周小江，王 瑾，董憲喆，胡 園，劉 屏△

（1. 中國人民解放軍總醫(yī)院臨床藥理研究室，北京 100853； 2. 山西中醫(yī)藥大學，山西 晉中 030619；3. 首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院藥物研究室，北京 100053）

學習記憶能力減退是老年人群常見的退行性疾病，多因年齡增長所致中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙，主要涉及膽堿類神經(jīng)遞質表達異常、自由基損傷、氧化應激和膽固醇代謝紊亂等［1-3］。學習記憶障礙的治療機制可能包括抑制乙酰膽堿的表達、抗氧化、清除自由基、保護神經(jīng)元等多種途徑［4-5］。線粒體是參與能量代謝的主要器官，主要通過氧化磷酸化和調(diào)節(jié)細胞的呼吸功能為腦內(nèi)神經(jīng)元提供能量。學習記憶能力還可能與線粒體的結構和功能正常與否密切相關［6］。開心散源自唐代孫思邈的《備急千金要方》，由人參、茯苓、遠志、石菖蒲組方，是臨床用于益智健腦的基本方，可明顯改善抑郁和癡呆患者的學習記憶能力［7-8］。本研究中探討了開心散對學習記憶能力的改善作用與線粒體結構和功能的關系，為研究其對老年患者學習記憶能力的改善作用機制提供參考?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動物

儀器：Morris 水迷宮（上海移數(shù)信息科技有限公司）；3K15 型低溫離心機（美國Sigma 公司）；ABJ220-4M 型電子天平（KERN&Sohn GMbH 公司，精度為萬分之一）；1420-012 型多功能酶標儀（美國Perkin Elmer 公司）。

試藥：人參（批號為19060304），遠志（批號為19072001），茯苓（批號為19052101），石菖蒲（批號為19052901），均購自北京同仁堂藥材有限公司，經(jīng)中國人民解放軍總醫(yī)院劉屏研究員鑒定為正品；石杉堿甲（上海復旦復華藥業(yè)有限公司，批號為130501）；BCA 蛋白定量試劑盒（普利萊基因技術有限公司）；Cell Titer-G loTM發(fā)光法細胞活力檢測試劑盒（普洛麥格生物技術有限公司）。

動物：5 月齡健康的SPF 級雄性SAMP8 小鼠30 只，SAMR1 小鼠10 只，飼養(yǎng)于SPF 級動物房，均由中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所提供，動物許可證編號為SCXK（京）2019-0010。

1.2 方法

1.2.1 開心散浸膏制備

按處方稱取人參222 g，茯苓222 g，石菖蒲148 g，遠志148 g。人參用60%乙醇加熱回流，提取4 次，每次1 h，提取完后合并提取液，過濾，備用，藥渣備用；石菖蒲加6 倍蒸餾水浸泡12 h，提取揮發(fā)油8 h，再加等量乙醇制成50%油醇溶液，備用；石菖蒲藥渣、人參藥渣與茯苓、遠志加水7.4 L 混合，再提取3 次，每次1 h，合并提取液，濃縮，加50%乙醇，放4 ℃冰箱冷藏，過夜。過夜后過濾提取液，再與人參提取液合并，乙醇回收，濃縮，減壓干燥，即得開心散浸膏提取物。1 g 浸膏粉相當于生藥7.14 g。

1.2.2 動物分組及給藥

10 只SAMR1 小鼠作為對照組（SAMR1 組），30 只SAMP8 雄性小鼠隨機分為模型組（SAMP8 組）、開心散給藥組（KXS 組）和陽性藥組（HupA 組），每組10 只。小鼠正常飼養(yǎng)3 d，適應實驗室環(huán)境后，KXS 組小鼠灌胃給予開心散［按生藥量3.570，1.785，0.892 g/（kg·d）給藥］，HupA 組小鼠灌胃給予石杉堿甲0.05 mg/（kg·d），每日1 次，按每10 g 體質量0.1 mL 給藥，SAMR1 組和SAMP8 組灌胃給予等體積蒸餾水。

1.2.3 Morris 水迷宮定位航行訓練及測試

Morris 水迷宮實驗是用于研究和評價學習記憶的首選經(jīng)典實驗。于安靜、避光環(huán)境里操作，水迷宮是一個黑色圓柱形容器，內(nèi)部放置一個圓形平臺，平臺位于水迷宮的第四象限。小鼠適應環(huán)境3 d 后，開始Morris 水迷宮實驗訓練，共4 d。訓練時，向水迷宮里注入溫水，沒過平臺1～2 cm，再倒入墨汁，避免小鼠能看到平臺。將小鼠從平臺對側象限輕輕放入，同時計時60 s，記錄小鼠從放入水中到爬上平臺所用時間（即逃避潛伏期），如果小鼠60 s 內(nèi)未找到平臺，指引小鼠爬到平臺，并在平臺上停留30 s。訓練結束后，第5 天進行正式實驗，分別記錄每只小鼠的逃避潛伏期、總路程和第三象限路程，如果60 s 內(nèi)小鼠未找到平臺，則潛伏期記為60 s。給藥3 個月后同樣方法進行水迷宮測試。

1.2.4 腦線粒體功能研究

溶液配制：（1）分離緩沖液。250 mmol / L 葡萄糖，10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，0.2% BSA，pH 7.4。分裝后存于-20 ℃。（2）呼吸緩沖液。225 mmol/L葡萄糖，5 mmol/L KH2PO4，10 mmol/L Tris，10 mmol/L KCl，0.2 mmol/L EDTA，100 mg/L BSA，pH 7.4。分裝后存于-20 ℃。（3）復合體Ⅰ底物。2 mol/L 的L-谷氨酸鈉，1 mol/L 的L-蘋果酸，各加入5 μL （1 mL 反應體系），終濃度分別為10 mmol/L 和5 mmol/L。（4）二磷酸腺苷（ADP）。0.05 mol/L 的ADP，加入5 μL（1 mL 反應體系），終濃度為250 μmol/L，分裝后存于-80 ℃。

腦線粒體提?。核詫m測試結束后，使用梯度離心法提取SAMP8 小鼠的腦線粒體［4］。小鼠頸椎脫臼處死，在冰袋上迅速取出腦組織，放入盛有冰冷緩沖液的器皿中，去除小腦、腦干及血管，用緩沖液沖洗3 次，濾紙吸干，稱質量，剪碎。將腦組織碎塊加入預冷的勻漿器中，按10 mL/g 腦組織加預冷的分離緩沖液，冰上手動勻漿10 次，制得勻漿液。4 ℃及700 g 離心10 min，取上清液，以4 ℃及10 000 g 離心10 min，取沉淀，所得沉淀即為線粒體。再往沉淀加分離緩沖液，4 ℃及10 000 g 離心10 min，得到較純凈的線粒體。線粒體沉淀加分離緩沖液制備線粒體懸液，調(diào)節(jié)線粒體蛋白質量濃度至20～25 g/L。整個腦線粒體的提取制備過程應保持低溫，盡量降低腦線粒體的損傷。

腦線粒體呼吸功能測定：使用Clark 氧電極法，檢測各組小鼠腦線粒體呼吸功能。反應條件為水溫30 ℃，反應體系體積1 mL。首先，使用攪拌1 h 的雙蒸水和加無水亞硫酸鈉的雙蒸水分別對電極進行100%和0 氧校正。然后將適量線粒體呼吸介質加入反應體系中2 min 至空氣飽和，加線粒體蛋白1 mg，2 min 后加10 μL 外源反應底物（10 mmol/L 谷氨酸鈉和5 mmol/L蘋果酸的1 ∶1 混合物）測定NADH 呼吸鏈；進入Ⅱ態(tài)呼吸。加5 μL 250 μmol/L ADP，進入Ⅲ態(tài)呼吸；ADP 充分反應后進入Ⅳ態(tài)呼吸。

觀察記錄線粒體氧耗曲線，計算氧化磷酸化各參數(shù)。

磷氧化比值［n（P）/ n（O）］ = n（ADP/nmol）/ n（O/nmol）

Ⅲ態(tài)呼吸速率（V3）= n（O/nmol）/ t（min）/ mprotein（mg）

Ⅳ態(tài)呼吸速率（V4）=n）（O/nmol）/ t（min）/ mprotein（mg）

呼吸控制指數(shù)（RCR）= V3/ V4

氧化磷酸化效率（OPR）= V3× n（ADP）/ n（O）

式中，n（P）為每次加入ADP 的量；n（O）為消耗的氧原子量；t 為時間；mprotein為加入的線粒體蛋白量；V3為加入外源底物和ADP 后的呼吸速率；V4為ADP 耗竭時的呼吸速率。

腦線粒體活性氧（ROS）測定：使用熒光探針（DCFH-DA）測定ROS 含量。DCFH-DA 濃度10 μmol/L，與各線粒體分別混合，孵育60 min，于激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長527 nm 波長處采用酶標儀測定熒光強度。無熒光的DCFH-DA 氧化生成熒光物質DCF 的速率與活性氧含量成正比。

腦線粒體ATP 含量測定：取100 μL 質量濃度為1.0 mg/mL 的線粒體勻漿液，加100 μL Cell Titer-GloTM發(fā)光法細胞活力檢測試劑盒檢測液，放置10 min，采用化學發(fā)光法測定ATP 含量。

腦線粒體膜腫脹度測定：將線粒體加入反應緩沖液，制成質量濃度為250 μg/mL、體積為200 μL 的溶液，搖勻，滴加到酶標板中（25 ℃，520 nm），測定10 min內(nèi)吸光度值的變化，試驗以吸光度的減少值作為線粒體腫脹度的指標。

腦線粒體膜電位測定：小鼠腦線粒體膜電位的測定采用96 孔黑色板，每孔加入1 μL 1 mmol/L Rhodamin123和150 μL 膜電位緩沖液，37 ℃下測定熒光值（激發(fā)波長為503 nm，發(fā)射波長為527 nm），再加入50 μL 線粒體混勻，同條件下檢測腦線粒體攝取后的熒光值。腦線粒體膜電位計算公式如下，（Δψ=61.54log［Rh123］ in/［Rh123］out（37 ℃）［9］。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計學軟件分析，計量資料以均數(shù)±標準差（± s）表示，組間比較采用單因素方差分析（ANOVA）。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 對SAMP8 小鼠學習能力的影響

逃避潛伏期：前4 d 的訓練期中，4 組SAM 小鼠的平均逃避潛伏期均呈下降趨勢，表明各組小鼠尋找平臺的能力在4 d 的學習訓練中均得到了提高。第5 天，SAMP8 組小鼠的逃避潛伏期明顯長于SAMR1 組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；3.570 g/kg 和1.785 g/kg的開心散和石杉堿甲均能顯著降低小鼠的逃避潛伏期，與SAMP8 組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。詳見圖1 A。

平臺所在象限總路程及路程百分比：在前4 d 的訓練期中，各組小鼠的平臺所在象限總路程均呈下降趨勢，表明各組小鼠對于平臺位置的記憶均有提高。第5 天，SAMP8 組小鼠運動總路程長于SAMR1 組，3.570 g/kg 和1.785 g/kg 的開心散和石杉堿甲均能降低小鼠運動的總路程，同時增加SAMP8 組小鼠在平臺所在象限路程的百分比，與SAMP8 組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。詳見圖1 B 及圖1 C。

圖1 開心散對快速老化小鼠逃避潛伏期、平臺所在象限總路程和路程百分比及線粒體功能的影響（ n=10）

2.2 對SAMP8 小鼠線粒體功能的影響

線粒體呼吸功能：與SAMR1 組小鼠相比，SAMP8小鼠Ⅳ態(tài)呼吸耗氧無顯著變化，腦線粒體Ⅲ態(tài)呼吸快速耗氧，呼吸明顯降低，RCR、磷氧化比值（ADP/O）顯著降低（P＜0.05）。1.785 g/kg 的開心散能提高SAMP8小鼠腦線粒體RCR，ADP/O，改善線粒體氧化磷酸化水平和呼吸功能。詳見表1。

表1 開心散對SAMP8 小鼠腦線粒體呼吸功能的影響（ ± s，n=10）

表1 開心散對SAMP8 小鼠腦線粒體呼吸功能的影響（ ± s，n=10）

注：以L-谷氨酸和L-蘋果酸為底物；與SAMR1 組相比，#P ＜0.05；與SAMP8 組相比，*P ＜0.05。

組別SAMR1 組SAMP8 組KXS 組劑量（g/kg）1.785 V3［nmol/ （min·mg）］147±19 105±10#135±23*V4［nmol/（min·mg）］32±3.6 35±4.2 34±3.8 RCR 5.17±0.21 3.96±0.35#4.85±0.26*ADP/O 1.54±0.31 1.17±0.16#1.48±0.43*

線粒體ROS：與SAMR1 組比較，SAMP8 組小鼠腦線粒體的DCF 熒光值明顯增加，提示SAMP8 組小鼠線粒體內(nèi)ROS 含量顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。1.785 g/kg 的開心散能顯著降低SAMP8 組小鼠腦線粒體ROS 含量，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。詳見圖1 D。

線粒體ATP 含量：與SAMR1 組相比，SAMP8 組小鼠腦線粒體中ATP 含量明顯降低（P＜0.01），表明線粒體能量合成減少。1.785 g/kg 的開心散能明顯增加SAMP8 組小鼠腦線粒體ATP 含量，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。詳見圖1 E。

線粒體膜腫脹度：與SAMR1 組相比，SAMP8 組小鼠腦線粒體的膜腫脹度明顯增加（P＜0.01），表明腦線粒體結構受到嚴重損傷。1.785 g/kg 的開心散能顯著降低SAMP8 組小鼠腦線粒體膜腫脹度，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。詳見圖1 F。

線粒體膜電位：與SAMR1 組相比，SAMP8 組小鼠腦線粒體的膜電位顯著降低（P＜0.05），表明線粒體質子泵功能受到影響，結構受到損傷。1.785 g/kg 的開心散能提高SAMP8 組小鼠腦線粒體膜電位，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。詳見圖1 G。

3 討論

學習記憶障礙是老年人常見退行性疾病，是阿爾茲海默癥、抑郁癥等神經(jīng)系統(tǒng)疾病常見的臨床表現(xiàn)。隨著人口老齡化，學習記憶障礙患者人數(shù)也日益增加。研究發(fā)現(xiàn)，線粒體功能障礙及結構損傷、線粒體分布異常、突觸結構和功能損壞，線粒體能量代謝下降均與學習記憶能力下降密切相關［9］。因此，線粒體功能異常可能是引起學習記憶能力下降的一個重要因素。

本研究中采用SAMP8 小鼠研究開心散對SAM 小鼠學習記憶能力和線粒體功能的影響?？焖倮匣Ｐ托∈螅⊿AM）是由日本竹田俊男教授培育出來的一種具備穩(wěn)定老化病態(tài)特征的衰老型小鼠，其中SAMP8 是快速老化系，其學習記憶及認知功能隨著年齡的增長呈快速衰退趨勢，中樞神經(jīng)系統(tǒng)如海馬、皮層等發(fā)生病理改變，SAMP8 被認為是與年齡有關的學習和記憶障礙的一個有用的動物模型［10］。海馬區(qū)是大腦的一個重要區(qū)域，在正常衰老和各種神經(jīng)退行性疾病過程中，海馬與認知能力下降有關［11］。Morris 水迷宮實驗結果顯示，與同月齡SAMR1 相比，SAMP8 小鼠逃避潛伏期更長，總路程更長，平臺所在象限路程百分比更短，表現(xiàn)出SAMP8 小鼠對平臺位置等的記憶不清楚，學習記憶能力障礙。3.570 g/kg 和1.785 g/kg 的KXS 組可顯著縮短SAMP8 小鼠的逃避潛伏期，提高小鼠在平臺所在象限運動路程的百分比，提高小鼠學習記憶能力。2 個質量濃度的開心散對SAMP8 小鼠的逃避潛伏期及運動總路程的影響無顯著差異，故采用1.785 g/kg 的開心散進行線粒體結構和功能的研究。

RCR 是線粒體Ⅲ態(tài)呼吸與Ⅳ態(tài)呼吸的比值，提示線粒體的完整狀況，可衡量氧化磷酸化效率，ADP/O 越接近其理論值，表明生成ATP 的能力越強［12］。本研究結果顯示，開心散可顯著升高SAMP8 小鼠腦線粒體RCR和ADP/O，對SAMP8 小鼠腦線粒體呼吸功能異常有明顯的改善作用。線粒體通透性轉運孔道是線粒體內(nèi)外膜之間的蛋白復合體，通過調(diào)節(jié)基質中的離子和電荷，維持線粒體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，確保氧化磷酸化的正常進行［13］。線粒體膜腫脹度反映了線粒體通透性轉運孔道的開放程度，能直接提示線粒體結構異常［14］。SAMP8 組小鼠腦線粒體膜腫脹度明顯增加，膜電位顯著降低，提示SAMP8 組小鼠線粒體結構受到了嚴重損傷；開心散能有效抑制膜腫脹度，提高膜電位，保證氧化磷酸化的正常進行。線粒體是細胞內(nèi)產(chǎn)生ROS 的最主要結構，因此線粒體也最易因氧化應激而損傷［15］。研究發(fā)現(xiàn)，與SAMP8 組小鼠相比，KXS 組小鼠腦線粒體ATP 合成能力增強，ROS 水平降低。表明開心散可能是通過改善海馬區(qū)細胞內(nèi)線粒體功能障礙改善SAMP8 小鼠學習記憶能力下降的。

綜上所述，開心散可明顯改善SAMP8 組小鼠學習記憶功能障礙和腦線粒體結構功能異常，其作用機制可能是通過降低ROS 損傷、抑制線粒體膜腫脹度、提高線粒體膜電位等途徑，保護線粒體結構功能的完整，確保神經(jīng)細胞有充足的能量完成正常生理功能。