蘇甲林 趙參軍 鄭瑾

肺癌是目前最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率都位居前列，且仍然呈上升趨勢[1-2]。其中非小細胞肺癌(NSCLC)占所有肺癌約85%，而肺腺癌是非小細胞肺癌最常見的亞型[3]。盡管非小細胞肺癌在早期診斷、預(yù)防和治療上有所改善，但是，在過去幾十年中各階段非小細胞肺癌的5年總生存率并沒有顯著改變[4-5]。目前，外科手術(shù)、化放療、分子靶向治療和免疫治療等方法已廣泛應(yīng)用于肺癌，并取得了較好的療效[6-10]。但對于無手術(shù)、放療適應(yīng)癥、化療耐藥及出現(xiàn)無法耐受毒副作用的患者，中醫(yī)藥有一定的優(yōu)勢，其對于調(diào)整機體整體平衡，改善放、化療治療的毒副反應(yīng)，提高患者生存時間和生存質(zhì)量具有重要意義[11-12]。土貝母是我國一種傳統(tǒng)中藥，以鱗莖入藥，性味苦，畏寒，歸肺、脾經(jīng)，有散結(jié)、消腫、解毒之功效[13-14]。研究人員利用多種色譜分離手段，分離土貝母根莖得到了30種化合物[13, 15]。土貝母中皂苷占比例較大，也是主要的活性成分之一，其中，土貝母苷甲(Tubeimoside-1，TBMS1)是一種聚完三萜皂苷，具有良好的水溶性[11, 16]。體外實驗研究顯示土貝母苷甲對多種癌細胞的生長均有明顯的抑制效果[14, 17-18]。本實驗以土貝母苷甲為主要研究對象，MTS法觀察土貝母苷甲對人肺腺癌細胞的體外生長抑制作用，使用流式細胞儀觀察土貝母苷甲對A549細胞周期及凋亡變化，Western blot 檢測土貝母苷甲對Caspase通路蛋白表達變化，探討土貝母苷甲對人肺腺癌細胞的增殖及凋亡作用，為進一步研究土貝母苷甲治療肺腺癌的臨床應(yīng)用奠定實驗基礎(chǔ)。

資料與方法

一、材料

人肺腺癌細胞株(A549)購自上海細胞庫，F(xiàn)-12K Nutrient Mixture 培養(yǎng)基(F-12K)、胎牛血清、胰酶均購自Gibco公司；MTS購自美國promega公司；Annexin V-FITC和Propidium Iodide購自美國eBioscience公司；無菌操作臺、CO2培養(yǎng)箱，低溫高速離心機和酶標儀均購自美國Thermo公司；流式細胞儀購自美國BD公司；用于Western blot的caspase-9、caspase-3、PARP抗體夠自美國 Cell Signaling Technology公司，山羊抗小鼠二抗 、DAB辣根過氧化物酶顯色試劑盒(P0202)、RIPA裂解液(P0013)、蛋白分子量標準(P0061)購于碧云天公司。土貝母苷甲購自天津一方科技有限公司。

二、實驗方法

1 土貝母苷甲母液配制

用天平稱取土貝母苷甲10 mg溶解5 mL已滅菌的PBS溶液中，待完全溶解后用0.22 μm濾膜過濾除菌，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

2 細胞培養(yǎng)

人肺腺癌細胞A549用含10%胎牛血清的F-12K培養(yǎng)基于5% CO2，37℃恒溫培養(yǎng)，倒置相差顯微鏡下觀察細胞均勻分布，每兩天更換新鮮培養(yǎng)基一次，待細胞融合度達到約90%時按1 ∶3進行傳代。

三、體外抗腫瘤活性測定

1 MTS法測定土貝母苷甲對A549細胞生長抑制率

將處于對數(shù)生長期的A549細胞以1 000個細胞每孔接種到96孔板中，待細胞融合度達到70%～80%時，更換培養(yǎng)基，并在新的培養(yǎng)基中按照下列濃度為終濃度加入土貝母苷甲儲液(μg/mL)：0、1、2、5。每組設(shè)立3個重復孔，并設(shè)立空白孔；隔天更換培養(yǎng)液，培養(yǎng)4天，維持土貝母苷甲濃度，每天固定時間點取出1個96孔板，每孔加入20μl MTS試劑，并置于37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h。使用全自動酶標儀檢測490 nm處吸光度值(OD值)。

2 土貝母苷甲對肺腺癌細胞A549周期分布的影響

采用流式細胞儀結(jié)合PI染劑檢測分析各組細胞周期的變化：取處于對數(shù)生長期的細胞以2×105個細胞每孔種至6孔板中；使用含1 μg/mL土貝母苷甲培養(yǎng)基培養(yǎng)A549細胞48 h后作為處理組，對照組加入培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h；使用不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化兩組細胞并收集于離心管中。將細胞于20℃，2 000 rpm離心5 min后，用預(yù)冷的PBS離心洗滌細胞，4℃，2 000 rpm，離心5 min，加入預(yù)冷的75%乙醇溶液于4℃冰箱中過夜固定；將細胞再次用預(yù)冷的PBS溶液洗滌離心后，將細胞重懸于含50 μg/mL的PI染劑和50 μg/mL的RNase A溶液中，置入37℃水浴箱中孵育約30 min后用流式細胞儀進行細胞周期的檢測。

3 土貝母苷甲對肺腺癌細胞A549凋亡率的影響

采用流式細胞儀結(jié)合Annexin FITC凋亡檢測試劑盒檢測細胞凋亡變化：取處于對數(shù)生長期的細胞以2×105個細胞每孔種至6孔板中；使用含1 μg/mL土貝母苷甲培養(yǎng)基培養(yǎng)A549細胞48 h后作為處理組，對照組加入培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h；分別取1 mL細胞懸液用預(yù)冷的PBS離心洗滌細胞，4℃，2 000 rpm，離心5 min，共3次，棄去上清液；加入500 μL Annexin FITC及APC試劑并混勻后加入5 μL PI試劑并混勻，于室溫下避光孵育15～20 min后用流式細胞儀進行檢測；結(jié)果判斷：在雙變量流式細胞儀的散點圖上，左上象限代表收集過程中出現(xiàn)的損傷細胞，右上象限代表晚期凋亡細胞和壞死細胞，左下象限代表正常存活細胞，右下象限代表早期凋亡細胞。以早期凋亡細胞、晚期凋亡細胞與壞死細胞之和為凋亡的細胞。

4 Western blot 檢測土貝母苷甲對Caspase通路蛋白表達

將兩組細胞接種至60 mm細胞培養(yǎng)皿中，于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)至對數(shù)生長期，使用含1 μg/mL土貝母苷甲培養(yǎng)基培養(yǎng)A549細胞48 h后作為處理組，對照組加入培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h；收集兩組細胞蛋白質(zhì)，進行Western blot檢測Caspase-9、Caspase-3和Parp在兩組細胞中的表達情況。

四、統(tǒng)計分析

統(tǒng)計學分析采用SPSS Statistics 23對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)采用平均值±標準差的形式表示，兩組數(shù)據(jù)間比較采用t檢驗分析，多組數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，多組之間兩兩比較采用LSD-t檢驗的方法P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、土貝母苷甲對A549細胞增殖的影響

利用MTS法檢測土貝母苷甲對A549細胞增殖的影響，根據(jù)實驗結(jié)果繪制細胞生長曲線，結(jié)果顯示，各組細胞隨培養(yǎng)時間的推移都呈現(xiàn)出增殖的趨勢，隨著土貝母苷甲濃度的增加，A549細胞的增殖能力顯著降低(P<0.05)，提示土貝母苷甲對A549細胞的增殖具有抑制作用(圖1)。

圖1 土貝母苷甲對A549細胞增殖能力的影響，*P<0.05

二、土貝母苷甲對人肺腺癌細胞A549周期分布的影響

通過流式細胞儀檢測土貝母苷甲對人肺腺癌細胞A549周期分布的影響。實驗結(jié)果表明: 1 ug/mL土貝母苷甲處理A549細胞48 h后比對照組A549細胞 G0/G1期百分率顯著增加(P<0.05)。同時，處理組細胞的S期百分率比對照組A549細胞顯著降低(P<0.05)。表明土貝母苷甲處理A549細胞48 h后，A549細胞更多的阻滯于G0/G1期，提示土貝母苷甲抑制人肺腺癌細胞增殖(圖2)。

圖2 土貝母苷甲對A549細胞周期分布的影響

三、土貝母苷甲對肺腺癌細胞A549凋亡水平的影響

通過流式細胞儀檢測土貝母苷甲對人肺腺癌細胞A549凋亡水平的影響。實驗結(jié)果表明：1 ug/mL土貝母苷甲處理A549細胞48 h后比對照組A549細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。表明土貝母苷甲處理A549細胞48 h后，A549細胞凋亡率顯著增高，提示土貝母苷甲促進人肺腺癌細胞凋亡(圖3)。

圖3 土貝母苷甲對A549細胞凋亡率的影響

四、Western blot檢測土貝母苷甲對Caspase通路蛋白表達差異

將細胞重新接種至60 mm細胞培養(yǎng)皿中，于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)至對數(shù)生長期，提取總蛋白，進行Western blot檢測，以GAPDH作為內(nèi)參，分析土貝母苷甲對A549細胞Caspase-9、Caspase-3和Parp表達的影響。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)：處理組比對照組的cleaved Caspase-9、cleaved Caspase-3和cleaved Parp的表達顯著增加(P<0.05)，表明土貝母苷甲可通過Caspase通路引起細胞凋亡(圖4)。

圖4 土貝母苷甲對A549細胞Caspase-9、Caspase-3和Parp表達的影響

討 論

近年來，中醫(yī)藥在腫瘤防治中以其確切的療效倍受人們關(guān)注。肺癌位居癌癥之首，但其治療效果仍不理想。目前，肺癌仍然是全世界最常見的惡性腫瘤和最常見的癌癥死亡原因，分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌兩種主要組織學類型。非小細胞肺癌是最常見的肺癌類型，其中腺癌占大多數(shù)[19]。研究發(fā)現(xiàn)土貝母苷甲在抗炎、抗病毒和免疫抑制效應(yīng)等方面發(fā)揮著重要的生物作用[20]。此外，越來越多的證據(jù)表明土貝母苷甲具有顯著的抗腫瘤作用，如抑制細胞增殖、阻滯細胞周期，促進人肝癌、食管鱗狀細胞癌和絨毛膜癌等癌細胞凋亡[21-22]，在乳腺癌、結(jié)腸癌中也具有抑制腫瘤生長作用[23]。為了探索土貝母苷甲在治療肺癌中的作用，我們選擇人肺腺癌A549細胞作為研究對象，采用MTS法檢測土貝母苷甲對A549細胞增殖的影響，隨著土貝母苷甲濃度的增加，A549細胞的增殖能力顯著降低，提示土貝母苷甲對A549細胞的增殖具有抑制作用。

通過誘導細胞周期停滯和凋亡來抑制腫瘤生長是腫瘤治療的主要策略。因此，我們對土貝母苷甲處理A549細胞進行了細胞凋亡和細胞周期分析。凋亡誘導是阻礙腫瘤生長和增殖的主要機制之一。凋亡是細胞程序性死亡的過程，用于從體內(nèi)去除不需要的細胞而不引起炎癥。凋亡途徑中的缺陷與腫瘤的發(fā)展有關(guān)，并且可能導致腫瘤對化療的抗藥性。我們通過流式細胞儀檢測土貝母苷甲對人肺腺癌細胞A549凋亡水平的影響，發(fā)現(xiàn)土貝母苷甲處理A549細胞48 h后，A549細胞凋亡率顯著增高。胱天蛋白酶在程序性細胞死亡的起始和執(zhí)行中起關(guān)鍵作用，Caspase-3、 Caspase-9和Parp是細胞凋亡的主要執(zhí)行者，負責結(jié)構(gòu)和信號蛋白的蛋白水解降解，最終導致細胞死亡。為了進一步確定土貝母苷甲誘導的細胞活力降低是否與細胞凋亡相關(guān)，我們采用Western blot檢測兩組細胞中的Caspase-3、Caspase-9和Parp蛋白活性水平。我們發(fā)現(xiàn)土貝母苷甲處理A549細胞導致Caspase-3、Caspase-9和Parp活性水平顯著增加，表明土貝母苷甲可通過Caspase通路引起細胞凋亡。

細胞周期停滯是抑制細胞增殖的重要信號。此外，凋亡的誘導可能通過細胞周期停滯來介導。為了確定土貝母苷甲是否由于誘導細胞周期停滯而抑制了癌細胞的生長，我們研究了土貝母苷甲對細胞周期進程的影響。使用流式細胞儀分析表明，土貝母苷甲處理A549細胞后G0/G1期細胞百分率顯著增加，同時，S期細胞百分率顯著降低。提示土貝母苷甲通過調(diào)節(jié)細胞周期抑制人肺腺癌細胞增殖。

以上研究已證實土貝母苷甲具有抗腫瘤作用，土貝母苷甲抑制人肺腺癌A549細胞增殖，并誘導A549細胞凋亡。發(fā)現(xiàn)土貝母苷甲處理A549細胞48 h后細胞增殖速度顯著下降，并使用流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)土貝母苷甲處理A549細胞48 h后使細胞阻滯在G0/G1期，而抑制細胞增殖且促進細胞凋亡，Western blot 檢測各組細胞發(fā)現(xiàn)土貝母苷甲可通過Caspase通路引起細胞凋亡。綜上所述，土貝母苷甲在抑制肺腺癌細胞增殖及誘導細胞凋亡過程中起關(guān)鍵作用，為土貝母苷甲在后期不同病理類型的肺癌治療提供理論依據(jù)，并為肺腺癌的治療提供新的視野。