陸嘉逢 楊祖 冒燕 薛永峰 孔令印 王挺 梁波

近年來，利用母體外周血中的胎兒游離DNA進(jìn)行高通量測序的無創(chuàng)產(chǎn)前檢測技術(shù)（noninvasive prenatal testing，NIPT）逐漸興起。利用母體外周血游離胎兒DNA片段進(jìn)行產(chǎn)前診斷的前提是胎兒游離DNA 含量必須大于母體血漿總游離DNA 的4%，而胎兒游離DNA含量受孕周、母體體重和胎兒頂臀長度的影響［1-2］。同時，由于樣本中包括大量母體DNA 及胎兒基因組信息不完整，檢測結(jié)果會有一定的假陽性或者假陰性，因此該技術(shù)的臨床定位是進(jìn)行胎兒染色體非整倍體篩查，對于陽性結(jié)果需要借助羊膜穿刺（amniocentesis）或絨毛活檢（chorionic villus sampling，CVS）進(jìn)行確診［3］。

19 世紀(jì)70 年代，Shettles LB［4］和Rhine SA［5］等先后從宮頸分泌物中檢測到男性胎兒的Y 染色體，隨著熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridiza?tion，F(xiàn)ISH）技術(shù)和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)的廣泛應(yīng)用，證實了母體宮頸分泌物中確實含有胎兒的遺傳物質(zhì)。隨著免疫熒光、二代測序和單細(xì)胞測序技術(shù)的發(fā)展及Bol?nick在2014年報道一種利用免疫磁珠分離法從脫落宮頸細(xì)胞中分離出胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞的方法，即TRIC，使得利用子宮頸胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行產(chǎn)前診斷成為可能。與母體外周血游離胎兒DNA 片段相比，利用子宮頸胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行檢測的方法具有簡便易行、可獲得細(xì)胞數(shù)量多、形態(tài)學(xué)識別容易等優(yōu)點，具備開發(fā)為早期無創(chuàng)產(chǎn)前診斷技術(shù)的潛質(zhì)。當(dāng)樣本中胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞比例達(dá)到90%以上時，DNA 質(zhì)量可以與羊膜穿刺或CVS 獲得的DNA相媲美。本研究將TRIC 方法與全基因組測序方法結(jié)合，進(jìn)行胎兒染色體異常的分析，為子宮頸胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞用于產(chǎn)前診斷提供參考。

材料和方法

一、研究對象

樣本來源：選擇2018 年1 月到2018 年5 月就診于蘇州市立醫(yī)院，自然受孕、要求終止妊娠的孕婦，孕5～20 周。本研究得到蘇州市立醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（審批文號：K-2018-019-H01），并與受試者簽署臨床研究知情同意書。

樣本選取標(biāo)準(zhǔn)：（1）婦科檢查及B 超證實為早孕，孕周在5～20 周；（2）取樣前未同房。按照以上標(biāo)準(zhǔn)，共選取10例孕婦，年齡20 ～40歲。

二、實驗方法和步驟

1.樣本采集和處理

利用宮頸刷獲取宮頸管脫落細(xì)胞，然后將標(biāo)本置于20 mL PreservCyt（Holigic）溶液中。將含有20 mL PreservCyt 溶 液 的 標(biāo) 本，4 ℃400×g 離 心5 min，棄上清。加入10 mL 磷酸鹽緩沖液（phos?phate buffered saline，PBS），4 ℃400×g 離心5 min，棄上清；重復(fù)清洗3 次；加入10 mL PBS 重懸細(xì)胞，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.子宮頸胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞熒光檢測

10例樣本稀釋成200 μL PBS中含有50 ～100個細(xì)胞，手工涂片。在涂片區(qū)域，加入10 μg/mL β-HCG 一抗，4℃孵育過夜。次日洗片，加入異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記的二抗孵育1 h。洗片后加入4，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚（4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）及防熒光淬滅封片劑，避光保存。熒光顯微鏡觀察樣本中是否存在陽性細(xì)胞。

3.子宮頸胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞的分離及鑒定

選取含有陽性細(xì)胞的樣本進(jìn)行陽性細(xì)胞分選，分選方法如下：在20 μL 含有250 nm 羊抗小鼠IgG磁性納米顆粒的混合液中補充無菌PBS 至100 μL，然后加入5 μg 小鼠人類白細(xì)胞抗原-G （human leucocyte antigen-G，HLA-G）抗體，混勻，4 ℃孵育過夜。使用DynaMa-旋轉(zhuǎn)磁力架，PBS 清洗磁珠顆粒三次。用1.5 mL PBS 懸起子宮頸細(xì)胞，加入抗HLA-G 偶聯(lián)磁珠，4℃混合孵育過夜。用磁力架結(jié)合HLA-G 陽性細(xì)胞，收集未結(jié)合的細(xì)胞，并用PBS 清洗3 次。分別回收HLA-G 結(jié)合陽性細(xì)胞（胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞）和陰性細(xì)胞（母體細(xì)胞）。將陰性細(xì)胞和陽性細(xì)胞分別進(jìn)行稀釋，稀釋后進(jìn)行免疫熒光檢測，檢測方法同上述子宮頸胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞熒光檢測。

4.熒光原位雜交（fluorescence in situ hybrid?ization，F(xiàn)ISH）檢測

將HLA-G 陽性細(xì)胞涂片進(jìn)行FISH 檢測。選用美國Vysis 公司的染色體技術(shù)探針（chromosome enumeration probe，CEP）。其 中CEP X 用 綠 色 標(biāo)記，CEP Y用橙色標(biāo)記。

5.全基因組擴增

由于磁珠分選后的細(xì)胞數(shù)量較少，無法通過提取gDNA 進(jìn)行高通量測序，因此先進(jìn)行細(xì)胞全基因組擴增。使用PicoPLEXTMWGA Kit（美國Rubicon Genomic）對分選后的細(xì)胞進(jìn)行全基因組擴增：將分選后的細(xì)胞中加入細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解，隨后加入預(yù)擴增反應(yīng)液進(jìn)行預(yù)擴增，最后加入指數(shù)擴增反應(yīng)液進(jìn)行指數(shù)擴增。

6.全基因組低覆蓋度測序分析

取全基因組擴增產(chǎn)物，按照NEB Next dsDNA Fragmentase（NEB 公司產(chǎn)品）試劑盒說明書進(jìn)行片段化，配制反應(yīng)體系：2 μL Reaction buffer，2 μL dsDNA Fragmentase，300 ng 全基因組擴增產(chǎn)物，無核酸酶水補充至20 μL。37 ℃孵育25 min。片段化后的產(chǎn)物按照Ion Plus Fragment Library Kit（Thermo Fisher）說明書進(jìn)行高通量測序的文庫構(gòu)建。構(gòu)建好的文庫進(jìn)行上機測序模板制備，參照Ion Pi Hi-Q Template OT2 200 Kit（Thermo Fisher）說明書，測序過程按照Ion Pi Hiq Seq 200 Kit（Thermo Fisher）說明書進(jìn)行。

7.測序數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)經(jīng)過質(zhì)控之后，使用TMAP （Torrent Mapper 4.6）軟件把測序得到的每個DNA 片段的堿基序列定位到人類基因組參考序列（NCBI Build37/hg19）上，使用Picard 篩去重復(fù)序列，選擇質(zhì)量值≥10 且長度≥35 bp 的序列用于下游分析。把每條染色體劃分成200 kb 片段大小的非重疊區(qū)域，進(jìn)而計算樣本中每個200 kb 窗口上序列分布比例，過濾掉沒有信號或者reads 中帶“N”的窗口。最終利用環(huán)狀二元分割算法把每個200 kb 窗口的序列分布比例與參考數(shù)據(jù)庫中正常樣本進(jìn)行比較分析，得出檢測樣本相對于正常樣本某一條染色體區(qū)段的比值即CNV 值；若CNV 值大于0.37，則該染色體區(qū)段可判斷為三體或重復(fù)；若比值＜0.51，則該區(qū)段可判斷為單體或缺失。

結(jié) 果

一、胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞分離與鑒定

10 例樣本經(jīng)免疫熒光檢測共發(fā)現(xiàn)3 例樣本中存在表達(dá)β-HCG 信號的細(xì)胞，如圖1 所示，左側(cè)為DAPI 藍(lán)色標(biāo)記細(xì)胞核信號，中間為FITC 標(biāo)記β-HCG信號，右側(cè)為DAPI和β-HCG組合信號。

以上3例樣本采用HLA-G 偶聯(lián)磁珠對宮頸管脫落細(xì)胞進(jìn)行磁珠分選，對HLA-G 陽性細(xì)胞和陰性細(xì)胞分別進(jìn)行免疫熒光檢測β-HCG 表達(dá)情況。圖2左側(cè)為DAPI 藍(lán)色標(biāo)記細(xì)胞核信號，中間為FITC 標(biāo)記β-HCG 信 號，右 側(cè) 為DAPI 和β-HCG 組 合 信號。結(jié)果顯示，HLA-G 陽性細(xì)胞中表達(dá)β-HCG 的細(xì)胞比例增多（圖2，A-C），而HLA-G 陰性細(xì)胞中未檢測出β-HCG 的表達(dá)（圖2，D-F），表明磁珠分選的陽性細(xì)胞中含有胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞，但磁珠捕獲的特異性較低。

二、HLA-G陽性細(xì)胞FISH檢測

對HLA-G 陽性細(xì)胞進(jìn)行FISH 檢測，分別檢測X 染色體和Y 染色體。表1 為受試者信息，共檢測3 個樣本，其中1 例樣本檢測結(jié)果顯示為男性胎兒（如圖3），另外2 例樣本檢測結(jié)果顯示為女性胎兒，選取男性胎兒的陽性細(xì)胞進(jìn)行全基因組低覆蓋度測序。

表1 受試者信息

三、陽性細(xì)胞低覆蓋度全基因組測序分析

男性胎兒的子宮頸胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞采用低覆蓋度全基因組測序分析，該檢測流程可以檢測出＞4 Mb 的染色體片段缺失和重復(fù)，檢測結(jié)果見圖4，未檢測到染色體異常。分析結(jié)果顯示性染色體存在嵌合現(xiàn)象，Y 染色體的嵌合比例為20%。這說明磁珠分選后的陽性細(xì)胞中還是混雜了大量的母體細(xì)胞，胎兒細(xì)胞的比例約為20%，磁珠分選的特異性有待進(jìn)一步提高。

討 論

子宮頸胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞的來源是由于胎盤的快速擴展，滋養(yǎng)層細(xì)胞從胎盤邊緣的基底層侵入子宮腺體及血管，隨著腺分泌物一起進(jìn)入子宮腔，隨后進(jìn)入子宮頸。隨著胎盤的不斷擴張，不斷的有胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)入宮頸管，在胎盤擴張停止后（約20周），子宮頸內(nèi)的胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞迅速消失［6］。目前獲取子宮頸胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞的方法有四種：宮腔灌洗法、宮頸管灌洗法、細(xì)胞刷取樣法、宮頸黏液抽吸法。Gerit Moser等通過觀察1 000例經(jīng)宮頸刷取樣患者妊娠結(jié)局，發(fā)現(xiàn)取樣與否與流產(chǎn)、大出血、和宮腔感染沒有相關(guān)性［6］。宮腔灌洗法雖然可以得到80%～90%的陽性細(xì)胞，但是造成的創(chuàng)傷也較大，對胎兒存在潛在傷害，其安全性有待進(jìn)一步研究［7］。本研究選用了安全性最高的宮頸刷取樣法，但是結(jié)果表明宮頸刷取樣法獲得胎兒細(xì)胞成功率較低，10 例樣本中僅3 例樣本中觀察到β-HCG 陽性細(xì)胞，后續(xù)研究中可嘗試套管拭子或者雙取器宮頸毛刷法取樣［8-9］，提高取樣的成功率。

HLA-G 是胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞分化并侵入子宮腺體及血管的標(biāo)記，也是區(qū)分胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞與母體細(xì)胞的標(biāo)記。研究發(fā)現(xiàn)HLA-G 陽性細(xì)胞中有94%以上呈β-HCG 陽性，HLA-G 陰性細(xì)胞也呈β-HCG陰性，最終得到胎兒基因組含量大于95%的DNA［10］。本研究得到的陽性細(xì)胞中胎兒基因組含量約為20%，低于文獻(xiàn)報道，需要進(jìn)一步研究提高免疫磁珠分離胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞的特異性。

子宮頸胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞最初與FISH 和PCR 技術(shù)結(jié)合，用于胎兒性別診斷，正確率從24%到95%不等［11］。隨著STR 分型檢測技術(shù)的發(fā)展，實現(xiàn)了在孕早期進(jìn)行準(zhǔn)確的性別診斷和染色體異常的檢測［12］，也可以預(yù)測異位妊娠和空孕囊［13］。有研究者將顯微切割法和單細(xì)胞測序結(jié)合，分離出單一的胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞用于單基因遺傳疾病的檢測［14］。Jain等利用分離出的胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞，對全基因組59個STR 位點和94個已知的單基因遺傳疾病位點進(jìn)行深度測序，對胎兒基因位點進(jìn)行單體型分析［15］。本研究在前人研究基礎(chǔ)上，利用全基因組低覆蓋度測序檢測男性胎兒樣本中的染色體異常，證明利用免疫磁珠法分離出的胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞可以與已建立的高通量測序方法相兼容，實現(xiàn)產(chǎn)前胎兒全部染色體拷貝數(shù)變異的檢測。

利用脫落的子宮頸胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行產(chǎn)前診斷具有無創(chuàng)和早期診斷的優(yōu)勢，發(fā)現(xiàn)異常胎兒可及時終止妊娠，減輕孕婦心理創(chuàng)傷，且不受妊娠結(jié)局、胎盤病變（如子癇前期）、母體體重指數(shù)、產(chǎn)次及母體年齡的影響［16］，可以為臨床提供可靠的胎兒基因組樣品來源。本研究采用的細(xì)胞分離方法操作簡單，分離出的胎兒細(xì)胞可以在懷孕初期（5 ～20周）進(jìn)行快速精準(zhǔn)的染色體異常檢測。本研究一個潛在的局限性是樣本量較少，無法說明檢測的特異性和靈敏度。另外利用脫落的子宮頸胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行染色體異常檢測還受到以下因素的制約：首先，目前沒有分離和鑒定目標(biāo)細(xì)胞的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，不同實驗室得到的陽性細(xì)胞率不等；其次，目前的研究尚無大規(guī)模隨機對照、產(chǎn)前妊娠及活產(chǎn)的隨訪記錄，其臨床準(zhǔn)確性和安全性還有待評估；最后，目前只能對單胎妊娠進(jìn)行診斷，多胎妊娠及嵌合體妊娠診斷方案還需進(jìn)一步實驗評估。

綜上所述，雖然基于子宮頸胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行無創(chuàng)產(chǎn)前檢測還存在很多問題。相信隨著細(xì)胞分離方法的不斷優(yōu)化以及測序技術(shù)的快速發(fā)展，子宮頸胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞有望發(fā)展成一種安全可靠的產(chǎn)前診斷技術(shù)，在孕早期對全基因組染色體異常、單基因遺傳疾病進(jìn)行診斷。