馮智，張小博，惠慧

(中國藥科大學(xué)玄武門校區(qū)，江蘇省腫瘤發(fā)生與干預(yù)重點實驗室，江蘇 南京 210009)

0 引言

Rho小G蛋白屬于Ras超家族中的一員，具有GTP酶活性，它的分子開關(guān)作用，是通過在活化態(tài)(結(jié)合GTP)和非活化態(tài)(結(jié)合GDP)之間轉(zhuǎn)換來實現(xiàn)的，在細胞內(nèi)是一種重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。Rho蛋白通過結(jié)合其下游靶效應(yīng)分子，進而產(chǎn)生多種生物學(xué)效應(yīng)，其中最重要的效應(yīng)分子之一是Rho相關(guān)蛋白激酶(Rho-associated coiled-coil containing kinases,ROCK)，其屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，分子量約為160 kD。ROCK具有許多功能，其中包括調(diào)節(jié)細胞收縮，遷移，粘附和增殖。藥理研究發(fā)現(xiàn)，諸如多發(fā)性硬化癥[1]，炎癥性疾病[2]，心肌缺血[3]，高血壓[4]等各種疾病的發(fā)生與ROCK有關(guān)。同時研究還發(fā)現(xiàn)，ROCK蛋白的異常表達與腫瘤有著密切的聯(lián)系。本文主要論述了ROCK蛋白及其抑制劑在腫瘤發(fā)生發(fā)展中所起作用的研究進展，以期為新的藥物相關(guān)治療靶點的發(fā)現(xiàn)提供線索。

1 ROCK蛋白的結(jié)構(gòu)特點及其活性調(diào)節(jié)

自上世紀90年代后半葉發(fā)現(xiàn)[5]以來，ROCK逐漸成為功能研究最詳細的Rho下游靶效應(yīng)分子，其在細胞內(nèi)存在有兩種在同源性上相似度較高的異構(gòu)體，即ROCK1(ROKβ或p160 ROCK)與ROCK2(ROKα)。ROCK遍布全身，相比之下，ROCK1在肝，肺，脾和睪丸等非神經(jīng)組織中富集，而ROCK2在腦，心臟和肌肉等組織中中則呈現(xiàn)更高的表達量[6]。下面分別論述二者的結(jié)構(gòu)特點及其活性調(diào)節(jié)。

1.1 ROCK蛋白的結(jié)構(gòu)特點

在人類中，ROCK1和ROCK2都包含33個外顯子，二者分別位于18號染色體(18q11.1)和2號染色體(2p24)上。ROCK1開放閱讀框編碼1354個氨基酸，而ROCK2編碼1388個氨基酸。ROCK1和ROCK2在它們的一級氨基酸序列中具有64%的同一性，并且在激酶域中具有高度相似性(共有92%)[7]。ROCK氨基酸序列由一個激酶結(jié)構(gòu)域(RBD)(氨基末端)，一個卷曲螺旋區(qū)域，一個PH結(jié)構(gòu)域(PHD)和一個富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域(CRD)(羧基末端)組成，其中Rho結(jié)合域(RBD)在螺旋結(jié)構(gòu)域中。

1.2 ROCK蛋白的活性調(diào)節(jié)

盡管ROCK1和ROCK2具有高度相關(guān)的功能結(jié)構(gòu)域和顯著的氨基酸同一性，但它們可以通過相同的常見方式以及ROCK1或ROCK2獨有的機制來進行活性的調(diào)節(jié)。

首先，一方面無論是ROCK1或ROCK2，它們的羧基末端區(qū)域都起自抑制區(qū)的作用。當(dāng)該部分的缺失后，會導(dǎo)致體內(nèi)和體外激酶活性的激活[8]。抑制的發(fā)生可能是因為激酶域的活性位點被相互作用所阻斷[9]。Ras超家族包括Rho-GTPase蛋白RhoA和RhoC，它們是最典型的ROCK調(diào)節(jié)劑。據(jù)報道，Rho蛋白結(jié)合GTP被激活后，再與RBD的相互作用可通過誘導(dǎo)構(gòu)象變化來破壞激酶結(jié)構(gòu)域與自抑制羧基末端區(qū)域之間的負調(diào)節(jié)相互作用，從而提高激酶的活性。雖然Rho蛋白通常激活ROCK，但其他GTP結(jié)合蛋白已被發(fā)現(xiàn)負調(diào)控ROCK信號。在RBD附近的卷曲區(qū)，Gem與ROCK1相互作用，從而抑制MLC的磷酸化和MLC磷酸酶的MYPT1亞基[10]。另一種小的GTP結(jié)合蛋白Rad1也被報道模擬Gem通過阻斷ROCK2來抑制肌球蛋白的收縮性，導(dǎo)致細胞突起的減少。

其次，另一方面ROCK1和ROCK2則會通過各自獨有的機制來進行調(diào)節(jié)。例如，在細胞凋亡的情況下，ROCK1通過半胱天冬酶的裂解和去除自抑制域而被激活[11]，而ROCK2則可能被顆粒酶B(Granzymes B)介導(dǎo)的裂解激活，這也導(dǎo)致了胱天蛋白酶的激活[12]。這兩個事件均導(dǎo)致不依賴Rho的組成型活性激酶片段的產(chǎn)生，從而導(dǎo)致肌動蛋白-肌球蛋白的收縮不受約束，進而導(dǎo)致膜起泡，凋亡小體形成以及核材料包裝成小泡和凋亡小體[13]。在負調(diào)控方面，磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1(Phosphoinositide-dependent kinase-1，PDK1)與RhoE類似的ROCK1區(qū)域競爭結(jié)合，從而對抗RhoE對ROCK1的負調(diào)控[14]；而通過與PH結(jié)構(gòu)域的直接結(jié)合，肌動蛋白結(jié)合蛋白1B(Coroninactin binding protein 1B，CORO1B)則會對ROCK2信號通路進行抑制[15]。

2 ROCK蛋白與腫瘤的關(guān)系

ROCK是癌癥進展過程中的關(guān)鍵角色。ROCK及其下游靶點主要參與調(diào)節(jié)肌動蛋白的細胞骨架動力學(xué)，因此負責(zé)細胞遷移和運動。此外，它們還與多種生物學(xué)過程有關(guān)，例如細胞連接完整性，細胞周期控制和細胞凋亡。它們在癌癥進展各種過程中的作用，例如腫瘤細胞存活與凋亡[16]，侵襲轉(zhuǎn)移[17]，以及血管增生[18]等都已得到證明。盡管通常認為ROCK激活是致癌的，但一些研究表明ROCK在癌癥進展中起負調(diào)控作用。因此，ROCK在不同類型癌癥過程中的確切作用，具體取決于細胞類型和腫瘤周圍的微環(huán)境。

2.1 ROCK蛋白在腫瘤細胞存活和凋亡中的作用

ROCK在腫瘤細胞存活和凋亡中有時會呈現(xiàn)出不一樣的作用。研究表明，在一些類型的腫瘤細胞中，ROCK蛋白表現(xiàn)出促進腫瘤細胞存活的效應(yīng)，即ROCK受到激活可增加細胞活力，ROCK受到抑制可誘導(dǎo)細胞凋亡。Ming-KeQiu[19]等通過對嬰兒期發(fā)生的血管瘤(HA)進行研究，發(fā)現(xiàn)與增殖期HA相比，ROCK和血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)的蛋白質(zhì)與mRNA積累會顯著更高。增殖期HA中細胞凋亡指數(shù)低，而漸入期HA中細胞凋亡指數(shù)增加。用ROCK抑制劑Y-27632處理后發(fā)現(xiàn)，Y-27632誘導(dǎo)HA細胞中p53表達并下調(diào)VEGF表達，顯著地抑制細胞增殖，并誘導(dǎo)細胞凋亡。

相比之下，其他研究表明，ROCK的抑制作用可促進腫瘤細胞存活和化學(xué)抗藥性，或降低抗癌劑的凋亡作用。這是因為，ROCK有助于肌球蛋白輕鏈的磷酸化，肌球蛋白ATPase活性和肌動蛋白-肌球蛋白絲與質(zhì)膜的偶聯(lián)，在細胞凋亡過程中被裂解以產(chǎn)生截短的活性形式。ROCK蛋白的活性對于形成膜泡以及將片段化的DNA重新定位到膜泡和凋亡小體中都是必需的和足夠的。例如，Hong Zhou[20]等通過對高葡萄糖(HG)誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡和氧化應(yīng)激過程進行研究，證明了RhoA / ROCK通路通過氧化應(yīng)激以及p38MAPK和JNK在新生大鼠中的活化介導(dǎo)HG誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡。而使用ROCK的抑制劑法舒地爾通過減輕氧化應(yīng)激以及調(diào)節(jié)Bax /Bcl-2表達并抑制caspase-3裂解的p38MAPK和JNK途徑來防止HG誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡。

從這些研究可以得出的結(jié)論是，ROCK對腫瘤細胞的促凋亡或抗凋亡作用取決于具體的細胞固有特性和外部條件。

2.2 ROCK蛋白在腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用

腫瘤細胞的侵襲是轉(zhuǎn)移的標(biāo)志，這是一個復(fù)雜的過程，涉及細胞骨架重組，片狀脂蛋白形成，膜起皺和細胞形態(tài)變化。肌動蛋白細胞骨架的調(diào)節(jié)在細胞遷移中起重要作用，ROCK信號傳導(dǎo)是肌動蛋白重組的主要調(diào)節(jié)因子，因為各種細胞骨架調(diào)節(jié)蛋白都是ROCK的底物。這些調(diào)節(jié)蛋白包括含有LIM結(jié)構(gòu)域激酶(LIM domain kinase，LIMK)，肌球蛋白輕鏈(Myosin Light Chain，MLC)和MLC磷酸酶。ROCK活化的LIMK使纖溶蛋白(Cofilin)磷酸化并使其肌動蛋白解聚活性失活，從而導(dǎo)致肌動蛋白絲的穩(wěn)定性[21]。另一方面，ROCK通過MLC磷酸酶的磷酸化和失活或MLC的直接磷酸化來促進MLC的磷酸化，從而導(dǎo)致肌球蛋白活化和肌動蛋白驅(qū)動產(chǎn)生收縮力[22]。

大多數(shù)研究都贊成ROCK激活通過對腫瘤細胞運動的直接影響，或?qū)Π┌Y相關(guān)的成纖維細胞的間接作用來增強腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，從而增加細胞外基質(zhì)的硬度并促進癌細胞的移動。例如在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的小鼠模型中，ROCK通過調(diào)節(jié)細胞骨架肌動蛋白-肌球蛋白的收縮和調(diào)節(jié)c-Myc途徑，增加了細胞的運動性，促進了侵襲和轉(zhuǎn)移[23]。作為一種高度浸潤性的癌癥，晚期卵巢癌的不良預(yù)后來自人類卵巢癌細胞侵襲性的增強。而在這其中，溶血磷脂酸(LPA)/ Rho /ROCK通路與卵巢癌的發(fā)展過程密切相關(guān)，當(dāng)ROCK受到抑制時，會顯著降低LPA誘導(dǎo)的人卵巢癌細胞的侵襲和運動，進而減弱了人卵巢癌細胞的侵襲性[24]。

2.3 ROCK蛋白在內(nèi)皮細胞增殖與血管生成中的作用

與在腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移中的活性相似，大多數(shù)研究都表明ROCK能夠調(diào)節(jié)細胞增殖和血管生成而在腫瘤生長中發(fā)揮積極作用。這主要是通過影響VEGF介導(dǎo)血管生成、靜脈通透性和新生血管[25]等重要作用來實現(xiàn)的。

大量報道表明，ROCK抑制作用會降低腫瘤細胞的增殖和血管生成[26]。例如，通過在促進應(yīng)激纖維形成方面的公認作用，ROCK促進了纖連蛋白基質(zhì)的組裝，細胞粘附以及轉(zhuǎn)移性腎腫瘤細胞的增殖[27]。在肺癌中，使用法舒地爾進行治療會抑制肺癌細胞的生長[28]。由于它通過引起應(yīng)力纖維斷裂而抑制了肺癌條件下的內(nèi)皮細胞增殖和體內(nèi)侵襲能力，因此它也顯著減弱了血管生成[29]。此外，ROCK抑制作用還可以通過阻止癌基因的激活來減少腫瘤細胞的增殖。ROCK在T58和/或S62處使癌基因c-Myc磷酸化，從而確保c-Myc在乳腺癌[30]和前列腺癌[31]中具有更高的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄活性；因此，ROCK的抑制降低了c-Myc活性。

相反，在其他研究中，還發(fā)現(xiàn)ROCK抑制作用可增加細胞增殖。例如，在結(jié)腸癌[32]和胰腺癌細胞[33]中，用Y-27632處理可誘導(dǎo)細胞增殖。這些研究表明，ROCK負調(diào)節(jié)EGF誘導(dǎo)的細胞增殖，而EGF首先刺激EGF受體的激活并隨后增加癌細胞的增殖，EGF同時誘導(dǎo)ROCK的激活，然后關(guān)閉ROCK。通過負反饋系統(tǒng)激活EGF受體途徑。因此，用Y-27632抑制ROCK可以防止負反饋，從而導(dǎo)致EGF活性增加和細胞增殖。此外，據(jù)報道，ROCK抑制通過下調(diào)抑癌基因，磷脂酶和張力蛋白同源物(Phosphatase and tensin homolog，PTEN)來促進細胞增殖，從而導(dǎo)致Akt磷酸化上調(diào)，這對于細胞增殖和存活至關(guān)重要[34]。

綜上所述，ROCK通過促進肌動球蛋白細胞骨架的收縮性以及細胞粘附，胞質(zhì)分裂和癌基因的激活，在許多細胞類型的癌細胞增殖中具有普遍的積極作用。盡管在特殊情況下，通過對生長因子信號傳導(dǎo)(例如EGF)和促進腫瘤抑制基因激活(例如PTEN)的負面反饋，存在一些例外情況。

3 ROCK抑制劑與腫瘤的關(guān)系

3.1 ROCK抑制劑的分類及應(yīng)用

現(xiàn)已研究的ROCK抑制劑按其所發(fā)揮作用的靶標(biāo)主要可以分為兩大類：針對所有ROCK非選擇性抑制劑,以及只對一種或幾種ROCK同工型的選擇性抑制劑。而它們的共同點則幾乎都是ATP競爭性抑制劑，主要代表有Y27632、法舒地爾、羥基法舒地爾和H-1152P。目前通過針對這四種抑制劑及對ROCK1配合物晶體結(jié)構(gòu)的解析來開發(fā)高度選擇性和更有效的抑制劑。

最近也有越來越多新的高效選擇性抑制劑被報道，例如主要針對ROCK1的抑制劑MBPTA，是一種苯并呋喃衍生物，在SH-SY5Y神經(jīng)母細胞瘤細胞中顯示出神經(jīng)保護作用[35]。而另一種主要針對ROCK2的抑制劑Compound 24在人卵巢癌細胞系SKOV-3中，可以通過激活外源性死亡受體途徑誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡[36]。隨著研究的深入，新型ROCK抑制劑已逐漸用于研究非癌性疾病的治療。同樣是主要針對ROCK2的抑制劑，KD025(以前稱為SLx-2119)通過ROCK2依賴性機制部分抑制3T3-L1細胞的脂肪生成，除脂肪生成因子FABP4和Glut4外，KD025下調(diào)了脂肪形成過程中關(guān)鍵的脂肪形成轉(zhuǎn)錄因子PPARγ和C /EBPα的表達，因此KD025有望成為抗脂肪形成或肥胖癥藥物[37]。在其他的研究報道中，作為ROCK的抑制劑，DL0805及其衍生物在缺氧的條件下對肺動脈血管細胞，包括人肺動脈內(nèi)皮細胞(HPAEC)和人肺動脈平滑肌細胞(HPASMC)具有保護作用[38]。

3.2 RCOK抑制劑與其他抗癌療法的聯(lián)用

隨著研究的深入，除了以往的單獨使用ROCK抑制劑來治療癌癥，越來越的研究開始探討將ROCK抑制劑與其他抗癌療法聯(lián)用的效果。最近的一項實驗表明，在人類非典型慢性粒細胞白血病(aCML)細胞中，Y27632和法舒地爾增加了酪氨酸激酶抑制劑伊馬替尼的抗增殖和促凋亡作用[39]。同樣的，ROCK抑制劑與MEK或ERK抑制劑可以聯(lián)合用于NRAS突變性黑色素瘤的治療。當(dāng)將ROCK抑制劑添加MEK抑制劑中來進行治療時，可以使得MEK抑制劑的劑量顯著降低。這有利于減緩MEK抑制劑所存在的嚴重劑量依賴的靶點毒性，避免了MEK抑制劑迫使黑素瘤患者停止治療或降低劑量[40]。

但是，在某些情況下，將ROCK抑制與化學(xué)治療劑聯(lián)合使用可能導(dǎo)致增強的腫瘤化學(xué)耐藥性。例如，Y27632在成神經(jīng)細胞瘤細胞中對ROCK的抑制作用導(dǎo)致順鉑細胞毒性后腫瘤存活率提高[41]。因此，在開發(fā)聯(lián)用ROCK抑制劑的新型抗癌療法時，應(yīng)考慮并應(yīng)排除ROCK抑制劑可能的有害作用。

4 總結(jié)與展望

ROCK蛋白對許多細胞骨架相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)具有主要影響，從而有助于實現(xiàn)廣泛的細胞功能。近年來越來越多的證據(jù)表明，ROCK信號至少在許多重要的癌癥相關(guān)表型中起著至關(guān)重要的作用。靶向ROCK信號的研究越來越體現(xiàn)在癌癥治療中，特別是在抑制腫瘤細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移，腫瘤生長，血管生成，與癌癥相關(guān)的細胞外基質(zhì)改變和血液系統(tǒng)惡性腫瘤中。盡管ROCK抑制劑法舒地爾已經(jīng)在臨床上應(yīng)用了20年，但目前尚未用于癌癥治療，并且涉及人類癌癥的臨床試驗數(shù)量仍然有限。

將逐漸發(fā)現(xiàn)的ROCK信號通路新的作用轉(zhuǎn)化為抗癌治療的效果，仍存在許多挑戰(zhàn)。當(dāng)前有關(guān)ROCK信號在腫瘤發(fā)生發(fā)展中所起作用的信息尚不完善，尤其是ROCK在調(diào)節(jié)包括原發(fā)性腫瘤細胞在內(nèi)的腫瘤細胞，包括它們的遷移、增殖、凋亡、存活等方面的促進或抑制作用的機制仍然不清楚。然而，逐漸為人們所知的是，ROCK下游信號傳導(dǎo)可能在很大程度上取決于腫瘤細胞的類型和微環(huán)境。最近已經(jīng)開發(fā)出了更多的有效和選擇性的ROCK抑制劑，其中一些可能在不久的將來在癌癥治療中顯示出廣闊的前景。同時值得注意的是，不少ROCK抑制劑與其他抗癌藥的聯(lián)合治療產(chǎn)生了更顯著的抗癌作用，并且降低了對單一藥劑的耐藥性。我們還需要更深入地研究癌癥的發(fā)病機制，以及ROCK1及其抑制劑與腫瘤的關(guān)系，以期為癌癥的治療提供更多可行的辦法。