夏高輝，孔秋嬋，陳慶生，龔盛昭

(1.廣州環(huán)亞化妝品科技有限公司，廣東 廣州 510663; 2.廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院 輕化工技術(shù)學(xué)院，廣東 廣州510300)

皮膚是人體最大的器官，完整的皮膚屏障結(jié)構(gòu)與功能不但對于維持10%～20%的正常皮膚含水量至關(guān)重要，而且可以形成完整的第一道防線抵御外界機械、化學(xué)、物理及生物等各種刺激對肌膚的傷害[1-3]。但由于受環(huán)境因素和機體自身健康狀況影響，體內(nèi)氧化和抗氧化系統(tǒng)平衡被打破，導(dǎo)致皮膚屏障系統(tǒng)出現(xiàn)損傷，角質(zhì)層含水量低于10%，皮膚出現(xiàn)干燥、粗糙、皸裂、老化的現(xiàn)象。隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展和國民生活水平的提高，人們越來越重視皮膚的保養(yǎng)，同時對于化妝品質(zhì)量和安全性能的要求也越來越高，因此使用天然護膚品已成為全球趨勢。天然植物保濕抗氧化劑由于來源廣泛，具有良好的補水抗氧化效果、親膚、溫和等優(yōu)點[4-5]，日漸成為化妝品領(lǐng)域的寵兒。然而天然植物原料存在成分比較復(fù)雜、活性成分相對來說不穩(wěn)定性、使用成本較高等問題，這些問題是阻礙天然化妝品發(fā)展的主要原因[6]。天然活性物化妝品開發(fā)和研究的關(guān)鍵是植物原料中復(fù)雜活性成分的提取分離、改善提取物的穩(wěn)定性以及降低天然活性物在化妝品中的使用成本。得益于現(xiàn)代生物科技、提取分離技術(shù)、精制純化手段及活性成分穩(wěn)定化技術(shù)的發(fā)展，阻礙天然活性物化妝品發(fā)展的這一技術(shù)難題已逐步得到解決。

現(xiàn)代科學(xué)研究表明，玫瑰、鐵皮石斛、蘆薈、銀耳等含有豐富的黃酮類、氨基酸類、多糖類成分，因此具有良好的保濕抗氧化功效[7-15]。筆者根據(jù)君臣佐使的中藥配伍原則，將玫瑰、鐵皮石斛、蘆薈、銀耳組合起來，研究提取工藝對組合物功效的影響，確定最優(yōu)提取工藝，并將其應(yīng)用于保濕抗衰類化妝品中，通過人體皮膚試驗對中藥保濕抗衰組合的功效進行驗證，以得到具有良好保濕和抗衰功效的中藥組合物，為化妝品行業(yè)保濕抗衰原料及天然植物原料開發(fā)應(yīng)用思路的拓展提供一定的幫助。

1 實驗部分

1.1 主要試劑與儀器

玫瑰花干花、銀耳、鐵皮石斛、蘆薈干片：市售；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，98%：阿拉丁試劑有限公司；鄰苯三酚、分析純：阿拉丁試劑有限公司；鹽酸、分析純：廣州精科生物科技有限公司；硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O)、分析純：廣州精科生物科技有限公司；30% H2O2、分析純：廣州精科生物科技有限公司；水楊酸、分析純：廣州精科生物科技有限公司；0.05 mol/L pH=8.2的Tris-HCl緩沖溶液：廣州精科生物科技有限公司；磷酸氫二鈉、分析純：廣州精科生物科技有限公司；磷酸二氫鈉、分析純：廣州精科生物科技有限公司。超聲波清洗機DL-360E：上海之信儀器有限公司；HWS 24型水浴鍋：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；皮膚水分含量Corneometer測試探頭：德國Courage+Khazaka公司；皮膚水分流失(YEWL) Tewameter TM 300測試探頭：德國Courage+Khazaka公司；CK 皮膚水份測試探頭Cutometer MPA 580：德國Courage+Khazaka公司。

1.2 中藥保濕抗衰組合物提取物的制備

按配比稱取玫瑰花、銀耳、鐵皮石斛、蘆薈干片共10 g，混合后粉碎，得到藥材混合物；將藥材混合物置于圓底燒瓶中，加入15倍量的乙醇溶液，在水浴回流條件下連續(xù)超聲(超聲功率90 W)輔助提取1～3次，每次45～90 min，過濾得到粗提取液；將粗提取液在70℃條件下減壓蒸餾濃縮至10 mL，將上述濃縮液經(jīng)D101型大孔樹脂柱純化以除去會對后續(xù)應(yīng)用產(chǎn)生不利影響的無機鹽類等物質(zhì)，用乙醇溶液洗脫，收集洗脫液；在55℃條件下減壓蒸餾至10 mL，得到中藥保濕抗衰組合物提取物。

1.3 中藥組合物配比篩選

根據(jù)中藥君臣佐使組方原理將四味中藥配伍運用，以玫瑰為君藥，玫瑰具有良好的保濕、抗氧化效果；以鐵皮石斛為臣藥，鐵皮石斛富含石斛多糖、氨基酸等成分，滋潤肌膚和抵抗衰老；以蘆薈為佐藥，緩解皮膚干燥、延緩肌膚衰老；以銀耳為使藥，銀耳的主要成分為銀耳多糖，是一種植物源性高效保濕劑，分子量達到100～130萬，并且分子中富含大量的極性基團例如羥基、羧基等，這些基團容易與水分子形成氫鍵，從而結(jié)合大量的水分，銀耳多糖分子間以網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的形式相互交織，于此同時與水分子中的氫結(jié)合，從而呈現(xiàn)出強大的保濕鎖水能力和比較高效的保濕功效。通過研究不同中藥組分配比對組合物抗氧化功效的影響篩選最佳中藥組分配比。具體實驗設(shè)計見表1。藥物準備及提取方法見1.2。

表1 實驗設(shè)計

1.4 提取過程中各因素對提取效果的影響

組合物的提取效果受提取過程中各因素的影響，其中提取溶劑、提取時間以及提取次數(shù)等因素對提取效果的影響較大，因此筆者以提取過程中的乙醇濃度(A/%)、提取時間(B/min)、提取次數(shù)(C/次)為考察對象，以提取物的超氧陰離子自由基清除能力和羥自由基清除能力為綜合考慮指標，選用L9 (34)正交試驗表進行試驗，從而篩選出最佳提取工藝，正交試驗因素與水平見表2。藥物準備及提取方法見1.2。

表2 正交試驗因素與水平

1.5 抗氧化功效評價試驗

1.5.1 超氧陰離子自由基清除能力評價試驗

取0.05 mol/L pH 8.2的Tris-HCl緩沖溶液4.5 mL，于25℃水浴鍋中預(yù)熱30 min。再加入1 mL樣品溶液和0.4 mL 25 mol/L的鄰苯三酚溶液，混勻后，于25℃水浴中反應(yīng)5 min，加入1 mL 8 mol/L的HCl終止反應(yīng)。以Tris-HCl緩沖溶液作參比，在299 nm處測吸光度值?？瞻讓φ战M用1 mL樣品溶液的溶劑來替代樣品溶液。

超氧陰離子自由基清除率的計算公式如式(1)所示：

超氧陰離子自由基清除率(%)=

[1-(A1/A0)]×100%)

(1)

式(1)中，A1為樣品組的吸光度值，A0為空白對照組的吸光度值。

1.5.2 羥自由基清除能力評價試驗

在25 mL比色皿中依次加入2 mmol/L FeSO43 mL，1 mmol/L H2O23 mL，搖勻，接著加入6 mmol/L水楊酸3 mL，搖勻，于37℃水浴加熱15 min后取出，測其吸光度；分別加入一定濃度的樣品溶液，搖勻，繼續(xù)水浴加熱15 min，取出測其吸光度。

羥自由基清除率的計算公式如式(2)所示：

羥自由基清除率(%)=

(2)

式(2)中，A0、Ax、Ax0分別為未加樣品前反應(yīng)體系的吸光度值、樣品清除羥自由基后體系的吸光度值、樣品溶劑清除羥自由基后體系的吸光度值。

1.6 在精華液中的應(yīng)用

配方組成見表3。將添加相原料羥苯甲酯和羥苯丙酯預(yù)先在丁二醇中加熱溶解至澄清透明，備用；將水相原料投入至去離子水中，加熱至75～85℃，攪拌至溶解均勻；保溫10 min，水相降溫至60℃，邊攪拌邊緩慢加入已預(yù)先在丁二醇中溶解好的羥苯甲酯和羥苯丙酯，攪拌至溶解均勻；冷卻至40℃，加入中藥保濕抗衰組合物，攪拌均勻，即得保濕抗衰精華液待測樣。將配方中的中藥保濕抗衰組合物以去離子水代替，按照相同的方法制得保濕抗衰精華液對照樣。

表3 保濕抗衰精華液配方

1.7 人體皮膚保濕抗衰效果測試

1.7.1 皮膚水分含量及皮膚水分流失(TEWL)試驗

皮膚水分含量及皮膚水分流失(TEWL)試驗，水分測試采用的是世界公認的CORNEOMETER?法——電容法，皮膚水分流失(TEWL)對于皮膚角質(zhì)層功能的評估是一個非常重要的參數(shù)，在國際上已經(jīng)得到了非常廣泛的認可[16-18]。皮膚角質(zhì)層的功能越良好，試驗測到的角質(zhì)層水分的含量就會越高，相應(yīng)的皮膚水分流失(TEWL)的數(shù)值就會越低。試驗采用的測試儀器為皮膚水分含量Corneometer測試探頭和皮膚水分流失(TEWL) Tewameter TM 300測試探頭(德國Courage+Khazaka公司)。

測試方法具體為：

選取干性肌膚志愿者(刺痛感累計≥3分者)20名，年齡控制在20～45歲，男女比例各50%。要求受試志愿者受試部位在測試前15天不能使用任何產(chǎn)品(化妝品、外用藥品、內(nèi)服保健品)。試驗前，要求受試志愿者對面部進行清洗并在清洗后2 h進入氣候控制室(22±1℃，相對濕度50%)靜坐20 min以上，并保持放松狀態(tài)。

試驗中按隨機表進行半邊臉測試，一側(cè)為樣品，另一側(cè)為對照，選取志愿者的左右鼻唇溝部分進行皮膚水分含量及水分流失(TEWL)測試，取3個值的平均值作為左右鼻唇溝水分含量數(shù)據(jù)(d0)及鼻唇溝皮膚水分流失(TEWL)的數(shù)據(jù)(d0)。測試結(jié)束后，志愿者需按要求使用，一側(cè)臉涂抹樣品，另一側(cè)臉涂抹對照品。連續(xù)使用63天，并要求試驗者在試驗的第7天(d7)、第14天(d14)、第21天(d21)、第28天(d28)、第35天(d35)、第42天(d42)、第49天(d49)、第56天(d56)及第63天(d63)進行回訪。

1.7.2 皮膚彈性測試

選取外眼角有皺紋人群(兩側(cè)皺紋等級為1～7之間，且左右兩側(cè)皺紋等級相同者)20名，年齡在30～60歲，男女比列各50%。受試部位前15天不能使用任何產(chǎn)品(化妝品、外用藥品、內(nèi)服保健品)。試驗前，要求受試志愿者對面部進行清洗并在清洗后2 h進入氣候控制室(22±1℃，相對濕度50%)靜坐20 min以上，并保持放松狀態(tài)[19]。

試驗中按隨機表進行半邊臉測試，一側(cè)為樣品，另一側(cè)為對照，選取志愿者的左右臉頰、眼角進行皮膚彈性測試，測試三次取平均值作為左右眼角皮膚彈性數(shù)據(jù)(d0)。測試結(jié)束后，志愿者需按要求使用，一側(cè)臉涂抹樣品，另一側(cè)臉涂抹對照品。連續(xù)使用63天，并要求試驗者在試驗的第7天(d7)、第14天(d14)、第21天(d21)、第28天(d28)、第35天(d35)、第42天(d42)、第49天(d49)、第56天(d56)及第63天(d63)進行回訪。

1.7.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

利用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行方差分析，通過t檢驗對志愿者測試所得數(shù)據(jù)進行評估。統(tǒng)計結(jié)果通過皮膚水分值含量變化、皮膚水分流失變化和皮膚彈性變化說明中藥保濕抗衰組合物的保濕抗衰功效。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同中藥配比對組合物抗氧化功效的影響

以獲得組合物的抗氧化能力(超氧陰離子自由基和羥自由基清除率)為綜合指標，篩選中藥組合物的最優(yōu)組分配比。具體結(jié)果如表4所示。由表4結(jié)果可以看出，5、6、9號組合物對超氧陰離子自由基清除率較高，5、7、8號組合物對羥自由基清除率較高，綜合考慮選擇5號組合物的配比作為最優(yōu)配比，即m(玫瑰)：m(鐵皮石斛)：m(蘆薈)：m(銀耳)=4:3:2:1。君藥是指在處方中對主證或主病起關(guān)鍵治療作用的藥物，藥力居方劑組分之首，是不可或缺藥物；臣藥是指輔助君藥可有效強化主病和主證治療效果的藥物；佐助藥是指治療次要兼證藥物；使藥主要作用在引組方藥物直達病所或調(diào)和諸藥作用，用量最少卻又不可缺少。元朝李杲認為“君藥，分量最多，臣藥次之，使藥又次之，不可令臣過于君，君臣有序，相與宣攝，則可以御邪除病矣”。由實驗結(jié)果來看，四種中藥的最優(yōu)配比正符合中藥君臣佐使的藥量規(guī)律，玫瑰具有良好的保濕和抗氧化效果，對于組合物的保濕和抗氧化功效影響最大，因此在組合物中不可或缺且占的比例最大；鐵皮石斛在抗氧化方面的功效較好，作為臣藥增強玫瑰的抗氧化效果；蘆薈具有鎮(zhèn)靜舒緩的功效，可以緩解肌膚炎癥帶來缺水和衰老癥狀；銀耳具有高效保濕功效，可以迅速為肌膚補充水分，短時令肌膚水分充盈，消除肌膚干燥帶來不適。

表4 不同配比組合物的自由基清除率

2.2 正交試驗結(jié)果

以超氧陰離子自由基清除率為指標的正交試驗分析結(jié)果見表5、表6，通過對中藥保濕抗衰組合物超氧陰離子自由基清除率的測定，得出每個試驗的超氧陰離子自由基清除率，也即中藥保濕抗衰組合物的抗氧化能力，由正交試驗結(jié)果和方差分析結(jié)果可知，A2>A3>A1，B1>B3>B2，C3>C2>C1。主次因素依次為C>A>B，即提取次數(shù)影響最大，其次為乙醇濃度，提取時間影響最小；由方差分析表結(jié)果可知，F(xiàn)0.05(2，4)≥FA>F0.10(2，4)，F(xiàn)0.05(2，4)≥FC>F0.10(2，4)，F(xiàn)0.25(2，4)≥FB，因此A和C屬于對提取工藝影響顯著的因素，而B因素對提取工藝的影響不顯著,無統(tǒng)計學(xué)意義。因此以抗氧化能力為指標的最優(yōu)提取工藝組合為：A2B1C3，即用15倍量60%乙醇超聲輔助加熱回流提取3次，每次45 min。在最佳提取工藝條件下，組合物提取物的超氧陰離子自由基清除能力最強的原因可能是此時中藥中的具有抗氧化功效的多糖類、黃酮類等有效成分溶出率更高，因而抗氧化效果更佳。

表5 正交試驗方案與結(jié)果

表6 方差分析結(jié)果

2.3 驗證性試驗

將提取量擴大為20倍，按照最優(yōu)提取工藝條件組合A2B1C3重復(fù)試驗3次，進行驗證性試驗，結(jié)果顯示中藥保濕抗衰組合物提取物的超氧陰離子自由基清除率分別為91.67%，92.03%，91.89%，平均值為91.86%，RSD值為0.1975%(n=3)，高于表中的任何組合，表明該工藝可靠，重復(fù)性良好。

2.4 人體皮膚保濕抗衰效果測試

2.4.1 皮膚水分含量變化

人體皮膚水分含量變化見圖1。由圖1可知，使用對照樣品，皮膚中水分值略有增加，但是無明顯變化趨勢，使用至28天皮膚水分值提高15%左右，繼續(xù)使用至63天皮膚水分值提高19%左右；與對照樣品相比，使用中藥保濕抗衰精華液能明顯提高皮膚水分值，且隨著時間推移，皮膚水分值不斷增加，使用28天皮膚水分值提高39%左右，繼續(xù)使用至63天皮膚水分值增加值穩(wěn)定至47%左右。通過統(tǒng)計學(xué)分析可知，在實驗第35、42、49、56、63天時有顯著性差異(P<0.05)，說明添加具有保濕和抗衰功效組合物的保濕抗衰精華液具有提高皮膚水分含量的功效，進而可以看出本研究中的組合物有良好的保濕功效。

圖1 皮膚水分值變化

2.4.2 皮膚經(jīng)皮水分流失變化

經(jīng)皮水分流失(TEWL)被定義為經(jīng)被動擴散通過皮膚輸運的水分。一般皮膚屏障功能好的TEWL較低，皮膚屏障損傷的皮膚TEWL會升高。因而可以用TEWL的變化反映皮膚屏障功能的變化。TEWL變化結(jié)果見圖2。由圖2結(jié)果可知，使用對照樣品，TEWL略有降低，但是降低趨勢不明顯，使用至28天TEWL降低7%左右，繼續(xù)使用至63天TEWL僅降低10%左右，說明使用對照樣品皮膚屏障功能提升不明顯；與對照樣品相比，使用中藥保濕抗衰精華液能明顯降低TEWL，且隨著時間推移，TEWL不斷降低，使用28天TEWL降低27%左右，繼續(xù)使用至63天TEWL降低量逐步穩(wěn)定至33%左右。通過統(tǒng)計學(xué)分析可知，在實驗第21、28、35、42、49、56、63天時有顯著性差異(P<0.05)，說明添加中藥保濕抗衰組合物的精華液明顯增強了皮膚的屏障功能，提升了皮膚的保水能力，可以看出本研究中的組合物有良好的增強皮膚屏障功能的功效。

圖2 皮膚經(jīng)皮水分流失變化

2.4.3 皮膚彈性變化

皮膚彈性表征值R2用于表示在測試中皮膚被拉伸后回復(fù)能力的大小。越是年輕的皮膚，彈性好的皮膚，R2越大；反之，越是年老的皮膚，彈性差的皮膚，R2越小。皮膚彈性表征值R2變化結(jié)果如圖3所示。由圖中連續(xù)使用保濕抗衰精華液和對照樣品63 天R2的變化趨勢可以看出，使用對照樣品63天R2的變化不大，連續(xù)使用28天提升7%左右，連續(xù)使用63天提升僅為10%左右；使用保濕抗衰精華液63天R2的提升較為明顯，連續(xù)使用28天提升20%左右，連續(xù)使用63天后R2的提升幅度達到30.5%。通過統(tǒng)計學(xué)分析可知，在實驗第42、49、56、63天時有顯著性差異(P<0.05)，說明通過皮膚彈性的對比試驗結(jié)果可以證明添加中藥保濕抗衰組合物的精華液對皮膚彈性有明顯的提升效果，由此可以看出該研究中的組合物有良好的提升皮膚彈性的效果，具有良好的抗衰功效。

圖3 皮膚彈性變化

3 結(jié)論

(1)以超氧陰離子自由基和羥自由基清除率為衡量指標，采用傳統(tǒng)中藥君臣佐使的配伍理念，研究中藥保濕抗衰組合物的配比對抗衰效果的影響，篩選出各中藥的最佳質(zhì)量配比為m(玫瑰)：m(鐵皮石斛)：m(蘆薈)：m(銀耳)= 4∶3∶2∶1。玫瑰為君藥，鐵皮石斛為臣藥，蘆薈為佐藥，銀耳為使藥。

(2)以超氧陰離子自由基清除率為衡量指標，采用正交試驗法研究乙醇濃度(A/%)、提取時間(B/min)、提取次數(shù)(C/次)對中藥保濕抗衰組合物提取工藝的影響。由正交試驗結(jié)果和方差分析結(jié)果可知，提取次數(shù)影響最大，其次為乙醇濃度，提取時間影響最?。挥煞讲罘治霰斫Y(jié)果可知，提取次數(shù)和乙醇濃度屬于對提取工藝影響顯著的因素，而提取時間對提取工藝的影響不顯著無統(tǒng)計學(xué)意義，優(yōu)選出的最佳提取工藝為：用15倍量60%乙醇超聲輔助加熱回流提取3次，每次45 min。按照最優(yōu)提取工藝重復(fù)試驗3次進行驗證，結(jié)果顯示中藥保濕抗衰組合物提取物的平均超氧陰離子自由基清除率為91.86%，表明優(yōu)選出的最優(yōu)工藝可行，適合滿足工藝大生產(chǎn)的要求。

(3)試驗制得的添加中藥保濕抗衰組合物的精華液具有良好的保濕效果和增加肌膚彈性的效果，表現(xiàn)出較好的保濕抗衰性能(P<0.05)。