超純水，流動(dòng)相B 為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%甲酸的乙腈；流速為300 nL/min，運(yùn)行時(shí)間為60 min。模式為陽離子模式，Veap 1 900 V；干燥氣溫度為300 ℃；干燥氣流速為2.5 L/min；分液器電壓為65 V；碎裂電壓為175 V。結(jié)果用Protepme Discoverer(Version PD1.4)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)庫比對。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗壞血酸對多酚氧化酶活力的影響

抗壞血酸對多酚氧化酶活力的影響見圖1。

由圖1 可知，抗壞血酸可以顯著抑制葫蘆蜂幼蟲PPO 的活力，不同于核桃扁葉甲[19]對抗壞血酸抑制的不敏感性?？傮w上PPO 活力隨著抗壞血酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)（W/W） 的增加而降低。當(dāng)抗壞血酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.08%時(shí)，PPO 的剩余活力基本沒有變化。但隨著抗壞血酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的進(jìn)一步增加，PPO 的剩余活力則下降明顯。當(dāng)抗壞血酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到0.40%時(shí)，酶活被完全抑制，IC50值為0.190 6%。

抗壞血酸是一種強(qiáng)還原劑，可把中間產(chǎn)物鄰苯二醌還原成鄰二酸和脫氫抗壞血酸，阻止了中間產(chǎn)物進(jìn)一步聚合成黑色素。但是，由于抗壞血酸抑制褐變的途徑并不直接針對于PPO 本身，一旦溶液中的抗壞血酸被消耗殆盡，醌類物質(zhì)又會(huì)重新聚集[20]。因此，抗壞血酸抑制褐變的有效性與溶液中抗壞血酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)直接相關(guān)。

2.2 抗壞血酸對葫蘆蜂pH 值的影響

抗壞血酸對葫蘆蜂幼蟲pH 值的影響見表1。

表1 抗壞血酸對葫蘆蜂幼蟲pH 值的影響

由表1 可知，抗壞血酸能很好抑制葫蘆蜂幼蟲PPO 的活力，但是高質(zhì)量分?jǐn)?shù)的抗壞血酸也會(huì)影響幼蟲的pH 值。表1 顯示抗壞血酸添加量超過0.24%時(shí)，pH 值會(huì)降到6 以下，導(dǎo)致葫蘆蜂系列產(chǎn)品的口感過酸。而且pH 值在等電點(diǎn)附近時(shí)，蛋白質(zhì)溶解性較低。采用堿溶酸沉法測得蛋白等電點(diǎn)大約4.0。因此，綜合以上因素，選取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.16%的抗壞血酸聯(lián)合超高壓進(jìn)行試驗(yàn)。

2.3 抗壞血酸聯(lián)合超高壓對PPO 活力的影響

抗壞血酸聯(lián)合超高壓對PPO 活力的影響見圖2。

由圖2 可知，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.16%的抗壞血酸聯(lián)合超高壓能使葫蘆蜂幼蟲PPO 活性顯著下降。且經(jīng)過超高壓處理的都低于起始時(shí)間的酶活，這表明抗壞血酸聯(lián)合超高壓比單獨(dú)使用抗壞血酸處理效果好。處理5 min 時(shí)，相對酶活降至10.89%；處理10 min時(shí)，相對酶活降至4.26%；處理15 min 時(shí)，剩余酶活僅剩1.47%。

2.4 非還原SDS 電泳及Native 電泳

PPO 的SDS- PAGE 和Native- PAGE 圖見圖3。

非還原性SDS- PAGE 凝膠用考馬斯亮藍(lán)R- 250蛋白染色（圖3 （a）），結(jié)果顯示蛋白條帶集中分布在15～55 kDa，但是這些條帶是彌散帶；另外，在70 kDa 有2 條，120，180，260 kDa 各有1 條明顯的條帶。用4 - 甲基鄰苯二酚染色（圖3 （b）），結(jié)果顯示葫蘆蜂PPO 的分子量約為120 kDa，高于果蠅 （60 kDa）[21]、埃及伊蚊 （50 kDa）[22]和家蠶（81 kDa）[23]。 Native- PAGE 凝 膠 用 考 馬 斯 亮 藍(lán)R- 250 蛋白染色 （圖3 （c）） 結(jié)果與非還原性SDS- PAGE 凝膠條帶分布相似。用4 - 甲基鄰苯二酚染色（圖3 （d）），結(jié)果顯示PPO 的分子量約為720 kDa，表明葫蘆蜂PPO 為亞基120 kDa 的多聚體。

2.5 LC- MS 質(zhì)譜分析鑒定

LC- MS 質(zhì)譜分析圖見圖4。

為精確鑒定PPO，采用LC- MS 進(jìn)行分析。膠上蛋白經(jīng)胃蛋白酶酶解后，將蛋白質(zhì)多肽片段進(jìn)入LC- MS 進(jìn)行質(zhì)譜分析。所得質(zhì)譜結(jié)果經(jīng)NCBI 數(shù)據(jù)庫檢索后， 得出的匹配蛋白為胡蜂屬 （Polistes Canadensis） 的多酚氧化酶 （phenoloxidase 2- like），序列號(hào)為XP_014613621.1，匹配度分值為135.25 分，覆蓋范圍為7.63%。

3 結(jié)論

抗壞血酸能有效抑制葫蘆蜂幼蟲PPO 的活力，剩余酶活隨著抗壞血酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增多而降低，甚至在0.4%時(shí)，酶活被完全抑制?？箟难崧?lián)合超高壓對葫蘆蜂幼蟲PPO 的抑制呈協(xié)同效應(yīng)，幼蟲添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.16%的抗壞血酸，并在壓強(qiáng)300 MPa 處理15 min，PPO 活力基本完全被抑制。通過電泳及質(zhì)譜鑒定，得知葫蘆蜂幼蟲PPO 的蛋白名稱是phenoloxidase 2- like，表觀分子量大約為120 kDa。