張芬, 余建琴, 張懷念

甲狀腺癌是內(nèi)分泌系統(tǒng)的常見(jiàn)惡性腫瘤,其中乳頭狀甲狀腺癌發(fā)病率最高[1]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的出現(xiàn)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞喪失上皮細(xì)胞特性,促進(jìn)細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移[2-3]。逆轉(zhuǎn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化對(duì)于抑制乳頭狀甲狀腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移和改善患者預(yù)后具有現(xiàn)實(shí)意義。RAS基因已被證實(shí)為參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的促癌基因之一[4],Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物(KRAS)為其關(guān)鍵成員,與多類(lèi)腫瘤的發(fā)病顯著關(guān)聯(lián),如胃癌、結(jié)腸癌、非小細(xì)胞肺癌等[5-7]。與此同時(shí),絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡等進(jìn)程關(guān)聯(lián)密切[8]。然而,在分子靶向治療快速發(fā)展的背景下,KRAS和MAPK1/MAPK3信號(hào)通路是否介導(dǎo)乳頭狀甲狀腺癌的發(fā)病及其調(diào)控機(jī)制目前暫不清晰。本研究通過(guò)臨床檢測(cè)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探究KRAS基因沉默介導(dǎo)MAPK1/MAPK3信號(hào)通路對(duì)乳頭狀甲狀腺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的調(diào)控機(jī)制,以期為乳頭狀甲狀腺癌的診治提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 人乳頭狀甲狀腺癌細(xì)胞株TPC-1(中國(guó)中科院上海細(xì)胞庫(kù));免疫組化和Western blotting抗體(英國(guó)Abcam公司);SP染色試劑盒(中國(guó)福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司);DAB顯色底物(中國(guó)蘇州亞科化學(xué)試劑股份有限公司);10%胎牛血清(FBS)、DMEM培養(yǎng)基、培養(yǎng)箱(中國(guó)上海碧云天生物技術(shù)有限公司);Lipofectamin 2000試劑盒(美國(guó)英杰生命技術(shù)有限公司);Trizol試劑(美國(guó)生命技術(shù)公司);PrimeScript RT試劑盒(中國(guó)大連寶生物工程有限公司);熒光定量PCR儀(美國(guó)伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司);BCA蛋白定量試劑盒(美國(guó)西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司);ECL反應(yīng)液(美國(guó)密理博公司);Gel-Pro Analyzer 4.0(美國(guó)Media Cybernetics公司);倒置相差顯微鏡(日本奧林巴斯光學(xué)公司)。

1.2 研究對(duì)象 收集武漢大學(xué)中南醫(yī)院2015年1月至2017年1月接受甲狀腺切除手術(shù)的80例乳頭狀甲狀腺癌的癌組織及距離腫瘤邊緣>2 cm的癌旁組織。所有患者均經(jīng)病理及影像學(xué)檢查明確診斷,且所有患者術(shù)前均未行任何抗腫瘤治療。80例患者中男32例,女48例。年齡29～79(49.3±8.3)歲。將采集的新鮮病理組織標(biāo)本快速冷凍于液氮中,-80 ℃低溫保存?zhèn)溆?。本研究?jī)?nèi)容經(jīng)過(guò)武漢大學(xué)中南醫(yī)院倫理委員會(huì)審批,且所有患者均知情同意。

1.3 免疫組化檢測(cè)KRAS蛋白陽(yáng)性表達(dá)情況 將腺癌和癌旁組織連續(xù)切片(厚4 μm),然后貼于載玻片上于68 ℃烤箱烤20 min。二甲苯和乙醇梯度脫水后,滴入3%H2O2后放入37 ℃孵育箱。消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性,PBS洗滌切片。甩干后抗原熱修復(fù)2次,滴加10%山羊血清封閉15 min。加入一抗鼠抗人KRAS單克隆抗體,置于4 ℃冰箱過(guò)夜;并加入生物素進(jìn)行標(biāo)記的山羊抗鼠克隆IgG二抗,置于37 ℃恒溫箱,30 min。使用SP染色試劑盒,按照說(shuō)明書(shū)染色10～15 min。DAB顯色3 min,流水沖洗3 min;蘇木素復(fù)染3 min,蒸餾水沖洗5 min×3次,上述梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹(shù)膠進(jìn)行封片。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng) 人乳頭狀甲狀腺癌細(xì)胞株TPC-1復(fù)蘇后用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)在5%CO2、37 ℃、飽和濕度的培養(yǎng)箱中。每24小時(shí)更換培養(yǎng)液,每72小時(shí)進(jìn)行一次傳代。去除培養(yǎng)液,PBS洗2次,0.25%胰酶消化3 min,加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液終止消化,用移液槍輕輕吹打細(xì)胞成單細(xì)胞懸液。

1.5 細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染 將TPC-1細(xì)胞系分為6組:空白組(未轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒,PBS處理)、NC組(轉(zhuǎn)染陰性對(duì)質(zhì)粒)、siRNA-KRAS組(轉(zhuǎn)染siRNA-KRAS質(zhì)粒)、SCH772984組(MAPK1/MAPK3信號(hào)通路抑制劑處理)、茴香霉素(Anisomycin)組(MAPK1/MAPK3信號(hào)通路激動(dòng)劑處理)、siRNA-KRAS+Anisomycin組(轉(zhuǎn)染siRNA-KRAS質(zhì)粒+MAPK1/MAPK3信號(hào)通路激動(dòng)劑處理)。將TPC-1細(xì)胞以3×105/孔的密度接種于6孔板中,用新鮮完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至細(xì)胞融合度接近50%～80%時(shí),使用Lipofectamin 2000試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)染。置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),6 h后更換成完全培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,收集細(xì)胞。

1.6 qRT-PCR檢測(cè)KRAS、C-jun氨基末端激酶(JNK)、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶1(ERK1)、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶2(ERK2)、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、波形纖維蛋白(Vimentin)及E盒結(jié)合鋅指蛋白1(ZEB1) mRNA水平 用Trizol試劑提取組織和細(xì)胞總RNA后,按照PrimeScript RT試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,4 ℃保存。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增,用分析軟件iQ5進(jìn)行定量分析,PCR反應(yīng)體系:上游下游引物(10 μmol/L)各0.6 μl、cDNA溶液1 μl、SYBR Green I Master 10 μl、dH2O 7.8 μl。反應(yīng)條件:95 ℃,10 min,1個(gè)循環(huán);PCR反應(yīng)95 ℃,15 s;60 ℃,1 min,40個(gè)循環(huán)。KRAS、JNK、ERK1、ERK2、E-cadherin、Vimentin、ZEB1及U6引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成,以U6基因作為內(nèi)參,引物序列見(jiàn)表1。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。此方法同樣適用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

表1 各基因的PCR引物序列

1.7 Western blotting檢測(cè)KRAS、JNK、磷酸化JNK (p-JNK)、ERK1、磷酸化ERK1(p-ERK1)、ERK2、磷酸化ERK2(p-ERK2)、E-cadherin、Vimentin及ZEB1蛋白表達(dá)水平 使用含PMSF的RIPA裂解液提取組織和細(xì)胞中總蛋白,冰上孵育30 min,12 000 r/min、4 ℃離心10 min,取上清至1.5 ml EP管中,按照BCA蛋白定量試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定蛋白濃度。調(diào)整每個(gè)泳道上樣量大約為20 μg。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳:采用10%分離膠和5%積層膠,調(diào)整相應(yīng)電泳電壓分別為120 V和60 V,總計(jì)電泳時(shí)間約為2 h。后進(jìn)行15 V半干轉(zhuǎn)10 min,5%脫脂牛奶-TBST封閉1 h。棄去封閉液PBS洗滌5 min,以GAPDH多克隆抗體作為內(nèi)參,稀釋KRAS、JNK、p-JNK、ERK1、p-ERK1、ERK2、p-ERK2、E-cadherin、Vimentin和ZEB1,4 ℃孵育過(guò)夜;后滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠克隆抗體IgG二抗,室溫孵育1 h。將膜浸入ECL反應(yīng)液中顯色,暗盒曝光后顯影;用圖像分析軟件Gel-Pro Analyzer 4.0對(duì)圖像進(jìn)行灰度分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 獲得各組穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株后,將細(xì)胞置于37 ℃,5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72 h后,于倒置相差顯微鏡下觀察各組細(xì)胞株細(xì)胞表型的變化并攝像,以較不同轉(zhuǎn)染組上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化時(shí)細(xì)胞形態(tài)的改變。

2 結(jié)果

2.1 癌組織與癌旁組織中相關(guān)基因和蛋白表達(dá)情況

與癌旁組織相比,乳頭狀甲狀腺癌組織中的KRAS、JNK、ERK1、ERK2、Vimentin和ZEB1的mRNA水平也明顯上調(diào);且KRAS、JNK、p-JNK、ERK1、p-ERK1、ERK2、p-ERK2、Vimentin和ZEB1的蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào);而E-cadherin的mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)(均P<0.05，圖1,表2、3)。免疫組化顯示,KRAS蛋白陽(yáng)性細(xì)胞為棕黃色顆粒(圖2),KRAS蛋白在乳頭狀甲狀腺癌組織的陽(yáng)性表達(dá)率為63.75%(51/80),明顯高于癌旁組織中的36.25%(29/80),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.068,P<0.05)。

圖1 癌組織與癌旁組織中KRAS、E-cadherin、Vimentin、ZEB1、MAPK1/MAPK3信號(hào)通路相關(guān)基因的Western blotting電泳條帶結(jié)果

表2 癌組織與癌旁組織中KRAS、JNK、ERK1、ERK2、E-cadherin、Vimentin、ZEB1 mRNA表達(dá)水平比較

表3 癌組織與癌旁組織中KRAS、E-cadherin、Vimentin、ZEB1、MAPK1/MAPK3信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平

圖2 KRAS蛋白的免疫組化檢測(cè)結(jié)果(SP法×400)

2.2 KRAS介導(dǎo)MAPK1/MAPK3信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá) 空白組和NC組信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)水平均無(wú)明顯差異(P>0.05)。與空白組和NC組相比,siRNA-KRAS組的KRAS、JNK、ERK1、ERK2的mRNA水平下調(diào),且KRAS、JNK、p-JNK、ERK1、p-ERK1、ERK2、p-ERK2蛋白表達(dá)下調(diào)(均P<0.05)。Anisomycin組的JNK、ERK1、ERK2的mRNA和蛋白表達(dá)水平上調(diào),且p-JNK、p-ERK1和p-ERK2蛋白表達(dá)水平上調(diào)(P<0.05);KRAS基因表達(dá)水平無(wú)明顯差異(P>0.05)。siRNA-KRAS+Anisomycin組的KRAS基因表達(dá)下調(diào)(P<0.05);而JNK、p-JNK、ERK1、p-ERK1、ERK2、p-ERK2檢測(cè)水平無(wú)明顯差異(P>0.05)。同時(shí),SCH772984組JNK、ERK1、ERK2的mRNA和蛋白表達(dá)水平下調(diào),且p-JNK、p-ERK1和p-ERK2蛋白表達(dá)水平下調(diào)(P<0.05);KRAS基因表達(dá)水平無(wú)明顯差異(P>0.05),見(jiàn)圖3,表4、5。

圖3 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞中MAPK1/MAPK3信號(hào)通路相關(guān)蛋白的Western blotting電泳條帶結(jié)果

表4 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞中MAPK1/MAPK3信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)水平比較

表5 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞中MAPK1/MAPK3信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較

2.3 KRAS介導(dǎo)MAPK1/MAPK3信號(hào)通路影響乳頭狀甲狀腺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)基因表達(dá) 空白組與NC組的細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)基因Vimentin、E-cadherin和ZEB1表達(dá)均無(wú)明顯差異(P>0.05);與空白組和NC組相比,siRNA-KRAS組和SCH772984組的E-cadherin表達(dá)明顯增多,Vimentin和ZEB1表達(dá)明顯降低(均P<0.05);Anisomycin組的E-cadherin表達(dá)明顯降低,Vimentin和ZEB1表達(dá)明顯增多(均P<0.05),siRNA-KRAS+Anisomycin組Vimentin、E-cadherin和ZEB1表達(dá)無(wú)明顯差異(P>0.05),見(jiàn)圖4,表6、7。

圖4 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白的Western blotting電泳條帶結(jié)果

表6 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)水平比較

表7 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白的表達(dá)水平比較

2.4 KRAS介導(dǎo)MAPK1/MAPK3信號(hào)通路促進(jìn)乳頭狀甲狀腺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化 空白組和NC組細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化表型變化均無(wú)明顯差異,細(xì)胞呈圓形或類(lèi)圓形鋪路石排列,細(xì)胞連接緊密;與空白組和NC組相比,siRNA-KRAS+Anisomycin組的細(xì)胞從圓形或類(lèi)圓形鋪路石狀上皮細(xì)胞形態(tài)向梭形、紡錘形間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變不明顯,且細(xì)胞間黏附改變和細(xì)胞集落形成亦不明顯;siRNA-KRAS組和SCH772984組的細(xì)胞從梭形、紡錘形間質(zhì)細(xì)胞樣形態(tài)向圓形或類(lèi)圓形鋪路石狀上皮細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變,且細(xì)胞間黏附增多,有團(tuán)簇狀聚集現(xiàn)象,細(xì)胞集落形成增多;而Anisomycin組大量細(xì)胞從圓形或類(lèi)圓形鋪路石狀上皮細(xì)胞形態(tài)向梭形、紡錘形間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變,且細(xì)胞間黏附顯著變少,細(xì)胞集落形成也顯著減少,見(jiàn)圖5。

圖5 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化細(xì)胞形態(tài)比較(×200)

3 討論

細(xì)胞對(duì)外界環(huán)境變化的反應(yīng)離不開(kāi)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的介導(dǎo)[9]。MAPK存在于大多數(shù)細(xì)胞內(nèi),是研究最為深入的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之一,其通過(guò)對(duì)基因的轉(zhuǎn)錄和調(diào)控影響細(xì)胞的生物學(xué)行為(增殖、分化、轉(zhuǎn)移、凋亡等),進(jìn)而廣泛參與腫瘤進(jìn)程[10]。同時(shí),KRAS基因是RAS原癌基因家族成員,其突變過(guò)表達(dá)常見(jiàn)于惡性腫瘤[11]。鑒于此,本研究假設(shè)通過(guò)RNA干擾措施沉默原癌基因KRAS的表達(dá),探討是否可通過(guò)調(diào)控MAPK1/MAPK3信號(hào)通路,進(jìn)而在乳頭狀甲狀腺癌中發(fā)揮一定的抑癌作用。

本研究分為臨床組織實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)兩部分。在臨床組織實(shí)驗(yàn)中,應(yīng)用qRT-PCR、Western blotting及免疫組化法分析癌組織與癌旁組織中相關(guān)基因表達(dá)情況,結(jié)果顯示癌組織中的KRAS陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于癌旁組織;且癌組織中的KRAS、JNK、ERK1、ERK2、Vimentin和ZEB1的mRNA和蛋白水平明顯高于癌旁組織,而E-cadherin的mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯低于癌旁組織。提示KRAS在乳頭狀甲狀腺癌中扮演原癌基因的作用,同時(shí)該類(lèi)腫瘤患者中可能存在MAPK1/MAPK3信號(hào)通路以及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的異常激活。為探究KRAS基因沉默及MAPK1/MAPK3信號(hào)通路在乳頭狀甲狀腺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的調(diào)控機(jī)制,本細(xì)胞實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建KRAS基因過(guò)表達(dá)和沉默表達(dá),以此揭示KRAS基因作為乳頭狀甲狀腺癌的作用靶點(diǎn)之一,是否可介導(dǎo)該腫瘤的發(fā)病。

本研究首先驗(yàn)證KRAS是否可介導(dǎo)MAPK1/MAPK3信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)沉默KRAS基因表達(dá)處理后,KRAS、JNK、ERK1、ERK2的mRNA水平下調(diào),且KRAS、JNK、p-JNK、ERK1、p-ERK1、ERK2、p-ERK2蛋白表達(dá)下調(diào)。而沉默KRAS基因表達(dá)結(jié)合MAPK1/MAPK3信號(hào)通路激活劑(Anisomycin)處理,導(dǎo)致KRAS基因表達(dá)下調(diào)[12];而JNK、p-JNK、ERK1、p-ERK1、ERK2、p-ERK2檢測(cè)水平無(wú)明顯差異。說(shuō)明沉默KRAS基因表達(dá)可抑制該信號(hào)通路的激活。與此同時(shí),Anisomycin組和SCH772984組的KRAS基因表達(dá)水平無(wú)明顯差異,前組表達(dá)上調(diào),后組表達(dá)水平下調(diào),提示該信號(hào)通路激活或抑制轉(zhuǎn)染的有效。同時(shí),鑒于JNK、ERK1、ERK2表達(dá)水平的變化,筆者認(rèn)為MAPK1/MAPK3信號(hào)通路的激活或抑制亦有可能影響JNK和ERK信號(hào)通路,具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

確認(rèn)KRAS與MAPK1/MAPK3信號(hào)通路的關(guān)系后,本研究進(jìn)一步檢測(cè)KRAS介導(dǎo)MAPK1/MAPK3信號(hào)通路對(duì)乳頭狀甲狀腺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響。qRT-PCR和Western blotting檢測(cè)各組細(xì)胞中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志物Vimentin、E-cadherin和ZEB1的表達(dá)。結(jié)果顯示,與空白組和NC組相比,siRNA-KRAS+Anisomycin組的Vimentin、E-cadherin和ZEB1表達(dá)無(wú)明顯差異;siRNA-KRAS組和SCH772984組的E-cadherin表達(dá)明顯增多,Vimentin和ZEB1表達(dá)明顯降低;而Anisomycin組的E-cadherin的表達(dá)明顯降低,Vimentin和ZEB1表達(dá)明顯增多。提示沉默KRAS基因表達(dá)和抑制MAPK1/MAPK3信號(hào)通路激活均可抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,表現(xiàn)在Vimentin、E-cadherin和ZEB1表達(dá)的異常變化[13-14]。同時(shí),本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步采用光學(xué)顯微鏡觀察法,以期佐證沉默KRAS基因表達(dá)抑制MAPK1/MAPK3信號(hào)通路激活對(duì)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的抑制作用。結(jié)果顯示,空白組和NC組細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化表型變化均無(wú)明顯差異,細(xì)胞呈圓形或類(lèi)圓形鋪路石排列,細(xì)胞連接緊密;siRNA-KRAS+Anisomycin組細(xì)胞從圓形或類(lèi)圓形鋪路石狀上皮細(xì)胞形態(tài)向梭形、紡錘形間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變不明顯,且細(xì)胞間黏附改變和細(xì)胞集落形成亦不明顯;siRNA-KRAS組和SCH772984組細(xì)胞從梭形、紡錘形間質(zhì)細(xì)胞樣形態(tài)向圓形或類(lèi)圓形鋪路石狀上皮細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變,且細(xì)胞間黏附增多,有團(tuán)簇狀聚集現(xiàn)象,細(xì)胞集落形成增多;而Anisomycin組大量細(xì)胞從圓形或類(lèi)圓形鋪路石狀上皮細(xì)胞形態(tài)向梭形、紡錘形間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變,且細(xì)胞間黏附顯著變少,細(xì)胞集落形成也顯著減少。

綜上所述,KRAS基因在乳頭狀甲狀腺癌中呈高表達(dá),沉默KRAS基因表達(dá)可抑制MAPK1/MAPK3信號(hào)通路,從而抑制乳頭狀甲狀腺癌的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。