馬奇三，趙燕娜，趙玉萍，洪建華，王正平，韓軍

(1.聊城大學(xué)生物制藥研究院，聊城 252000；2.南昌航空大學(xué)環(huán)境與材料學(xué)院，南昌 330063)

目前，隨著組合化學(xué)和高通量篩選技術(shù)的發(fā)展，難溶性候選化合物的數(shù)量急劇增加。據(jù)統(tǒng)計(jì)，上市藥品中約40%水溶性較差，而在研階段候選藥物難溶性比例高達(dá)90%[1]。因此，改善難溶性藥物溶解度是制劑開(kāi)發(fā)中最具挑戰(zhàn)的問(wèn)題之一[1]，一些提升藥物溶解度的制劑技術(shù)也因此應(yīng)運(yùn)而生，固體分散即為其中一種較有效的方式。固體分散體中的藥物往往以無(wú)定型或分子狀態(tài)分散在載體材料中，熔融法和溶劑揮發(fā)法是最常用的兩種方法[2-3]。由于藥物無(wú)定型狀態(tài)相比于晶態(tài)是高能態(tài)，溶解不受晶格能束縛，所以有較高溶解度，進(jìn)而可提高藥物生物利用度[4-5]，并由此產(chǎn)生處于亞穩(wěn)態(tài)的過(guò)飽和溶液[6-8]。合理運(yùn)用輔料可以在一定程度上阻止藥物成核和晶體增長(zhǎng)，確保藥物在存儲(chǔ)期間保持無(wú)定型和阻止無(wú)定型藥物溶出后重結(jié)晶[9-10]。但迄今為止利用固體分散技術(shù)制備的藥物卻仍屈指可數(shù)，根本原因是固體分散體本質(zhì)上不穩(wěn)定，高能態(tài)無(wú)定型藥物更傾向于轉(zhuǎn)化為低能態(tài)難溶結(jié)晶形式，這使得固體分散體優(yōu)勢(shì)大打折扣。由難溶性藥物和水溶性高分子聚合物組成的非晶固體分散體(amorphous solid dispersion，ASD)作為過(guò)飽和藥物傳遞系統(tǒng)，已被證明在溶于水的過(guò)程中能夠產(chǎn)生第二分散相[11-12]，對(duì)于第二分散相形成過(guò)程中的相行為目前知之甚少。

人體免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)蛋白酶抑制劑利托那韋，是艾滋病“雞尾酒”療法的重要組分，在控制病毒傳播和控制病毒變異產(chǎn)生抗藥性方面療效顯著[13]，臨床可單獨(dú)使用，或與其他抗逆轉(zhuǎn)錄藥物聯(lián)用[14]。利托那韋水溶性較差，已被證實(shí)在水介質(zhì)中可形成第二分散相[15]。筆者在本研究選用利托那韋為模型藥物，通過(guò)溶劑轉(zhuǎn)移法考察過(guò)飽和狀態(tài)下利托那韋膠體分散體粒徑變化和結(jié)晶趨勢(shì)，利用動(dòng)態(tài)光散射、消光(濁度)、芘熒光探針、偏光顯微鏡全面表征其過(guò)飽和溶液相分離及結(jié)晶過(guò)程。研究結(jié)果可為篩選具有優(yōu)異結(jié)晶抑制特性的聚合物提供新思路，并有助于指導(dǎo)新型藥用輔料開(kāi)發(fā)。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Nano ZSP激光粒度儀(英國(guó)馬爾文儀器公司)，F(xiàn)-7000熒光分光光度計(jì)(日本日立公司)，U-3900H紫外分光光度計(jì)(日本日立公司)，Axio lab A1偏光顯微鏡(卡爾蔡司股份公司)。

1.2試藥 利托那韋原料藥(印度HETERO DRUGS LIMITED，含量：99%，批號(hào)：RI17100047)，芘(麥克林試劑，含量：99%，批號(hào)：C10561824)，磷酸二氫鉀(分析純，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，含量≥99.5%，批號(hào)：20108012079)，氫氧化鈉(分析純，煙臺(tái)遠(yuǎn)東精細(xì)化工有限公司，含量≥96%，批號(hào)：20181101)，甲醇(色譜純，阿達(dá)瑪斯試劑，含量≥99.9%，批號(hào)：P1346953)，水為自制超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1過(guò)飽和溶液的制備與第二分散相觀察 通過(guò)溶劑轉(zhuǎn)移法制備利托那韋過(guò)飽和溶液。取利托那韋原料藥50 mg，溶于甲醇5 mL，作為儲(chǔ)備液備用。移取儲(chǔ)備液0.5 mL，滴入pH值6.8磷酸鹽緩沖液50 mL中(37 ℃，300 r·min-1)，在藥物滴加的過(guò)程中，磷酸鹽緩沖液由澄清變渾濁，呈現(xiàn)膠體溶液特有的藍(lán)色乳光，最終形成理論濃度100 μg·mL-1利托那韋過(guò)飽和溶液。取該過(guò)飽和溶液20 μL，滴于載玻片上，偏光顯微鏡觀察，可見(jiàn)亞微米級(jí)非雙折射的類(lèi)液體狀球形小液滴，見(jiàn)圖1。由前人研究可知，這些小液滴是當(dāng)溶液中藥物溶度超過(guò)其無(wú)定型溶解度時(shí)經(jīng)液-液相分離形成的第二分散相，該相是一種富含藥物的類(lèi)液體狀的液滴[15-16]。

2.2第二分散相形成的臨界濃度測(cè)定 為測(cè)定第二分散相形成的臨界濃度，分別利用紫外分光光度計(jì)和動(dòng)態(tài)光散射對(duì)該過(guò)程進(jìn)行表征。通過(guò)溶劑轉(zhuǎn)移法，向pH值6.8磷酸鹽緩沖液50 mL中依次加入利托那韋甲醇儲(chǔ)備液，獲得濃度分別為5，10，15，20，25，30，35，40，45 μg·mL-1過(guò)飽和溶液，取相應(yīng)濃度過(guò)飽和溶液適量，測(cè)其紫外消光和動(dòng)態(tài)光散射粒徑。其中，紫外吸收波長(zhǎng)選擇無(wú)藥物紫外吸收干擾波段(如280 nm)，以消光(extinction)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。動(dòng)態(tài)光散射則通過(guò)馬爾文粒度儀(Nano ZSP，以173°散射角)，以光強(qiáng)(count rate)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。以消光或光強(qiáng)對(duì)濃度作圖，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，紫外消光和光強(qiáng)結(jié)果一致，均在利托那韋濃度達(dá)到約37 μg·mL-1時(shí)產(chǎn)生突變，表明液-液相分離濃度，即第二分散相形成的濃度約37 μg·mL-1。

圖1 利托那韋過(guò)飽和溶液偏光圖

圖2 利托那韋過(guò)飽和溶液相分離濃度曲線(xiàn)

2.3過(guò)飽和溶液中產(chǎn)生的第二分散相的性質(zhì)考察 結(jié)合“2.2”項(xiàng)得到的相分離濃度，進(jìn)一步考察相分離后形成的第二分散相性質(zhì)。50 mL pH值6.8磷酸鹽緩沖液37 ℃條件下300 r·min-1攪拌，每隔5 min采集一次光強(qiáng)和紫外消光數(shù)據(jù)，作為空白對(duì)照。20 min后，加入利托那韋甲醇儲(chǔ)備液0.2 mL，獲得濃度為40 μg·mL-1利托那韋溶液，繼續(xù)每隔5 min采集一次光強(qiáng)和紫外消光數(shù)據(jù)。20 min后加入pH值6.8磷酸鹽緩沖液50 mL，使其濃度稀釋為20 μg·mL-1，繼續(xù)每隔5 min采集一次光強(qiáng)和紫外消光數(shù)據(jù)，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，利托那韋過(guò)飽和溶液達(dá)40 μg·mL-1，會(huì)發(fā)生液-液相分離形成第二分散相，與“2.2”項(xiàng)結(jié)果一致。而當(dāng)利托那韋過(guò)飽和溶液被稀釋至20 μg·mL-1時(shí)，其消光和光強(qiáng)又驟降到接近0 μg·mL-1水平，說(shuō)明液-液相分離形成的第二分散相可逆，即該富藥液滴并非晶體，否則其無(wú)法在高于利托那韋平衡溶解度的溶液中溶解，消光和光強(qiáng)也不會(huì)驟降到如此低。但需要注意的是，利托那韋過(guò)飽和溶液再稀釋后的消光和光強(qiáng)并沒(méi)有回到與0 μg·mL-1一致的零點(diǎn)，而是略高于零點(diǎn)，推測(cè)溶液中存在少量未溶解的晶體[17]。另外在40 μg·mL-1濃度下，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，利托那韋過(guò)飽和溶液消光和光強(qiáng)一直下降，推測(cè)可能是該溶液中富藥液滴不穩(wěn)定，藥物結(jié)晶析出所致。

圖3 濃度變化過(guò)程中利托那韋過(guò)飽和溶液光強(qiáng)和消光變化曲線(xiàn)

2.4第二分散相結(jié)晶情況考察 通過(guò)芘熒光探針進(jìn)一步表征利托那韋過(guò)飽和溶液中第二分散相結(jié)晶過(guò)程，芘的熒光發(fā)射峰強(qiáng)度之比(I1/I3)對(duì)芘分子所在微環(huán)境的極性特別敏感，在藥物結(jié)晶前，芘進(jìn)入富藥液滴極性較小的疏水環(huán)境中，而富藥液滴結(jié)晶時(shí)，芘被排出晶格，進(jìn)入極性大的水溶液，因此可以利用芘熒光探針?lè)y(cè)定第二分散相富藥液滴環(huán)境的極性變化和結(jié)晶過(guò)程[16]。稱(chēng)取芘1 mg，用二甲亞砜1 mL溶解，取25 μL加入pH值6.8磷酸鹽緩沖液50 mL，使芘終濃度為0.5 μg·mL-1。取利托那韋儲(chǔ)備液0.2 mL加入上述含芘磷酸鹽緩沖液，利托那韋終濃度為40 μg·mL-1，37 ℃條件下300 r·min-1持續(xù)攪拌，每幾分鐘測(cè)一次熒光。熒光分光光度計(jì)激發(fā)波長(zhǎng)為334 nm，375 nm處的發(fā)射峰為I1，386 nm處的發(fā)射峰為I3，以I1/I3對(duì)時(shí)間作圖，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，加入利托那韋使I1/I3迅速減小，說(shuō)明短時(shí)間內(nèi)利托那韋過(guò)飽和溶液發(fā)生了相分離，并且產(chǎn)生了具有疏水核心的富藥液滴，即第二分散相。隨著時(shí)間延長(zhǎng)，I1/I3又逐漸增大，說(shuō)明部分液滴或液滴局部開(kāi)始結(jié)晶，藥物分子開(kāi)始有序排列，芘被排出晶格，進(jìn)入極性強(qiáng)的水環(huán)境中。

圖4 I1/I3隨時(shí)間變化曲線(xiàn)

2.5第二分散相粒徑的變化考察 進(jìn)一步考察第二分散相結(jié)晶過(guò)程伴隨粒徑變化，取利托那韋儲(chǔ)備液0.2 mL，加入pH值6.8磷酸鹽緩沖液50 mL中，利托那韋終濃度40 μg·mL-1，37 ℃，300 r·min-1持續(xù)攪拌，一定時(shí)間間隔取樣，馬爾文nano-ZSP粒度儀測(cè)粒徑，采用后向散射探測(cè)器，探測(cè)角度為173°的散射光。從圖5粒徑隨時(shí)間的變化曲線(xiàn)可以看出，第二分散相富藥液滴初始粒徑在約450 nm，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，其粒徑逐漸增大，到120 min，粒徑增大到約1600 nm，結(jié)合原始數(shù)據(jù)，在120 min之前，第二分散相粒徑的標(biāo)準(zhǔn)偏差較小，多分散指數(shù)(polydispersity index，PDI)<0.7，說(shuō)明液滴粒徑分布較集中。在120 min后，粒徑仍呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，但粒徑標(biāo)準(zhǔn)偏差變得很大，同時(shí)PDI>0.9，甚至等于1，說(shuō)明液滴粒徑分布較寬，大顆粒和小顆粒同時(shí)存在。

2.6考察第二分散相在偏光顯微鏡下的變化 為直觀觀察過(guò)飽和溶液中第二分散相結(jié)晶情況，取利托那韋儲(chǔ)備液0.2 mL，加入pH值6.8磷酸鹽緩沖液50 mL中，利托那韋終濃度40 μg·mL-1，37 ℃條件下300 r·min-1持續(xù)攪拌，10，30，60，90，180，240 min取樣，偏光顯微鏡觀察，結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖6可見(jiàn)，從10～60 min，過(guò)飽和溶液第二分散相的形成，第二分散相粒徑逐漸變大，并且液滴在偏光下逐步顯現(xiàn)出晶體的光學(xué)特征，晶核逐漸形成，90 min可以看到晶體的初步形成，180～240 min，可以觀察到晶體生長(zhǎng)，小晶體進(jìn)一步生長(zhǎng)變?yōu)楦缶w。

圖5 粒徑隨時(shí)間變化曲線(xiàn)(n=3)

3 討論

在利用固體分散技術(shù)提高難溶性藥物溶解度的研究過(guò)程中，常常因?yàn)檫^(guò)飽和溶液中第二分散相的產(chǎn)生而使藥物的溶解情況變得復(fù)雜。為更好地理解過(guò)飽和溶液中的第二分散相，如分散相的粒徑、結(jié)晶時(shí)間，筆者在本研究通過(guò)溶劑轉(zhuǎn)移法制備過(guò)飽和溶液，考察了在沒(méi)有輔料存在的情況下，利托那韋藥物的過(guò)飽和溶液發(fā)生相分離、產(chǎn)生第二分散相的臨界濃度，進(jìn)一步考察了在該分離濃度下第二分散相的結(jié)晶趨勢(shì)和粒徑變化。經(jīng)過(guò)紫外消光、動(dòng)態(tài)光散射、芘熒光探針?lè)ū碚鳎l(fā)現(xiàn)利托那韋過(guò)飽和溶液發(fā)生相分離的濃度在大約37 μg·mL-1，相分離后形成可溶解的富藥液滴，即第二分散相，隨后該富藥液滴開(kāi)始結(jié)晶。另外，藥物相分離濃度與其無(wú)定型狀態(tài)溶解度有關(guān)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)研究結(jié)果基本一致[15]。偏光顯微鏡下的觀察結(jié)果再次驗(yàn)證了上述結(jié)論。需要注意的是，并非所有過(guò)飽和溶液都可以發(fā)生相分離形成第二分散相，第二分散相的形成取決于溶液中的藥物濃度是否超過(guò)了該藥物無(wú)定型的溶解度[6]。同時(shí)，由于各種輔料的性能差異，藥物-聚合物-水之間相互作用差異，導(dǎo)致不同輔料存在時(shí)，藥物的溶出速率有較大差異，藥物溶出后存在狀態(tài)亦是多樣化的[12，18-19]，輔料或制備工藝對(duì)第二分散相的粒徑增長(zhǎng)控制越好或保持不結(jié)晶的時(shí)間越長(zhǎng)，可能對(duì)提高生物利用度越有效果。

筆者在本研究系統(tǒng)全面地研究了利托那韋過(guò)飽和溶液中第二分散相的形成和特性，這對(duì)需要知道最大可達(dá)到的游離藥物濃度的情況具有重要意義，例如在藥物輸送中用于構(gòu)建劑量反應(yīng)曲線(xiàn)，以及在確定最大生物接觸限值時(shí)。另外，通過(guò)測(cè)定形成第二分散相時(shí)的濃度，對(duì)該體系中相邊界的位置和形狀進(jìn)行更定量的了解，尤其是它們?nèi)绾坞S化合物性質(zhì)、離子強(qiáng)度、溫度、輔料和濃度產(chǎn)生方法的變化而變化[15]。通常，輔料會(huì)影響第二分散相粒徑、穩(wěn)定性和結(jié)晶行為，為后續(xù)探究輔料和制備工藝對(duì)過(guò)飽和體系中第二分散相的影響，篩選具有優(yōu)異結(jié)晶抑制特性的聚合物和制備工藝提供研究基礎(chǔ)，并有助于指導(dǎo)后續(xù)新型藥用輔料的開(kāi)發(fā)。普渡大學(xué)Taylor課題組研究表明，帶電荷的輔料降低了第二分散相聚結(jié)的動(dòng)力學(xué)，但是對(duì)結(jié)晶動(dòng)力學(xué)具有可變的影響，促進(jìn)或抑制了結(jié)晶，通過(guò)適當(dāng)選擇配方成分，可以促進(jìn)第二分散相膠體液滴的形成，并抑制其聚結(jié)和結(jié)晶[16]。此外，過(guò)飽和體系越來(lái)越多地應(yīng)用于藥物遞送系統(tǒng)，固體分散體就是一個(gè)典型的過(guò)飽和給藥體系，像自乳化藥物傳遞系統(tǒng)、納米制劑等也是基于藥物處于過(guò)飽和狀態(tài)，進(jìn)而提高生物利用度的制劑技術(shù)。通過(guò)對(duì)過(guò)飽和體系的理解和認(rèn)識(shí)，有助于合理設(shè)計(jì)過(guò)飽和藥物傳遞系統(tǒng)，并對(duì)難溶性藥物進(jìn)行更深入的探索和利用。

圖6 過(guò)飽和溶液在不同時(shí)間點(diǎn)的偏光照片