王淑娟，王東方，劉 影，楊海波，趙勝杰，曹偉偉，王 翠，趙雪麗，馬震原，閆若潛

(河南省動物疫病預(yù)防控制中心，河南 鄭州 450008)

口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)引起的一種急性、烈性、高度傳染性、水皰性疾病，以發(fā)熱，唇部、口腔黏膜、乳房及蹄部出現(xiàn)爛斑或水皰性病理變化為典型的臨床特征[1-3]。該病主要感染牛、水牛，綿羊、山羊和豬在內(nèi)的70多種偶蹄目動物[4]。該病廣泛流行于世界各地，嚴(yán)重影響畜牧業(yè)生產(chǎn)、動物及其產(chǎn)品的流通和國際貿(mào)易，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，世界動物衛(wèi)生組織(OIE)和聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)將其列為A 類動物傳染病之首，我國也將其列為一類動物疫病。

FMDV分為O型、A型、C型、亞洲Ⅰ型 (AsiaⅠ型)等7 個血清型[5]，各血清型的分布極其不均勻，A 型、O型、C型和AsiaⅠ型廣泛分布，主要在歐洲、美洲、亞洲、非洲地區(qū)出現(xiàn)[6]。亞洲以東亞、東南亞和鄰接中東地區(qū)疫情較嚴(yán)重，流行血清型以 A 型和 O 型為主[7]，我國以O(shè)型為主[8]。

FMDV感染豬以后引起的臨床癥狀與塞尼卡病毒病、豬水皰病和水皰性口炎等難以區(qū)分，僅憑借臨床癥狀和病理變化診斷FMDV存在一定困難。因此，建立一種快速、特異、敏感地檢測FMDV的檢測方法勢在必行。病毒分離是檢測病毒最可靠的方法，但該方法操作麻煩，檢測周期長且需在特定的實(shí)驗(yàn)室中才能進(jìn)行。病原核酸檢測是實(shí)驗(yàn)室診斷最常用的方法，目前國內(nèi)外已經(jīng)建立了多種FMDV 核酸檢測方法。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、反向間接血凝試驗(yàn)等方法敏感性不高； 國內(nèi)外學(xué)者建立的RT-PCR和多重反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(mRT-PCR) 方法[9-10]，雖然具有較快速、特異的特點(diǎn)，但需要制膠、電泳等后續(xù)鑒定工作，操作復(fù)雜，而且增加了對實(shí)驗(yàn)室的污染 ； Madi等[11]，李金海等[12]建立了檢測FMDV的熒光定量PCR (FQ-PCR)可以快速、敏感地檢測FMDV，但不能分型。

本試驗(yàn)針對不同亞型FMDV通用序列(以下簡稱FMDV通用型)和O型FMDV序列設(shè)計(jì)了特異性引物和探針，提供了一種FMDV通用型(T型)和O型的二重TaqMan MGB FQ-PCR檢測方法，在一個PCR體系中可同時對通用型和O型FMDV核酸進(jìn)行快速、特異、敏感的檢測，在確定是否為FMDV感染的同時，又能確定是否是O型FMDV感染，該方法不需要電泳鑒定，能夠簡化操作，為FMDV提供了快速、特異、靈敏的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 毒株、菌種與重組質(zhì)粒 經(jīng)滅活的口蹄疫病毒O型、A型與Asia Ⅰ型標(biāo)準(zhǔn)株細(xì)胞培養(yǎng)物，均購自國內(nèi)某公司試劑盒陽性對照。BHK-21細(xì)胞、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、塞尼卡病毒(SVV)等，均由河南省動物疫病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室提供。pGEM-T/FMDV-T(通用型)和pGEM-T/FMDV-O(O型)重組質(zhì)粒：長度633 bp FMDV-T和234 bp FMDV-O特異性PCR擴(kuò)增片段分別克隆入pGEM-T Easy載體，提取重組質(zhì)粒后，通過紫外可見光分光光度計(jì)測定其OD260和OD280值，重復(fù)5次，確定質(zhì)粒DNA的濃度，參考Kim等[13]介紹的方法計(jì)算其濃度，定量并稀釋至 1.0×1010拷貝/μL，于-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 儀器和試劑 ABI 7500熒光定量PCR儀，購自美國ABI公司；KingFisher全自動核酸提取儀，購自美國Thermo Fisher公司；磁珠法核酸全自動提取試劑盒，購自Ambion生物科技公司；ExTaqDNA聚合酶、dNTPs、DNA回收試劑盒等，均購自寶生物工程(大連)有限公司；MLV反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、pGEM-T Easy載體、JM109感受態(tài)細(xì)胞，均購自Promega公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)和合成 經(jīng)大量比對GenBank中FMDV基因序列，選取不同亞型FMDV共有基因和O型 FMDVVP1基因高度保守且具有型特異性基因序列為模板，設(shè)計(jì)了1條特異性反轉(zhuǎn)錄引物FMDVR P0，2對特異性引物對FMDVT-F P1、FMDVT-R P2、FMDVO-F P3、FMDVO-R P4，2條TaqMan MGB探針FMDVT-MGB-FAM-Probe Probe-P5、FMDVO-MGB-VIC-Probe Probe-P6，引物和探針均由Invitrogen公司合成(表1)。

表1 引物與探針序列Table 1 The primers and probes sequences

1.4 樣品核酸的提取和反轉(zhuǎn)錄 參照磁珠法核酸提取試劑盒說明書，采用Kinfisher全自動核酸儀分別提取經(jīng)滅活的口蹄疫病毒O型、A型與Asia Ⅰ型標(biāo)準(zhǔn)株細(xì)胞培養(yǎng)物、BHK-21細(xì)胞對照、PEDV、TGEV、SVV的總RNA。經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)確定的最佳反轉(zhuǎn)錄體系為：M-MLV 5×Reaction Buffer(含Mg2+) 4 μL； 2.5 mmol/L dNTPs 4 μL；M-MLV 0.5 μL；RNA酶抑制劑 0.5 μL；反轉(zhuǎn)錄引物P0共1 μL；總體積10 μL。然后加入提取的不同樣品總RNA共10 μL后，37 ℃水浴1 h進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)結(jié)束后，70 ℃ 15 min 滅活反轉(zhuǎn)錄酶，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(cDNA)直接用于下步PCR擴(kuò)增或-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 通用型和O型口蹄疫病毒二重FQ-PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化 將pGEM-T/FMDV-T 和pGEM-T/FMDV-O重組質(zhì)粒分別稀釋至終濃度1.0×106拷貝/μL作為檢測模板，P1/P2、P3/P4引物對分別稀釋為終濃度0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 μmol/L 和1.0 μmol/L，Probe-P5、Probe-P6探針分別稀釋到終濃度為0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 μmol/L和1.0 μmol/L，應(yīng)用熒光PCR儀采用矩陣法篩選不同濃度的FMDV-T/FMDV-O引物和探針組合，篩選針對FMDV-T/FMDV-O的二重FQ-PCR最佳引物濃度、探針濃度和最佳反應(yīng)條件。

1.6 敏感性試驗(yàn)和標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 將pGEM-T/FMDV-T和pGEM-T/FMDV-O重組質(zhì)粒分別作等量混合，將其作為標(biāo)準(zhǔn)品，分別10倍系列稀釋至終濃度為1.0×106～1.0×10-1拷貝/μL，共8個稀釋度，按步驟1.5優(yōu)化的FQ-PCR反應(yīng)條件進(jìn)行FMDV-T/FMDV-O二重FQ-PCR敏感性試驗(yàn)。分別以pGEM-T/FMDV-T和pGEM-T/FMDV-O重組質(zhì)粒起始模板數(shù)的對數(shù)為X軸，以二重FQ-PCR循環(huán)次數(shù)Ct值為Y軸作回歸曲線，建立二重FQ-PCR方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7 特異性檢驗(yàn) 利用建立的二重FQ-PCR方法對PEDV、TGEV、SVV進(jìn)行擴(kuò)增，同時以經(jīng)滅活的口蹄疫病毒O型、A型與Asia Ⅰ型標(biāo)準(zhǔn)株細(xì)胞培養(yǎng)物混合物為陽性對照，正常BHK-21細(xì)胞培養(yǎng)物為陰性對照，以驗(yàn)證該方法的特異性。

1.8 穩(wěn)定性和重復(fù)性試驗(yàn) 分別將4個濃度(1.0×105～1.0×102拷貝/μL)的10倍系列稀釋的pGEM-T/FMDV-T和pGEM-T/FMDV-O重組質(zhì)粒等量混合物進(jìn)行二重FQ-PCR擴(kuò)增，每個系列設(shè)定3個重復(fù)，以驗(yàn)證該方法的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

1.9 應(yīng)用試驗(yàn) 依據(jù)建立的FMDV-T/FMDV-O二重FQ-PCR和口蹄疫病毒O型、A型與AsiaⅠ型三重RT-PCR普通檢測方法，配制檢測試劑，以口蹄疫病毒O型、A型和Asia Ⅰ型細(xì)胞滅活病毒標(biāo)準(zhǔn)株單一培養(yǎng)物的等量混合物為陽性對照，正常BHK-21細(xì)胞培養(yǎng)物為陰性對照，對15份臨床疑似FMDV感染樣品(樣品編號為：1～15)進(jìn)行了應(yīng)用檢測，對這2種方法的檢測結(jié)果進(jìn)行比較分析，并與其測序結(jié)果比較。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒DNA濃度的測定 通過紫外分光光度計(jì)分別測定pGEM-T/FMDV-T 和pGEM-T/FMDV-O重組質(zhì)粒OD260平均值分別為2.360和2.457，OD280平均值分別為1.197和1.311，OD260/OD280平均值分別為1.971和1.873；參考質(zhì)粒DNA拷貝數(shù)計(jì)算方法，計(jì)算出pGEM-T/FMDV-T 和pGEM-T/FMDV-O質(zhì)粒拷貝數(shù)分別為1.81×1010拷貝/μL和1.88×1010拷貝/μL，均稀釋至1.0×1010拷貝/μL。

2.2 FMDV-T/FMDV-O二重FQ-PCR反應(yīng)條件 二重FQ-PCR反應(yīng)體系25 μL：2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，10×ExTaq緩沖液 2.5 μL，5U/μLExTaq酶 0.25 μL；引物(20 μmol/L)P1/P2、P3/P4各0.5 μL，探針(10 μmol/L)Probe-P5 0.6 μL，探針(10 μmol/L)Probe-P6 0.8 μL；1.0×106拷貝/μL的質(zhì)粒模板 2 μL，補(bǔ)ddH2O至25 μL。二重FQ-PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，40個 循環(huán)。最佳反應(yīng)條件下的FQ-PCR結(jié)果見圖1。

圖1 FMDV-T/FMDV-O 二重FQ-PCR的擴(kuò)增曲線Fig.1 The kinetic curve for FMDV-T/FMDV-O FQ-PCR1:FAM探針FMDV-T擴(kuò)增曲線; 2:VIC探針FMDV-O擴(kuò)增曲線; 3～4:陰性對照1:Kinetic curve for FMDV-T of FAM probe; 2:Kinetic curve for FMDV-O of VIC probe; 3～4:Negative control

2.3 FMDV-T/FMDV-O二重FQ-PCR敏感性及標(biāo)準(zhǔn)曲線 二重FQ-PCR檢測FMDV-T和FMDV-O最低檢出限均為1.0×101拷貝/μL(圖2和圖3)。由敏感性檢測結(jié)果建立FMDV-T標(biāo)準(zhǔn)曲線，相關(guān)系數(shù)為0.999，斜率為-3.11，截距為36.10，從而可以得出拷貝數(shù)(X)與Ct值之間的線性關(guān)系表達(dá)式：Ct=-3.11×logX+36.1(圖4)；由敏感性檢測結(jié)果建立FMDV-O標(biāo)準(zhǔn)曲線，相關(guān)系數(shù)0.995，斜率為-3.28， 截距為35.29，從而可以得出拷貝數(shù)(X)與Ct值之間的線性關(guān)系表達(dá)式：Ct=-3.28×logX+35.29(圖5)。

圖2 FMDV-T FQ-PCR 的擴(kuò)增曲線Fig.2 The kinetic curve for FMDV-T FQ-PCR1～8:對應(yīng)的質(zhì)粒濃度1.0×106, 1.0×105, 1.0×104,1.0×103, 1.0×102, 1.0×101, 1.0×100，1.0×10-1拷貝/μL； 9:陰性對照1～8: Plasmid concentration 1.0×106,1.0×105,1.0×104, 1.0×103, 1.0×102, 1.0×101,1.0×100， 1.0×10-1copies/μL, respectively； 9:Negative control

圖3 FMDV-O FQ-PCR 的擴(kuò)增曲線Fig.3 The kinetic curve for FMDV-O FQ-PCR1～8:對應(yīng)的質(zhì)粒濃度1.0×106, 1.0×105, 1.0×104,1.0×103, 1.0×102, 1.0×101, 1.0×100， 1.0×10-1拷貝/μL； 9:陰性對照1～8: Plasmid concentration 1.0×106, 1.0×105, 1.0×104,1.0×103, 1.0×102, 1.0×101,1.0×100， 1.0×10-1copies/μL，respectively； 9:Negative control

圖4 FMDV-T FQ-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 The standard curve for FMDV-T FQ-PCR

圖5 FMDV-O FQ-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 The standard curve for FMDV-O FQ-PCR

2.4 特異性 采用建立的FMDV-T/FMDV-O二重FQ-PCR方法對PEDV、TGEV、經(jīng)滅活的口蹄疫病毒O型、A型與Asia Ⅰ型標(biāo)準(zhǔn)株細(xì)胞培養(yǎng)物混合物，正常BHK-21細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，經(jīng)滅活的口蹄疫病毒O型、A型與Asia Ⅰ型標(biāo)準(zhǔn)株細(xì)胞培養(yǎng)物混合物呈雙陽性曲線擴(kuò)增，Ct值分別為18.4和16.8，但正常BHK-21細(xì)胞培養(yǎng)物、PEDV、TGEV、SVV等均未出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線(圖6)。

圖6 FMDV-T/FMDV-O二重FQ-PCR方法的特異性試驗(yàn)Fig.6 Specificity test for FMDV-T/FMDV-O FQ-PCR1:FMDV-T質(zhì)粒; 2:FMDV-O質(zhì)粒; 3～7:正常BHK-21細(xì)胞培養(yǎng)物、PEDV、TGEV、SVV及陰性對照1:FMDV-T plasmid; 2:FMDV-O plasmid; 3～7:BHK-21，PEDV，TGEV，SVV and negative control

2.5 穩(wěn)定性和重復(fù)性 采用建立的FMDV-T/FMDV-O二重FQ-PCR方法對4個濃度(1.0×105～1.0×102拷貝/μL)的10倍系列稀釋的pGEM-T/FMDV-T和pGEM-T/FMDV-O重組等量質(zhì)?；旌衔镞M(jìn)行檢測，并且每個系列設(shè)定3個重復(fù)。結(jié)果表明，濃度為1.0×105、1.0×104、1.0×103拷貝/μL和1.0×102拷貝/μL的4個濃度的FMDV-T/FMDV-O重組質(zhì)粒等量混合物3次試驗(yàn)結(jié)果均為陽性并且重復(fù)性良好，批內(nèi)試驗(yàn)和批間試驗(yàn)變異系數(shù)均<0.04，說明建立的FMDV-T/FMDV-O二重FQ-PCR方法具有很好的穩(wěn)定性和重復(fù)性(圖7，表2，表3)。

2.6 臨床樣品檢測 依據(jù)建立的FMDV-T/FMDV-O二重FQ-PCR和口蹄疫病毒O型、A型與Asia Ⅰ型三重RT-PCR普通檢測方法，配制檢測試劑，以口蹄疫病毒O型、A型和Asia Ⅰ型細(xì)胞滅活病毒標(biāo)準(zhǔn)株單一培養(yǎng)物的等量混合物為陽性對照，正常BHK-21細(xì)胞培養(yǎng)物為陰性對照，對15份臨床疑似FMDV感染樣品(樣品編號：1～15)進(jìn)行了應(yīng)用檢測，對這2種方法的檢測結(jié)果進(jìn)行比較分析，并與FMDV測序結(jié)果比較。

圖7 FMDV-T/FMDV-O二重FQ-PCR方法的重復(fù)性試驗(yàn)Fig.7 Reproducibility test for FMDV-T/FMDV-O FQ-PCRT1-3:1.0×105拷貝/μL FMDV-T質(zhì)粒； T4-6: 1.0×104拷貝/μL FMDV-T質(zhì)粒； T7-9: 1.0×103拷貝/μL FMDV-T質(zhì)粒； T10-12: 1.0×102拷貝/μL FMDV-T質(zhì)粒； O1-3: 1.0×105拷貝/μL FMDV-O質(zhì)粒； O4-6: 1.0×104拷貝/μL FMDV-O質(zhì)粒； O7-9: 1.0×103拷貝/μL FMDV-O質(zhì)粒； O10-12: 1.0×102拷貝/μL FMDV-O質(zhì)粒；NC: 陰性對照T1-3: 1.0×105 copies/μL FMDV-T plasmid； T4-6: 1.0×104 copies/μL FMDV-T plasmid； T7-9: 1.0×103 copies/μL FMDV-T plasmid； T10-12: 1.0×102 copies/μL FMDV-T plasmid； O1-3: 1.0×105 copies/μL FMDV-O plasmid； O4-6: 1.0×104 copies /μL FMDV-O plasmid； O7-9: 1.0×103 copies/μL FMDV-O plasmid； O10-12: 1.0×102 copies/μL FMDV-O plasmid； NC: Negative control

測定結(jié)果如圖8所示。結(jié)果表明，采用RT-PCR檢測5份為FMDV-T陽性，4份為FMDV-O陽性，采用本試驗(yàn)建立的FMDV-T/FMDV-O二重FQ-PCR檢測，9份為FMDV-T陽性，7份為FMDV-O陽性，該FQ-PCR方法檢測結(jié)果與FMDV 共有基因、O型 FMDVVP1基因測序結(jié)果符合率為100%。將本試驗(yàn)部分疑似FMDV感染樣品送國家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行復(fù)核，結(jié)果確認(rèn)為FMDV-O陽性[14]。表明本試驗(yàn)建立的FMDV-T / FMDV-O二重FQ-PCR方法比普通PCR方法的靈敏性高。

3 討論

FMD是世界范圍內(nèi)嚴(yán)重影響畜牧業(yè)健康發(fā)展的惡性動物傳染病，一旦暴發(fā)會對畜牧產(chǎn)業(yè)造成毀滅性的災(zāi)難[15]?！秶抑虚L期動物疫病防治規(guī)劃(2010-2020年)》也制定了FMD的控制和凈化目標(biāo)，這就要求我們必須加大監(jiān)測力度，特別是加大病原學(xué)監(jiān)測的范圍和數(shù)量，因此，F(xiàn)MDV檢測方法的快速、簡便和高通量將越來越受到重視[16]。FQ-PCR技術(shù)具有敏感性高、特異性好、操作簡單快捷，給檢測工作帶來很大便利。FQ-PCR技術(shù)分為染料法和探針法2種，Jamnikar等[17]對染料法和探針法進(jìn)行了比較，認(rèn)為探針法用于定量比SYBR Green I 染料法更為準(zhǔn)確，且特異性更高。本試驗(yàn)建立的通用型和O型口蹄疫病毒二重FQ-PCR檢測方法采用了TaqMan MGB探針，與傳統(tǒng)的TaqMan探針相比，TaqMan MGB探針縮短了探針的長度，大大提高了探針的Tm值，也降低了探針的合成成本，TaqMan MGB探針的淬滅基團(tuán)采用非熒光淬滅基團(tuán)，其本身不產(chǎn)生熒光信號，可大大降低本底信號的強(qiáng)度，使擴(kuò)增結(jié)果更加特異、敏感[18]。

表2 FMDV-T的二重FQ-PCR方法重復(fù)性Table 2 The results of FMDV-T reproducibility

表3 FMDV-O的二重FQ-PCR方法重復(fù)性Table 3 The results of FMDV-O reproducibility

圖8 臨床樣品檢測Fig.8 Detection of clinical samples

本試驗(yàn)在一個PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行FMDV通用型和O型的二重檢測反應(yīng)，同時收集代表FMDV通用型和O型的熒光信號，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時在線檢測，從而建立了能夠同時檢測 FMDV 通用型及O型二重FQ-PCR 方法。實(shí)驗(yàn)室及臨床樣品檢測試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法具有操作簡便快速、特異性強(qiáng)、敏感性高等優(yōu)點(diǎn)，為通用型和O型FMDV的快速檢測提供了一種新方法。

目前，我國主要流行 O 型和 A 型 FMD，而 AsiaⅠ型自 2009 年之后未見臨床病例報(bào)道[19]，并且國家已退出 AsiaⅠ型 FMD 的強(qiáng)制免疫，主要針對 FMDV 的 O 型和 A 型進(jìn)行病原鑒別診斷。因此仍需在本試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步開發(fā)針對FMDV通用型、O型和A型的熒光定量PCR檢測方法。