甘椿椿 黃金玉 賈 彬 魏曉鵬▲

1.衢州職業(yè)技術(shù)學院，浙江衢州 324000；2.天津醫(yī)科大學藥學院 天津市市級藥學實驗教學示范中心，天津 300070

藤梨根為中華獼猴桃（actinidia chinensis planch）的根，為獼猴桃科獼猴桃屬植物。臨床上以單方或復(fù)方用于胃癌[1]、肺癌、卵巢癌、乳房癌[2]、肝癌[3]、直腸癌[4]等癌癥以及慢性胃炎[5]、肝炎[6]、慢性前列腺炎[7]等疾病的治療?，F(xiàn)代藥理學研究結(jié)果表明，藤梨根具有抗腫瘤[8-12]、抗病毒[13]、抗氧化[14]、保護肝臟[15]等作用。在現(xiàn)有的文獻報道中對藤梨根抗腫瘤轉(zhuǎn)移方面的研究較少，本實驗對藤梨根95%乙醇提取物進行了體外抗MDA-MB-231腫瘤細胞轉(zhuǎn)移活性的篩選，結(jié)果顯示其具有較強的抗腫瘤轉(zhuǎn)移活性。

1 資料與方法

1.1 儀器

細胞培養(yǎng)箱（37℃，5%CO2，Thermo Fisher Scientific公司）；超凈生物工作臺（上海智誠分析儀器制造有限公司）；BIOTEX全自動酶標板分析儀（美國博騰科技公司）；CKX41倒置顯微鏡（Olympus公司）；BioDoc凝膠成像系統(tǒng)（美國UVP公司）；垂直電泳儀，電泳槽（美國伯樂公司）；脫色搖床（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；酶標板（Nest公司）；Transwell小室（美國康寧公司）。

1.2 細胞

人乳腺癌細胞MDA-MB-231（中國科學院上海細胞庫）。

1.3 試劑與藥品

RPMI-1640培養(yǎng)液（碧云天生物技術(shù)有限公司）；胎牛血清（FBS），PBS（HyClone）；四甲基偶氮唑鹽（MTT）（Sigma）；25%（含EDTA）胰蛋白酶（Bioind）；二甲基亞砜（碧云天生物技術(shù)有限公司）；所用試劑均為分析純。藤梨根藥材于2018年7月采自浙江衢州，由衢州瑞草堂醫(yī)藥有限公司汪建剛主任中藥師鑒定，標本（B20180720）存放于衢州瑞草堂醫(yī)藥有限公司。

1.4 藤梨根95%乙醇提取物的制備

有機溶解回流提取：稱取干燥粉碎的藤梨根藥材10kg，加入5倍量95%的乙醇加熱回流提取2h，用紗布過濾提取液，如上方法提取共計3次，合并提取液，減壓濃縮，65℃真空干燥箱干燥過夜得粉末狀樣提取物403g。使用時，藤梨根提取物用DMSO溶解成高濃度儲備液，用培養(yǎng)液稀釋成稀釋制得設(shè)定濃度。

1.5 MTT法

用0.25%的胰酶消化MDA-MB-231細胞，用培養(yǎng)液（含10% FBS）配成細胞懸液，以每孔1×104個細胞接種到96孔板，每孔體積為200μL。置于37℃，5% CO2的孵箱內(nèi)培養(yǎng)24h，24h后加入不同濃度的藤梨根提取物，繼續(xù)培養(yǎng)48h。之后每孔加5mg/mL的MTT 15μL，繼續(xù)孵育4h，終止培養(yǎng)，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加150μL DMSO，振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解，酶標儀測定490nm處各孔吸光度。抑制率（%）=[1-（加藥組OD值/空白組OD值）]×100%。

1.6 劃痕實驗

取對數(shù)生長期細胞，0.25%胰酶消化液消化后，收集離心，用無血清RPMI-1640培養(yǎng)液重懸細胞，調(diào)整細胞濃度，5×105個/每孔接種于6孔板中；待細胞長至完全融合后，用10μL tip槍頭用力均勻地在培養(yǎng)皿中劃痕，PBS清洗2次，沿劃痕邊緣等距離間隔做上標記，以便檢測；換液后分別用不同濃度藤梨根提取物處理24h；將6孔板置于倒置顯微鏡下，觀察劃痕愈合程度并拍照，利用IPPWIN60測量細胞遷移距離，隨后進行統(tǒng)計學分析。

1.7 Transwell實驗

取對數(shù)生長期細胞，0.25%胰酶消化液消化，收集離心，5×104個/每孔接種于6孔板中，加不同濃度的藤梨根提取物處理24h，用無血清RPMI-1640培養(yǎng)液重懸細胞，1000rpm，離心5min。無血清RPMI-1640重懸細胞，調(diào)整細胞濃度為5×105個/mL。下室加入5ng/mL的EGF，500μL/孔，上室加入不同濃度化合物處理的細胞懸液200μL，將Transwell小室在37℃，5% CO2的孵箱內(nèi)孵育4h，棉簽刮去上層細胞，PBS洗滌2次，4%甲醛溶液固定，蘇木精染色，PBS洗滌2次，晾干，顯微鏡下拍照，統(tǒng)計細胞個數(shù)，觀察穿過細胞數(shù)。

1.8 明膠酶譜法

取對數(shù)生長期細胞，計數(shù)后接種于6孔板中，每孔中細胞數(shù)目相同，置于37℃，5% CO2的孵箱內(nèi)培養(yǎng)24h，分別加入終濃度為1、10、50μg/mL藤梨根提取物藥液（預(yù)先用不含血清的RPMI-1640培養(yǎng)基配制）。相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)48h后，收集上清液，測定蛋白濃度（考馬斯亮藍法），稀釋至相同蛋白濃度。凝膠制備與電泳分離方法參考文獻[16-17]。MMP-9的活性用與對照組比較灰度值的百分比表示。

1.9 統(tǒng)計學處理

所有實驗結(jié)果數(shù)據(jù)均用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以（）表示，采用兩獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT實驗結(jié)果

不同濃度藤梨根95%乙醇提取物對人乳腺癌細胞MDA-MB-231的細胞增殖抑制作用如圖1，藤梨根95%乙醇提取物濃度為500μg/mL時能夠明顯抑制MDA-MB-231細胞的增殖，顯示出一定的細胞毒性，在100μg/mL濃度以下沒有細胞毒作用，對MDA-MB-231細胞的增殖沒有影響，從而確定非細胞毒劑量。

圖1 藤梨根提取物對MDA-MB-231細胞增殖的影響

2.2 劃痕實驗結(jié)果

測定0.01、0.1、1、10、50μg/mL 5個濃度藤梨根95%乙醇提取物在非細胞毒劑量下體外對乳腺癌MDA-MB-231細胞遷移的影響。藤梨根提取物能夠明顯抑制MDA-MB-231細胞的遷移，并呈一定劑量依賴性，其IC50值為14.222μg/mL。見圖2。

圖2 藤梨根提取物對MDA-MB-231細胞遷移的影響

2.3 Transwell實驗結(jié)果

進一步采用Transwell實驗，測定0.01、0.1、1、10、50μg/mL 5個濃度藤梨根95%乙醇提取物對人乳腺癌MDA-MB-231細胞侵襲的影響。藤梨根95%乙醇提取物能夠明顯抑制MDA-MB-231細胞的侵襲，并呈一定劑量依賴性，IC50值為16.973μg/mL。見圖3。

圖3 藤梨根提取物對MDA-MB-231細胞侵襲的影響

2.4 明膠酶譜法實驗結(jié)果

明膠酶譜法實驗測定藤梨根95%乙醇提取物對MDA-MB-231細胞分泌MMP-9活性影響，與空白對照組相比，藤梨根95%乙醇提取物能夠顯著抑制MDA-MB-231細胞分泌的MMP-9活性，且存在一定的劑量依賴性。見圖4。

圖4 藤梨根提取物對MDA-MB-231細胞分泌MMP-9活性影響

3 討論

為了研究藤梨根提取物抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用，同時排除由于細胞毒作用對MDA-MB-231細胞的影響，采用MTT實驗檢測，確定藤梨根95%乙醇提取物非細胞毒劑量，在非細胞毒劑量前提下，測定不同濃度藤梨根95%乙醇提取物對人乳腺癌MDAMB-231細胞遷移、趨化、分泌MMP-9活性的影響。

腫瘤轉(zhuǎn)移指癌細胞從原發(fā)腫瘤脫落、遷移、粘附、浸潤進入血液或淋巴管，然后外滲二次進入組織的血液循環(huán)，并擴散至轉(zhuǎn)移開始的地方[18-19]，涉及多個步驟，是一個十分復(fù)雜的過程，其中，腫瘤細胞的遷移和基底膜的降解是非常重要的組成部分。劃痕實驗結(jié)果顯示藤梨根95%乙醇提取物能夠顯著抑制MDA-MB-231細胞的遷移，趨化運動能力，這提示了藤梨根提取物能夠在腫瘤細胞開始轉(zhuǎn)移的趨化遷移方面發(fā)揮抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用。

細胞外基質(zhì)（ECM）主要是由膠原帶白、蛋白聚糖、彈性蛋白、和細胞外基質(zhì)糖蛋白構(gòu)成的大分子物質(zhì)，是細胞生存的重要內(nèi)環(huán)境，也是阻止腫瘤轉(zhuǎn)移的第一道生物屏障?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMP）是金屬離子與細胞外蛋白酶結(jié)合而成的肽鏈內(nèi)切酶，其主要作用是降解ECM和細胞之間黏著蛋白。腫瘤發(fā)生侵襲時，腫瘤細胞與基底膜表面受體結(jié)合分泌MMP，破壞腫瘤細胞周圍的基質(zhì)分子，打開阻止腫瘤轉(zhuǎn)移的物理屏障，便于腫瘤細胞向外生長[20]。MMP-9是可溶性MMP家族中的重要一員，可以降解破壞細胞外基質(zhì)中W、V型膠原蛋白，其與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成密切相關(guān)[21-22]，MMP-9的表達能促進細胞的侵襲與轉(zhuǎn)移[23-24]。明膠酶譜法實驗結(jié)果表明，藤梨根95%乙醇提取物可降低人乳腺癌MDA-MB-231細胞分泌的MMP-9活性。提示藤梨根提取物通過抑制腫瘤細胞分泌MMP-9發(fā)揮抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用。

綜上所述，藤梨根提取物具有顯著的抗腫瘤轉(zhuǎn)移的活性，其作用機制與抑制腫瘤細胞的遷移，趨化運動和侵襲有關(guān)。以上研究為中藥藤梨根的現(xiàn)代應(yīng)用提供了實驗依據(jù)。