楊卜瑞 賀小芳 師晶晶 張鈴枝 陳曉靜 李廷荃 楊麗芳

摘要 目的：基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討山戀菇-浙貝母藥對治療乳腺癌的作用機(jī)制。方法：采用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）收集山慈菇、浙貝母的活性成分和靶點(diǎn)，并通過Uniprot數(shù)據(jù)庫選擇對應(yīng)的藥物作用蛋白質(zhì)名稱對應(yīng)基因名，通過Cytoscape3.7.2構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，同時檢索疾病數(shù)據(jù)庫（GeneCards）和在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（OMIM）獲得乳腺癌相關(guān)靶點(diǎn)。使用Cytoscape3.7.2構(gòu)建“活性成分與乳腺癌交集靶點(diǎn)”蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)，并對PPI網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)進(jìn)行篩選，得出關(guān)鍵靶點(diǎn);運(yùn)用Metascape數(shù)據(jù)庫對關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體（GO）功能分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析。結(jié)果：研究從山慈菇-浙貝母藥對中篩選獲得10個重要活性成分，包括β-谷固醇，豆甾醇，2-甲氧基-9，10-二氫菲4，5-二醇，哲貝瑞醇等，作用于FUS和RPL24等71個關(guān)鍵靶點(diǎn)。C0富集分析共鑒定出31個條目，包括細(xì)胞組分3項(xiàng)、分子功能8項(xiàng)、生物學(xué)過程20項(xiàng)。此外，KEGG富集通路分析共確定了14條富集通路。結(jié)論：山慈菇-浙貝母藥對治療乳腺癌的作用體現(xiàn)了中藥多成分、多靶點(diǎn)、多通路的特點(diǎn)，其作用機(jī)制可能是通過調(diào)控癌癥途徑、調(diào)控信號通路途徑、調(diào)控介導(dǎo)細(xì)胞成熟和改變細(xì)胞周期等多個方面發(fā)揮治療乳腺癌的作用。本研究為后續(xù)進(jìn)一步研究提供思路和借鑒。

關(guān)鍵詞 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);山慈菇;浙貝母;藥對;乳腺癌;腫瘤;作用機(jī)制;靶點(diǎn)

中圖分類號：R273;R285

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

doi：10.3969/[J].is.1673-7202.2021.21.007

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢。有研究表明，我國乳腺癌患者5年生存率為83.2%山，在我國，乳腺癌在城市中的發(fā)病率為女性惡性腫瘤的第2位，在一些大城市中已上升至第1位，已經(jīng)成為婦女健康的最大威脅。目前，乳腺癌的治療以手術(shù)、放療、化療以及內(nèi)科綜合治療為主。但手術(shù)和放療、化療后脈絡(luò)損傷、氣機(jī)受阻、氣滯血瘀、瘀血內(nèi)停、津液出入受阻，易發(fā)生皮下積液、皮瓣壞死、上肢水腫、肝腎損傷，影響機(jī)體代謝2，因此，中醫(yī)藥以其不良反應(yīng)小、療效好的特點(diǎn)為乳腺癌患者多種并發(fā)癥的治療帶來了新的思路。山慈菇，為蘭科杜鵑蘭屬植物杜鵑蘭或獨(dú)蒜蘭屬植物獨(dú)蒜蘭的假鱗莖。味甘、辛，性涼，歸肝、脾經(jīng)，具有清熱解毒，消腫散結(jié)之功效?，F(xiàn)代藥理研究表明：B-谷固醇，豆甾醇，2-甲氧基9，10-二氫菲4，5-二醇是其主要活性成分。浙貝母為百合科植物浙貝母的鱗莖，味苦，性寒，歸肺、心經(jīng)，有清熱化痰、散結(jié)消癰的功效。其主要活性成分為生物堿、多糖和總皂苷等，具有抗?jié)儭㈡?zhèn)痛、鎮(zhèn)咳祛痰、改善肺功能、抗炎、抗氧化、抑制細(xì)胞增殖、逆轉(zhuǎn)耐藥等功效4。其中胡凱文等的發(fā)現(xiàn)貝母素甲及貝母素乙對人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7/ADR可逆轉(zhuǎn)耐藥5倍以上有效改善乳腺癌的耐藥。同時，臨床療效及藥理研究均表明，山慈菇、浙貝母二者配伍，相須為用，在乳腺癌等實(shí)體腫物的治療中可增強(qiáng)軟堅散結(jié)的作用，改善乳腺癌局部紅腫熱痛癥狀，抑制瘤體生長。盡管山慈菇-浙貝母是乳腺癌臨床中醫(yī)治療的常用藥對，然而其具體作用基因靶點(diǎn)尚不明確，這在一定程度上限制了山慈菇浙貝母藥對在臨床的推廣使用。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為一門新興學(xué)科，旨在通過藥物基因-疾病相互作用分析關(guān)系，將傳統(tǒng)中藥與現(xiàn)代藥理學(xué)、分子生物學(xué)、生物信息學(xué)相整合，并為中醫(yī)藥藥對在抗擊乳腺癌的過程中提供分子藥理學(xué)證據(jù)，為乳腺癌的現(xiàn)代中醫(yī)診療提供新思路。本課題通過采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法從基因水平分析山慈菇-浙貝母的有效成分，預(yù)測其作用靶點(diǎn)及相關(guān)信號通路，闡釋山慈菇-浙貝母藥對在抗擊乳腺癌過程中的作用機(jī)制，為臨床乳腺癌的治療提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1山慈菇-浙貝母有效成分的收集和篩選在計

算機(jī)生物實(shí)驗(yàn)室中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology DatebaseAnalysisPlatform，TCMSP，https：//tcmspwcom/tcms.php）中藥數(shù)據(jù)庫，分別檢索山慈菇和浙貝母的所有化學(xué)成分，其中山慈菇18個、浙貝母17個。為更好地篩選山慈菇浙貝母藥對中的有效化合物，本研究結(jié)合口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%，類藥性（Drug Likeness，DL）≥0.18作為活性成分的篩選條件。

1.2藥物靶點(diǎn)基因的篩選在TTCMSP中根據(jù)篩選

出的藥對活性分子選擇對應(yīng)的蛋白靶點(diǎn)，刪除無靶點(diǎn)信息的活性成分。通過Uniprot（htts：//sparql.uniprot.org/）蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫將收集的藥物作用靶點(diǎn)轉(zhuǎn)化為基因名稱，物種來源為“Homo sapiens”，同時刪除無效靶點(diǎn)，將藥物基因名稱標(biāo)準(zhǔn)化處理后錄入Excel表格。

1.3乳腺癌靶點(diǎn)基因的篩選利用在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM，https：//omim.org/）iiGenecards（https：//www.genecards.org/）疾病數(shù)據(jù)庫檢索關(guān)鍵詞breastcancer，獲取乳腺癌相關(guān)的基因靶點(diǎn)，同時合并2個疾病數(shù)據(jù)庫的搜索結(jié)果，去除重復(fù)和假陽性的基因，選擇score》15作為疾病靶點(diǎn)篩選的標(biāo)準(zhǔn)。

1.4構(gòu)建中藥活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)使用Cyto-scape3.7.2軟件構(gòu)建山慈菇-浙貝母藥對治療乳腺癌的“中藥-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)圖中的節(jié)點(diǎn)分別為藥物名稱、化學(xué)成分、澘在靶點(diǎn)。其中化學(xué)成分與潛在靶點(diǎn)之間有相互作用關(guān)系的以邊相連，使用NetworkAnalysis插件對相應(yīng)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓分析。

1.5蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析使用Cytoscape3.7.2的Biso Genet插件分別構(gòu)建“藥物靶點(diǎn)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（Protein Protein InteractionPPI）網(wǎng)絡(luò)”和“乳腺癌靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)”。通過”Merge"'功能對2個PPI網(wǎng)絡(luò)取交集，獲得交集網(wǎng)絡(luò)。使用“analyze network”'功能對網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)進(jìn)行分析，分析內(nèi)容包括Degree、Betweenness

Centrality，Closeness Centralityfll Neighborhood Ceon-nectivity。通過Degree、BC、CC和NC指標(biāo)篩選關(guān)鍵靶點(diǎn)，并從關(guān)鍵靶點(diǎn)中篩選出活性成分和乳腺癌直接相關(guān)的靶點(diǎn)作為核心靶點(diǎn)。

1.6基因本體分析和京都基因與基因組百科全書富集分析利用Metascape數(shù)據(jù)庫對上述得到的核心靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體（Gene Ontology，GO）功能分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析，以了解“山慈菇-浙貝母”藥對的主要成分對于乳腺癌的GO功能和藥對主要成分的靶標(biāo)蛋白在信號通路中的作用，然后把數(shù)據(jù)信息錄人微生信平臺進(jìn)行可視化處理。

2結(jié)果

2.1山慈菇-浙貝母有效成分的收集和篩選共收集到山慈菇化學(xué)成分18個，浙貝母化學(xué)成分17個。篩選山慈菇有效成分3個，浙貝母有效成分7個，山慈菇和浙貝母共有活性成分1個：β-谷固醇。見表1。

2.2藥物靶點(diǎn)的篩選收集刪除無對應(yīng)靶點(diǎn)信息活性成分Ziebeimine和Chaksine和重復(fù)活性成分beta-sitosterol。共得到7個活性成分及對應(yīng)的131個作用靶點(diǎn)，標(biāo)準(zhǔn)化后共獲取71個對應(yīng)靶點(diǎn)。

2.3中藥-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)繪制的“藥物活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖中共包括76個節(jié)點(diǎn)，127條邊。網(wǎng)絡(luò)中黃色節(jié)點(diǎn)代表藥物，粉色節(jié)點(diǎn)代表活性成分，紅色節(jié)點(diǎn)代表靶點(diǎn)。網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鎏崾荆?種活性成分能與10個以上的靶點(diǎn)連接，β-谷固醇（Degree=37）、豆甾醇（Degree=28）和2-甲氧基9，10-二氫菲4，5-二醇（Degree=27）3種活性成分能與20個以上靶點(diǎn)連接，Pelargonidin（Degree=15）1種活性成分能與10個以上靶點(diǎn)連接，因此可認(rèn)為上述4個活性成分是“山慈菇-浙貝母”藥對的主要活性成分。見圖1。

2.4成分靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建共獲得與藥物化學(xué)成分直接或間接相關(guān)的作用靶點(diǎn)3187個，相互關(guān)系77135條;對乳腺癌作用的1766個靶點(diǎn)構(gòu)建PI網(wǎng)絡(luò)，獲得與乳腺癌相關(guān)活性成分直接或間接作用靶點(diǎn)12249個，相互關(guān)系237624條。將2個PPI網(wǎng)絡(luò)通過Intersection求交集，得到1個有3124個靶點(diǎn)，76656條相互關(guān)系的網(wǎng)絡(luò)。篩選交集網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵靶點(diǎn)。在交集網(wǎng)絡(luò)中，Degree的中位數(shù)為28。見圖2。

篩選出Degree》=58的子網(wǎng)絡(luò)包含862個靶點(diǎn)和36680個靶點(diǎn)與靶點(diǎn)的相互關(guān)系。由于靶點(diǎn)數(shù)量較多，故對子網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行二次篩選。子網(wǎng)絡(luò)的Degree BC、CC、NC的中位數(shù)分別為93、6.656×100.405、138.224，選擇Degree≥93、BC=6.656×10-3、CC=0.405、NC=138.224的靶點(diǎn)作為關(guān)鍵靶點(diǎn)，最終得到關(guān)鍵靶點(diǎn)168個，靶點(diǎn)間相互關(guān)系2762條。168個關(guān)鍵靶點(diǎn)中前10個與活性成分和乳腺癌均直接相關(guān)的靶點(diǎn)分別為：FUS（Degree=72）、RPL24（Degree=69）、RPS2（Degree=67）、EIF4A3（Degree=65）、RPL6（Degree=65）、CUL4B（Degree=64）、TUBGI（Degree_=64）、RPL7反應(yīng)、凋亡信號通路、生殖結(jié)構(gòu)發(fā)育及髓系細(xì)胞分化的正調(diào)控等多個生物過程。對14條KEGG信號通路進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)山慈菇-浙貝母藥對治療乳腺癌的信號通路主要集中為3類，1）調(diào)控癌癥途徑hsa05200信號通路、k005210信號通路、hsa0522等多條信號通路通過誘導(dǎo)凋亡發(fā)揮抗癌作用。2）信號通路途徑：hsa04915KEGG通路、k04657KEGG通路等多條信號通路與乳腺癌治療密切相關(guān)。其中雌激素受體陽性是導(dǎo)致乳腺癌死亡的主要因素hsa04915信號通路通過參與雌激素信號調(diào)節(jié)發(fā)揮治療乳腺癌的作用。ko04657信號通路參與L-17的表達(dá)，乳腺癌糖酵解活性的增強(qiáng)與促腫瘤免疫有關(guān)，而腫瘤糖酵解與免疫/炎癥功能之間的相互作用可以通過-17信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑介導(dǎo)。3）介導(dǎo)細(xì)胞成熟和改變細(xì)胞周期：hsa04914、ko04972、ko04110等多條通路通過孕酮介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟、影響胰腺分泌以及調(diào)控細(xì)胞周期共同發(fā)揮抗癌作用。

本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，對山慈菇-浙貝母藥對治療乳腺癌的作用機(jī)制進(jìn)行研究，研究表明，山慈菇-浙貝母藥對主要通過β-谷固醇、豆甾醇、2甲氧基9，10-二氫菲4，5-二醇、pelargonidin、嘧啶、哲貝瑞醇、6-甲氧基-2-乙?；?3-甲基-1，4-禁醌8-0-βD-吡喃葡萄糖苷等活性成分，調(diào)節(jié)FUS、RPL24等相關(guān)靶點(diǎn)的表達(dá)，進(jìn)而干預(yù)hsa05200、hsa05161koO5210、hsa04915、ko04933、ko04657、hsa05222hsa04919、ko05164、hsa05215、ko04370、hsa04914ko04972、ko0410等多條乳腺癌相關(guān)通路，從調(diào)控癌癥途徑、調(diào)控信號通路途徑、調(diào)控介導(dǎo)細(xì)胞成熟和改變細(xì)胞周期等多個方面發(fā)揮治療乳腺癌的作用。山慈菇-浙貝母藥對治療乳腺癌的作用機(jī)制體現(xiàn)了山慈菇-浙貝母藥對多靶點(diǎn)、多通路協(xié)同作用的特點(diǎn)。本研究可為中藥藥對參與乳腺癌治療提供思路和借鑒，也為臨床應(yīng)用提供一定的依據(jù)。

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（2020-11-30收稿責(zé)任編輯：王明

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（8187474）——鹿茸通過P3KAKT信號通路調(diào)控EPCs動員及歸巢促進(jìn)PAD大鼠血管新生的作用機(jī)制;山西省重點(diǎn)研發(fā)計劃項(xiàng)目（201803D31203）蟾蜈止痛膏治療中重度癌性疼痛的臨床研究;蕭氏脾胃學(xué)術(shù)流派傳承工作室建設(shè)項(xiàng)目（2020PY-LP-08）

作者簡介：楊卜ト瑞（1993.12-），男，碩士研究生在讀，研究方向：中醫(yī)腫瘤，E-mai：870112459@qq.com

通信作者：楊麗芳（1967.05-），女，碩士，主任醫(yī)師，研究方向：中醫(yī)腫瘤，E-mail：784788532@q.com