楊煥麗，賈澤博，梁曉萍，王菲，張瑞

1咸陽市中心醫(yī)院，陜西咸陽 712000；2西安醫(yī)學(xué)院

目前胃癌的發(fā)病率居惡性腫瘤第5位，病死率居第3位，嚴(yán)重影響人們的生命健康[1]。早期胃癌患者的預(yù)后較好，且治愈率較高[2]。而中晚期胃癌患者預(yù)后較差，易發(fā)生遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，導(dǎo)致患者的生存期縮短，因此提高早期胃癌的檢出率對于胃癌患者的治療及預(yù)后改善尤為重要[3]。目前對胃癌的發(fā)病機(jī)制仍缺乏了解，已有研究顯示，在胃癌發(fā)病過程中多種微小RNA(miRNA)表達(dá)異常[4]。miRNA是在細(xì)胞內(nèi)廣泛存在的微小RNA分子，通過堿基互補(bǔ)配對與基因的mRNA結(jié)合并促進(jìn)其降解，從而導(dǎo)致基因表達(dá)下降[5]。微小RNA-20a(miR-20a)在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均有分布，在乳腺癌和肺癌中表達(dá)上調(diào)，與腫瘤細(xì)胞的增殖和細(xì)胞周期進(jìn)程密切相關(guān)[6,7]。miR-22主要分布于細(xì)胞核中，在腸癌和宮頸癌中表達(dá)下調(diào)，與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移聯(lián)系密切[8,9]。研究顯示，乳腺癌中miR-20a和miR-22表達(dá)有一定關(guān)系，并在乳腺癌手術(shù)患者的預(yù)后診斷中有重要意義[6]。但兩者在胃癌中的研究較少。2018年2月—2019年2月,我們觀察了血清miR-22、miR-20a在胃癌中的水平變化，并探討其意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2018年2月—2019年2月我院診治的90例胃癌患者(胃癌組)。納入標(biāo)準(zhǔn)：均為首次發(fā)??；病理學(xué)確診為胃癌；入院前未接受過放化療治療和抗炎治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并存在其他類型腫瘤；存在全身性炎癥反應(yīng)；肝腎功能異常；存在自身免疫性疾病。同時選擇同期在我院進(jìn)行體檢的90例健康者作為對照組。胃癌組男50例、女40例，年齡34～78(61.73±11.24)歲。對照組男51例、女39例，年齡33～79(61.29±10.87)歲。兩組性別比例、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。胃癌組腫瘤直徑≤5 cm 48例，>5 cm 42例；浸潤深度達(dá)黏膜層54例，黏膜下層36例；低分化31例，中分化35例，高分化24例；28例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，62例無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；TNM分期為Ⅰ期34例，Ⅱ期30例，Ⅲ期16例，Ⅳ期10例。本研究通過咸陽市中心醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。入組人員均與院方簽署知情同意書。

1.2 血清miR-20a、miR-22水平檢測 于清晨抽取兩組空腹肘靜脈血5 mL，室溫靜置30 min，5 000 r/min離心30 min，保留上清液并將其凍存于-80 ℃保存，待所有血清樣本收集結(jié)束后進(jìn)行統(tǒng)一檢測。血清miRNA提取采用血清miRNA提取試劑盒(新?；驒z測有限公司)，按照試劑盒說明書完成操作。miR-20a、miR-22水平檢測采用RT-PCR法，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國賽默飛世爾生物科技有限公司)將提取得到的miRNA逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，用實(shí)時熒光定量PCR試劑盒(美國賽默飛世爾生物科技有限公司)對miR-20a和miR-22的表達(dá)量進(jìn)行檢測，配套使用熒光定量PCR儀(美國伯樂科技有限公司)進(jìn)行檢測，操作方法嚴(yán)格按照試劑盒說明書和儀器說明書進(jìn)行操作。采用mirVana miRNA分離試劑盒提取血清中的miRNA，使用miRNA cDNA合成試劑盒對提取獲得的miRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄體系：miRNA 5 μL，反轉(zhuǎn)錄緩沖液5 μL，10×miRNA反轉(zhuǎn)錄引物2 μL，水8 μL。反轉(zhuǎn)錄條件：37 ℃ 60 min；95 ℃ 5 min。使用mirVana qRT-PCR miRNA檢測試劑盒對cDNA進(jìn)行定量檢測，反應(yīng)體系25 μL，包括水16.5 μL，5×PCR buffer 5 μL，50×ROX溶液0.5 μL，DNA聚合酶1 μL，PCR上游引物1 μL，PCR下游引物1 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 15 s；60 ℃ 30 s，進(jìn)行35個循環(huán)。miR-20a正向引物：5′-GCGGCGGTAAAGTGCTTATAGTG-3′，反向引物：5′-TGCAGGGTCCGAGGTAT-3′。miR-22正向引物：5′-AAGCTGCCAGTTGAAGAACTGTA-3′，反向引物：5′-AGTTGCTAAGATATGCGACAC-3′。以U6作為內(nèi)參基因，U6正向引物:5′-CCCTCCAGAGAGCGTTATGTGA-3′，反向引物:5′-GTTTCTGAAAATTACAGGGTCATTTGTG-3′。以2-ΔΔCt法計(jì)算miR-20a和miR-22的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清miR-20a、miR-22水平比較 胃癌組、對照組血清miR-20a水平分別為7.09±1.97、4.12±1.33，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=11.854，P<0.01)；血清miR-22水平分別為4.61±1.28、10.69±3.45，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=15.675，P<0.01)。

2.2 血清miR-20a、miR-22水平與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系 見表1。

表1 血清miR-20a、miR-22水平與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系

2.3 胃癌患者血清miR-20a與miR-22的關(guān)系 胃癌患者血清miR-20a水平與miR-22水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.864，P<0.01)。

2.4 血清miR-20a與miR-22對胃癌的診斷價值 以胃癌組(n=90)為陽性樣本，以對照組(n=90)為陰性樣本，再將miR-20a與miR-22兩指標(biāo)水平劃分成7～10個組段，建立ROC曲線診斷分析模型。發(fā)現(xiàn)兩指標(biāo)對胃癌具有較高的診斷價值，見表2。

表2 血清miR-20a與miR-22對胃癌的診斷價值

3 討論

miRNA是目前腫瘤領(lǐng)域新興的研究熱點(diǎn)之一，在胃癌發(fā)病過程中一系列miRNA表達(dá)發(fā)生異常，具有作為胃癌診斷和治療靶點(diǎn)的潛力[10]。miR-20a在前列腺癌等腫瘤中表達(dá)上調(diào)，并能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，胃癌患者血清miR-20a水平上調(diào)，并且血清miR-20a水平與胃癌患者組織分化程度和TNM分期有關(guān)。Yuan等[12]發(fā)現(xiàn)，在多發(fā)性骨肉瘤中蛋白酪氨酸磷酸酶基因(PTEN)是miR-20a的直接下游靶點(diǎn)，miR-20a能抑制PTEN表達(dá)，從而促進(jìn)多發(fā)性骨肉瘤細(xì)胞增殖，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡。Gao等[13]發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌細(xì)胞中PTEN同源物假基因1(PTENP1)與PTEN能競爭性結(jié)合miR-20a，乳腺癌細(xì)胞中PTENP1表達(dá)量上調(diào)促使更多的miR-20a與PTENP1結(jié)合，從而解除miR-20a對PTEN表達(dá)抑制效應(yīng)。同時PTEN能夠通過抑制磷脂酰肌醇-3-羥激酶(PI3K)/絲蘇氨酸蛋白激酶(AKT)信號通路抑制乳腺癌細(xì)胞增殖。胃癌中miR-20a表達(dá)上調(diào)能促進(jìn)miR-20a與PTEN等抑癌基因mRNA的結(jié)合并促進(jìn)其降解，從而導(dǎo)致PTEN等抑癌基因表達(dá)下降，使得PTEN對PI3K/AKT信號通路的抑制效應(yīng)解除，從而激活腫瘤細(xì)胞中的PI3K/AKT信號通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。另外，miR-20a亦能直接促進(jìn)TAK1等癌基因的轉(zhuǎn)錄，使得TAK1等癌基因表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。

miR-22在乳腺癌等腫瘤中表達(dá)下調(diào)，在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，胃癌患者血清miR-22水平下調(diào)，并且血清miR-22水平與浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)。Wongjampa等[15]發(fā)現(xiàn)，宮頸癌中組蛋白脫乙?；?HDAC6)是miR-22直接下游靶點(diǎn)，miR-22與HDAC6基因mRNA的3′-UTR區(qū)域結(jié)合而抑制HDAC6的反應(yīng)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。Zhang等[16]發(fā)現(xiàn)Snail基因是miR-22的作用靶點(diǎn)，miR-22與Snail基因mRNA結(jié)合促使Snail的mRNA大量降解，從而導(dǎo)致Snail表達(dá)下調(diào)。Snail是腫瘤相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，下游靶基因多參與腫瘤間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，Snail表達(dá)與腫瘤間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，Snail表達(dá)下調(diào)會導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲能力下降。Xu等[17]發(fā)現(xiàn)，miR-22能下調(diào)膀胱癌中絲裂原激活的蛋白激酶1(MAPK1)基因表達(dá)，從而抑制MAPK信號通路的活化，導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移能力下降。胃癌中miR-22表達(dá)下降能夠促進(jìn)HDAC6、Snail和MAPK1等腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)MAPK等腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)信號通路的活化和腫瘤上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生，從而導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)。

本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，胃癌患者血清miR-20a與miR-22呈負(fù)相關(guān)。這主要是由于胃癌中miR-20a主要起癌基因的作用，而miR-22主要起抑癌基因的作用，二者可能存在相互拮抗。而Li等[18]研究顯示，長鏈非編碼RNA MALAT1能激活T細(xì)胞受體信號通路，進(jìn)而上調(diào)miR-20a表達(dá)。在胃癌中，長鏈非編碼RNA MALAT1能與miR-22結(jié)合并促進(jìn)miR-22降解，導(dǎo)致患者miR-22水平下降，同時激活T細(xì)胞受體信號通路而上調(diào)miR-20a表達(dá)，從而導(dǎo)致患者血清miR-20a水平升高。本研究發(fā)現(xiàn)，相較單項(xiàng)診斷，血清miR-20a與血清miR-22聯(lián)合診斷的靈敏度和特異度更高，表明血清miR-20a和miR-22檢測在胃癌診斷中具有一定臨床意義。

綜上所述，胃癌患者血清miR-20a水平升高，而血清miR-22水平降低，二者表達(dá)呈負(fù)相關(guān)；聯(lián)合檢測二者水平有助于胃癌診斷。