裴曉燕 田洪青

山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬皮膚病醫(yī)院(山東省皮膚病醫(yī)院，山東省皮膚病性病防治研究所)，濟(jì)南，250022

梅毒是由梅毒螺旋體(Treponemapallidum，Tp)感染所引起的傳染性疾病，主要通過性接觸和母嬰傳播。根據(jù)國(guó)家疾控中心的統(tǒng)計(jì)，1991年全國(guó)報(bào)告梅毒1892例，當(dāng)年發(fā)病率0.16/105，此后每年報(bào)告的病例數(shù)逐漸增多，發(fā)病率也大幅度增高。到2019年全國(guó)報(bào)告(http.//www.nhc.gov.cn)梅毒病例數(shù)已達(dá)535819例，發(fā)病率38.37/105，死亡人數(shù)42例，死亡率0.003/105。在我國(guó)甲乙類傳染病報(bào)告中常年位居前三。據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，世界每年仍有1200萬梅毒新發(fā)病例，且90%以上發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家[1]。梅毒也會(huì)增加HIV的傳播和感染機(jī)率[2]。梅毒疫情已成為全球普遍關(guān)注的公共衛(wèi)生問題。由于梅毒疫苗尚未研發(fā)成功，控制梅毒疫情主要措施是早期診斷梅毒感染并給予抗生素治療。盡管Tp對(duì)青霉素依然敏感，但臨床Tp菌株對(duì)常用替代藥物大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的耐藥已經(jīng)非常普遍[3]。

1 梅毒治療及耐藥現(xiàn)狀

青霉素自20世紀(jì)40年代首次應(yīng)用以來，一直是治療梅毒的首選藥物。有研究顯示，在性傳播感染(STI)臨床評(píng)估的患者中，約有15%報(bào)道為青霉素過敏。針對(duì)無法使用青霉素的患者，可將多西環(huán)素、頭孢曲松、阿奇霉素作為非妊娠梅毒患者的替代治療藥物[4]。對(duì)青霉素耐藥，需要那些缺乏水平基因轉(zhuǎn)移機(jī)制的細(xì)菌(如Tp)進(jìn)行多步突變才可能完成，因此現(xiàn)在普遍認(rèn)為Tp不太可能對(duì)青霉素產(chǎn)生耐藥性[5]，而且目前尚未有關(guān)于梅毒對(duì)青霉素耐藥的情況被報(bào)道。頭孢曲松對(duì)早期梅毒有較好的治療作用,但必須注意到頭孢曲松同樣也存在過敏的問題,并與青霉素間存在約5%～10%的交叉過敏,在對(duì)此類患者的治療上應(yīng)當(dāng)慎重[6]。多西環(huán)素由于其療效好、給藥方便等特點(diǎn)在梅毒治療中廣泛應(yīng)用，這對(duì)不能使用青霉素治療的非妊娠患者來說是一個(gè)合理的選擇?？诜⒛髁挚梢杂行е委熢缙诿范?，有報(bào)道稱大劑量口服阿莫西林(3000 mg/d)聯(lián)合丙磺舒可有效治療非妊娠期HIV感染患者的梅毒[7]。以阿奇霉素、紅霉素為代表的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素具有療效好、成本低、患者依從性好等特點(diǎn)，還廣泛用于治療其他感染性疾病。但由于攜帶大環(huán)內(nèi)酯類耐藥突變(A2058G、A2059G)的Tp菌株在世界各地區(qū)廣泛存在，目前已不再推薦阿奇霉素治療梅毒。

1.1 梅毒螺旋體大環(huán)內(nèi)酯類耐藥情況 以阿奇霉素、紅霉素為代表的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素可與核糖體50S亞基23SrRNA可逆性結(jié)合，從而抑制蛋白質(zhì)合成。具有療效好、成本低、患者依從性好等特點(diǎn)，除此之外還可用于治療其他如生殖道衣原體、淋病等性傳播疾病。在90年代中期，阿奇霉素一度成為梅毒防治的重要藥物，且其臨床療效在美國(guó)、非洲、中國(guó)等地進(jìn)行的臨床對(duì)照試驗(yàn)中也得到了證實(shí)[2]。2002-2003年，美國(guó)發(fā)現(xiàn)了阿奇霉素治療梅毒失敗的病例[8]。2004年Lukehart等[9]從阿奇霉素治療梅毒失敗的患者身上分離出Tp樣本，經(jīng)測(cè)序比對(duì)后發(fā)現(xiàn)23SrRNA基因的2058位由腺嘌呤A突變?yōu)轼B嘌呤G(A2058G)。2009年，Matejkova等[10]確定了第二個(gè)大環(huán)內(nèi)酯類耐藥突變位點(diǎn)在核糖體23SrRNA基因的第2059位由腺嘌呤A突變?yōu)轼B嘌呤G(A2059G)。通過梅毒兔模型，研究人員發(fā)現(xiàn)A2058G在沒有抗生素壓力及亞治療濃度下可穩(wěn)定存在。A2058G對(duì)14環(huán)(紅霉素、克拉霉素)、15環(huán)(阿奇霉素)藥物有抗性，但對(duì)16環(huán)(螺旋霉素、泰洛星)無抗性，這可能是由于藥物與SS14株的差異結(jié)合所致。有研究表明，大環(huán)內(nèi)酯類耐藥菌株更容易出現(xiàn)在使用過大環(huán)內(nèi)酯類抗生素治療疾病的人身上，這說明低濃度大環(huán)內(nèi)酯類藥物的持續(xù)存在可能選擇出對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類耐藥Tp菌株，并激發(fā)新的突變。大環(huán)內(nèi)酯類耐藥性的產(chǎn)生與其藥物消耗量有關(guān)[11]。阿奇霉素在上世紀(jì)90年代初進(jìn)入全球市場(chǎng)，廣泛用于治療呼吸道感染和其他性傳播疾病。在廣泛使用聯(lián)合抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法之前，阿奇霉素也曾大量用于HIV感染者的治療。阿奇霉素半衰期為68 h，可在耐藥選擇濃度下持續(xù)15～30天。相比其他作用時(shí)間短的大環(huán)內(nèi)酯類藥物，阿奇霉素更有可能篩選出耐藥菌株。A2058G、A2059G突變?cè)赥p菌株同時(shí)出現(xiàn)的情況尚未被報(bào)道。Chen等[12]開發(fā)了一種多重RT-PCR檢測(cè)方法，可以快速檢測(cè)Tp的A2058G和A2059G突變。利用該檢測(cè)方法及時(shí)鑒定大環(huán)內(nèi)酯耐藥Tp菌株，有助于臨床醫(yī)生針對(duì)青霉素過敏且感染梅毒的患者選擇合適的治療方法。近年來，攜帶大環(huán)內(nèi)酯類抗生素抗性突變的梅毒螺旋體菌株在美國(guó)、中國(guó)、澳大利亞等地已十分常見。例如，舊金山梅毒患者標(biāo)本中帶有A2058G突變的Tp從4%(2002年)增加到76.5%(2005年)，西雅圖梅毒患者標(biāo)本中從9%(2002年)增加到56%(2005年)[4]。在近幾年的報(bào)道中，法國(guó)A2058G突變的Tp已超過85%，意大利、古巴和巴塞羅那等國(guó)家和地區(qū)的大環(huán)內(nèi)酯類耐藥的Tp均超過90%。除非是在梅毒螺旋體對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類耐藥率極低的地區(qū)或者無其他替代療法的情況下，目前已不再推薦阿奇霉素治療梅毒[13]。

1.2 克林霉素耐藥 克林霉素是林可霉素的一種半合成衍生物，抗菌譜與林可霉素相同。臨床上常用于治療革蘭陽性菌和厭氧菌引起的各種感染，抗菌作用機(jī)制與大環(huán)內(nèi)酯類相同，通過與核糖體50S亞基23SrRNA可逆性結(jié)合，從而抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成。在早期進(jìn)行的梅毒兔模型試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，單次肌注克林霉素對(duì)Tp數(shù)量幾乎沒有影響，多次肌注可使Tp數(shù)量減少至原來的1/7～1/5，效果明顯低于相同劑量的紅霉素和青霉素，因此認(rèn)為Tp對(duì)克林霉素有一定的固有耐藥?？肆置顾啬退幍臋C(jī)制包括核糖體50S亞基抗生素結(jié)合位點(diǎn)(23SrRNA)發(fā)生酶甲基化、靶點(diǎn)突變以及抗生素分子主動(dòng)外排等[14]。在某些腸道螺旋體、幽門螺旋桿菌中，23SrRNA的A2058G突變是造成其對(duì)克林霉素高抗性的主要原因之一。Tp對(duì)克林霉素的高耐藥性有可能是其固有耐藥性加A2058G突變的結(jié)果。

1.3 利福平耐藥 利福平通過與由rpoB基因編碼的RNA聚合酶rpoB的β亞基結(jié)合來抑制細(xì)菌RNA合成。1997年，Alekshun等證實(shí)伯氏疏螺旋體對(duì)利福平耐藥，是由于在與大腸埃希菌的S531蛋白同源的rpoB殘基上1個(gè)天冬酰胺(N)替代了絲氨酸(S)所致(即N531)，這種情況可能也存在于其他螺旋體中。在對(duì)Nichols株和鉤端螺旋體(Leptospira biflexa)的rpoB進(jìn)行了完整的氨基酸序列分析后，證實(shí)了N531的存在。細(xì)菌靶點(diǎn)氨基酸序列改變(N531)，導(dǎo)致了rpoB對(duì)利福平的親和力降低，因此這一突變被認(rèn)為是螺旋體對(duì)利福平天然耐藥的主要原因[15]。關(guān)于利福平耐藥的常見機(jī)制還包括rpoB外部的兩個(gè)高度保守的區(qū)域(如Rif簇I和Rif簇II)的突變，可降低抗生素的膜滲透性、促進(jìn)外排以及靶點(diǎn)酶修飾等。但在目前發(fā)現(xiàn)的這些突變中，只有N531與Tp有關(guān)。

2 梅毒螺旋體四環(huán)素類耐藥研究進(jìn)展

2.1 四環(huán)素耐藥分子機(jī)制 四環(huán)素耐藥基因(Tetracycline resistance genes)簡(jiǎn)稱tet基因。目前已有40余種tet基因被報(bào)道。 大多數(shù)tet基因可接合在質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合子等可移動(dòng)遺傳元件上，這些遺傳元件菌群大量傳遞使細(xì)菌獲得四環(huán)素耐藥基因，從而對(duì)四環(huán)素產(chǎn)生了耐藥性，即獲得性耐藥。不同的tet基因可編碼不同的蛋白質(zhì)，介導(dǎo)不同的耐藥機(jī)制。目前研究較多的是泵出機(jī)制、核糖體保護(hù)機(jī)制、酶失活機(jī)制。

除了耐藥基因，細(xì)菌核糖體的突變也可造成自身對(duì)四環(huán)素耐藥。1998年，Ross等在對(duì)耐四環(huán)素丙酸桿菌進(jìn)行基因測(cè)序之后，發(fā)現(xiàn)其16SrRNA基因的第1058位由胞嘧啶取代了鳥嘌呤(G1058C)，發(fā)生點(diǎn)突變的區(qū)域被稱為螺旋34(h34)，該區(qū)域?qū)﹄逆湹慕K止和翻譯的準(zhǔn)確性非常重要。之后，又在其他菌群中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)四環(huán)素耐藥相關(guān)的16SrRNA點(diǎn)突變，如A965T、A967T/C、AGA965-967TTC和U1199C等。

2.2 四環(huán)素類藥物治療梅毒現(xiàn)狀 四環(huán)素類藥物是一類廣譜抗生素。除抑制細(xì)菌外，對(duì)立克次體、支原體、衣原體和原生動(dòng)物寄生蟲也有較強(qiáng)的抑制作用。曾長(zhǎng)期作為臨床抗感染治療的主要抗生素。

相較于四環(huán)素，多西環(huán)素具有療效好、給藥方便、不良反應(yīng)小等特點(diǎn)，目前已不再推薦使用四環(huán)素[16]。多西環(huán)素可有效預(yù)防多種螺旋體感染疾病如萊姆病(Lyme disease)、鉤體病、梅毒等[17]。自多西環(huán)素應(yīng)用于梅毒的治療以來，人們對(duì)其療效進(jìn)行了監(jiān)測(cè)和長(zhǎng)期回顧性的探索。早期進(jìn)行的多西環(huán)素和芐星青霉素治療梅毒的療效對(duì)比實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示多西環(huán)素組的治療成功率均為100%。但近年來多地區(qū)均發(fā)現(xiàn)多西環(huán)素治療梅毒失敗的情況。2014年，北京[18]和臺(tái)灣[19]兩地的學(xué)者再次對(duì)多西環(huán)素和青霉素進(jìn)行了藥效對(duì)比試驗(yàn)，這次的試驗(yàn)結(jié)果顯示多西環(huán)素的治療成功率已不如之前，分別為82.9%和65.9%。Stamm等[2]推測(cè)，多西環(huán)素治療梅毒失敗有可能是四環(huán)素梅毒螺旋體耐藥菌株的出現(xiàn)所致。在以梅毒合并HIV感染的患者為研究對(duì)象所進(jìn)行的藥效對(duì)比試驗(yàn)中，多西環(huán)素與青霉素的治療效果無顯著差異，兩者的血清治愈率分別為85%和83%[20]。美國(guó)CDC建議口服多西環(huán)素作為早期梅毒的替代治療，而英國(guó)指南建議將多西環(huán)素作為神經(jīng)梅毒的替代治療[17]。

2.3 梅毒螺旋體四環(huán)素耐藥情況 在20世紀(jì)50年代中期以前，大多數(shù)共生菌和致病菌都對(duì)四環(huán)素敏感。1953年第一個(gè)耐四環(huán)素的志賀痢疾桿菌被檢測(cè)出來。隨后的幾十年內(nèi)，耐四環(huán)素的各種菌株不斷增多，而且以多重耐藥為主。

tetB 基因是分布最廣的四環(huán)素耐藥基因，主要參與泵出機(jī)制。1996年，Roberts等對(duì)16株齒垢密螺旋體菌株進(jìn)行了Southern blot雜交和PCR檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有7株攜帶 tetB基因，5株同時(shí)攜帶tetB和ermF基因(編碼紅霉素抗性的rRNA甲基化酶)，由此將tetB基因的宿主范圍擴(kuò)展到了密螺旋體屬。之后Xiao等[21]對(duì)山東省2014-2015年171例早期梅毒Tp樣本進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)有17株攜帶tetB基因，未發(fā)現(xiàn)16SrRNA基因發(fā)生點(diǎn)突變。此前梅毒螺旋體獲得性四環(huán)素耐藥基因tetB基因未見報(bào)道。

2017年，Giacani等[22]對(duì)從意大利四個(gè)地區(qū)的60例患者身上搜集到的Tp樣本進(jìn)行了大環(huán)內(nèi)酯類和四環(huán)素類耐藥突變位點(diǎn)的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)94.3%(50/53)的菌株對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類耐藥，未發(fā)現(xiàn)與四環(huán)素類相關(guān)的突變；之后Grillov等[23]對(duì)古巴2012-2017年搜集到的83例患者的Tp樣本進(jìn)行了相同的測(cè)序比對(duì)，其中90%的患者都感染了發(fā)生A2058G突變的菌株，但未發(fā)現(xiàn)四環(huán)素耐藥突變位點(diǎn)。 2019年Fernndez等[24]對(duì)巴塞羅那地區(qū)Tp樣本23SrRNA、16SrRNA進(jìn)行了測(cè)序比對(duì)，結(jié)果顯示大環(huán)內(nèi)酯類耐藥突變占95%，四環(huán)素耐藥突變占0%。

目前為止進(jìn)行的梅毒螺旋體全基因組測(cè)序中，尚未檢測(cè)到tet基因，但大環(huán)內(nèi)酯類耐藥情況則十分普遍[25]。在近期的一項(xiàng)研究中，對(duì)4株Tp SS14菌株進(jìn)行了體外藥敏試驗(yàn)，結(jié)果顯示多西環(huán)素對(duì)體外環(huán)境中的Tp有明顯的抑制作用，這說明多西環(huán)素對(duì)梅毒的治療仍然非常有效[26]。

3 結(jié)論

綜上所述，我們可以發(fā)現(xiàn)青霉素依然是治療梅毒的主力軍。許多地區(qū)的梅毒螺旋體菌株對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類的耐藥已非常普遍，但尚未對(duì)四環(huán)素類抗生素產(chǎn)生大規(guī)模耐藥。大環(huán)內(nèi)酯類耐藥菌株的出現(xiàn)可能與大環(huán)內(nèi)酯類抗生素在臨床上的廣泛應(yīng)用有關(guān)[27]。因?yàn)樗鼈兊闹委熥饔貌粌H是針對(duì)梅毒，也可能是用于沙眼衣原體、淋球菌感染和非淋球菌感染性尿道炎等疾病。同樣的思路可應(yīng)用于預(yù)防四環(huán)素耐藥菌株出現(xiàn)，故臨床上使用四環(huán)素或多西環(huán)素治療時(shí)，應(yīng)持續(xù)對(duì)其進(jìn)行療效監(jiān)測(cè)，并警惕耐藥菌株的出現(xiàn)?？紤]到抗生素在許多感染性疾病的治療上已經(jīng)出現(xiàn)了廣泛耐藥，為了避免這種情況發(fā)生在梅毒治療中以及限制抗生素的使用，人們迫切地希望能夠研發(fā)梅毒疫苗。