明 月，牛銀杰，付小哲，劉禮輝，梁紅茹，林 強(qiáng)，李寧求

(1中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 珠江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省水產(chǎn)動(dòng)物免疫技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510380；2上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院, 上海 201306)

鱖(Sinipercachuatsi)是我國(guó)重要的淡水名優(yōu)養(yǎng)殖魚類，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。近年來，高密度集約化養(yǎng)殖導(dǎo)致鱖魚疾病頻發(fā)，其中傳染性脾腎壞死病毒(infectious spleen and kidney necrosis virus，ISKNV)是危害我國(guó)鱖養(yǎng)殖的重要病原之一，其致病力強(qiáng)，致死率可達(dá)90%以上，給鱖養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。因此，開展ISKNV致病機(jī)制研究對(duì)該病的防控具有重要意義。

蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)基因，即AKT，是一種原癌基因，普遍存在于靜息細(xì)胞的胞質(zhì)中。AKT分AKT1、AKT2和AKT3 3種亞型，其中AKT2是蛋白激酶B家族的主要亞型，具有絲氨酸/蘇氨酸 (Ser/Thr)激酶的活性[3]，是多種細(xì)胞過程的關(guān)鍵調(diào)控因子[4]。有研究表明，AKT過表達(dá)可激活其下游多種效應(yīng)因子，調(diào)節(jié)先天性免疫因子的表達(dá)而使其發(fā)揮抗病毒作用[5-6]。乙型肝炎病毒 (hepatitis B virus ，HBV)的X蛋白(hepatitis B virus X protein,HBX)可激活原代肝細(xì)胞中的AKT，抑制HBX介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,從而抑制乙型肝炎病毒的復(fù)制[7]。在豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)感染的早期，機(jī)體AKT被激活，抑制PRRSV介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮其抗病毒作用[8]。水泡性口炎病毒 (vesicular stomatitis virus,VSV)感染時(shí)，機(jī)體AKT被活化，進(jìn)而依賴Toll樣受體4(Toll-like receptor 4)途徑發(fā)揮抗病毒功能[9]。感染仙臺(tái)病毒(sendai virus,SeV)的宿主通過活化AKT，激活干擾素調(diào)節(jié)因子3(interferon regulatory factor 3，IRF3)的表達(dá)，從而增強(qiáng)β干擾素(interferon-β,IFN-β)的表達(dá)而產(chǎn)生抗病毒效應(yīng)[10]?？梢姡珹KT可以作為一個(gè)抗病毒靶標(biāo)用于抗病毒機(jī)制的研究。

目前對(duì)于鱖AKT2在ISKNV感染過程中的作用仍不清楚，為此本研究克隆了鱖AKT2的開放閱讀框并進(jìn)行原核表達(dá)，制備重組ScAKT2多克隆抗體，構(gòu)建鱖AKT2過表達(dá)的細(xì)胞系，研究ScAKT2在ISKNV增殖中的作用，以期為鱖ISKNV防控提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 細(xì)胞、毒株、載體和試驗(yàn)動(dòng)物 鱖腦組織細(xì)胞系(Chinese perch brain cell line，CPB)[11]、 ISKNV毒株(QY20091015)[12]及pET32a和pCMV-EGFP載體，均由中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省水產(chǎn)動(dòng)物免疫技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；大腸桿菌(E.coli) DH5a和 BL21(DE3)，購(gòu)自TaKaRa(大連)公司。日本大耳兔，購(gòu)于山東恒遠(yuǎn)養(yǎng)殖基地。

1.1.2 試 劑 L-15培養(yǎng)基、胰蛋白酶、血清和Hanks液，購(gòu)于Gibco (美國(guó))公司；Trizol試劑，購(gòu)于Invitrogen(美國(guó))公司；海洋動(dòng)物基因組提取試劑盒,購(gòu)于天根生化科技(北京)有限公司；Titanium One-Step RT-PCR Kit試劑盒、TaqMan Real-time PCR Master Mix和TB Green?Premix ExTaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus)，購(gòu)于TaKaRa(大連)公司；膠回收試劑盒，購(gòu)于OMEGA(美國(guó))公司；Ni-NTA鎳離子親和層析柱(1 mL)，購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑，購(gòu)自Sigma(美國(guó))公司；FuGENE?6轉(zhuǎn)染試劑盒和Pure Yield(TM)質(zhì)粒中提試劑盒，購(gòu)于Promega(美國(guó))公司；ProteoSpinTM包涵體分離純化試劑盒，購(gòu)買于艾美捷科技(武漢)有限公司；G418(Geneticin，遺傳霉素)、帶FITC標(biāo)簽的熒光二抗和DAPI染料，購(gòu)自索萊寶生物有限公司(北京)；ISKNV-MCP單克隆抗體,由本實(shí)驗(yàn)室保存；EcoRⅠ、SalⅠ、KpnⅠ酶和T4 DNA Ligase，購(gòu)自TaKaRa(大連)公司。

1.2 方 法

1.2.1 鱖核酸的提取與反轉(zhuǎn)錄 用Trizol試劑提取CPB細(xì)胞總RNA(設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù))，然后立即用Titanium One-Step RT-PCR Kit 試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,用海洋動(dòng)物基因組提取試劑盒提取感染ISKNV后的CPB細(xì)胞DNA(設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù))。

1.2.2AKT2開放閱讀框(ORF)的克隆與重組表達(dá)載體的構(gòu)建 (1)AKT2 ORF的克隆。 根據(jù)本課題組已測(cè)定的鱖轉(zhuǎn)錄組結(jié)果，設(shè)計(jì)AKT2引物ScAKT2-F(5′-CCGGAATTCATGAATGAAGTCA-GTGTTGT-3′,其中斜體部分為EcoR Ⅰ酶切位點(diǎn))和ScAKT2-R(5′-ACGCGTCGACTCATTCCCGTATGCTGGCAGAG-3′，其中斜體部分為SalⅠ酶切位點(diǎn))。用高保真酶PrimeSTAR?HS DNA Polymerase擴(kuò)增AKT2的ORF，PCR反應(yīng)總體系為50 μL：5×PrimeSTAR Buffer (Mg2+Plus) 10 μL,dNTP Mixture (2.5 mmol/L each) 4 μL,ScAKT2-F和ScAKT2-R各1 μL,Template 2 μL,PrimeSTAR?HS DNA Polymerase 0.5 μL,DEPC水31.5 μL。反應(yīng)條件：98 ℃ 10 s，55 ℃ 5 s，72 ℃ 2 min，共30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳后測(cè)序，并切膠回收PCR產(chǎn)物。

(2)原核表達(dá)載體pET32a-AKT2的構(gòu)建。用EcoR Ⅰ和SalⅠ同時(shí)雙酶切AKT2 ORF和pET32a載體(16 ℃酶切12 h)，用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切效率，切膠回收目的條帶和線性化的pET32a載體，將其以3∶1的比例用T4 DNA Ligase連接，反應(yīng)體系為：T4 DNA Ligase Buffer 1 μL、目的條帶7 μL、線性化載體1 μL和T4 DNA Ligase 1 μL，在16 ℃低溫連接儀上連接16 h。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞 DH5α中，取200 μL產(chǎn)物涂板，過夜培養(yǎng)后，挑取單克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定，取陽(yáng)性菌落測(cè)序。

1.2.3 鱖AKT2重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化 將構(gòu)建的原核表達(dá)載體pET32a-AKT2轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)，并接種至固體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(含氨芐青霉素50 μg/mL)平板中，培養(yǎng)12～18 h后，挑取單克隆測(cè)序。將測(cè)序正確的含重組質(zhì)粒的菌液接種至液體培養(yǎng)基(含氨芐青霉素50 μg/mL)中,于37 ℃振蕩培養(yǎng)至菌液在600 nm處的吸光度(OD600)約為0.6時(shí)，加入IPTG誘導(dǎo)劑(終濃度1 mmol/L)，37 ℃振蕩培養(yǎng)3 h；超聲(功率200 W，工作3 s、暫停4 s)破碎菌體2～3 min；4 ℃、6 000 r/min離心30 min，收集上清及沉淀。分別取菌體沉淀和上清，用 1×Loading Buffer重懸裂解，沸水浴15 min后進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。證明重組蛋白在沉淀中以包涵體形式表達(dá)后，用ProteoSpinTM包涵體分離純化試劑盒純化沉淀(包涵體)，并通過SDS-PAGE對(duì)純化的重組蛋白進(jìn)行鑒定。

1.2.4 鱖AKT2多克隆抗體的制備 采集日本大耳兔血液，分離血清作為免疫前血清，備用。以純化的重組AKT2蛋白為抗原，背部皮下注射免疫日本大耳兔，免疫劑量300 μg/只。一免抗原利用弗氏完全佐劑進(jìn)行乳化，二免、三免和四免抗原用弗氏不完全佐劑進(jìn)行乳化，最后一次免疫后2周，于兔耳緣靜脈處取血，分離血清。對(duì)免疫前、后血清進(jìn)行1∶2 000，1∶4 000，1∶8 000，…，1∶8 192 000梯度稀釋，選擇2 μg/mL的抗原包被，采用間接ELISA方法測(cè)定多克隆抗體的效價(jià)，以免疫后血清OD450值/免疫前血清OD450值>2(P/N>2)為判斷標(biāo)準(zhǔn)。利用Ni-NTA鎳離子親和層析純化抗體，用BCA法測(cè)定純化后抗體的質(zhì)量濃度，并進(jìn)行SDS-PAGE鑒定。

采用Western blot法檢測(cè)抗AKT2多克隆抗體的特異性(蛋白水平)。具體方法如下：利用RIPA裂解液提取CPB細(xì)胞總蛋白(設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù))，經(jīng)BCA法測(cè)定蛋白濃度后, 進(jìn)行SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)移至0.45 μL PVDF膜上；以制備的兔抗ScAKT2多克隆抗體為一抗，羊抗兔IgG HRP為二抗，進(jìn)行 Western blot檢測(cè)。

采用間接免疫熒光法檢測(cè)AKT2多克隆抗體的特異性(細(xì)胞水平)。方法如下：用預(yù)冷的甲醇固定CPB細(xì)胞，經(jīng)TritionX-100透化及50 g/L的BSA封閉后，用經(jīng)50 g/L BSA稀釋(1∶50)的ScAKT2抗體(一抗)和經(jīng)50 g/L BSA稀釋(1∶2 000)的帶有FITC標(biāo)簽的二抗分別孵育，用DAPI染色后加入少許洗液，鏡檢。

1.2.5 過表達(dá)鱖AKT2細(xì)胞系的建立 (1)AKT2 ORF的克隆。根據(jù)鱖AKT2序列，設(shè)計(jì)引物：AKT2-F (5′-CCGGAATTCATGAATGAAGTCAGTGTTGT-3′，斜體部分為EcoR Ⅰ酶切位點(diǎn))和AKT2-R (5′-CGGGGTACCTCATTCCCGTATGCTGGCAGAG-3′，斜體部分為KpnⅠ酶切位點(diǎn))。PCR擴(kuò)增AKT2基因，具體方法同1.2.2(1)。

(2)過表達(dá)載體pCMV-EGFP-ScAKT2的構(gòu)建。利用EcoR Ⅰ和KpnⅠ將AKT2 ORF連接至pCMV-EGFP載體，構(gòu)建過表達(dá)載體pCMV-EGFP-AKT2，具體方法同1.2.2(2)。菌落PCR檢測(cè)后，測(cè)序。

(3)過表達(dá)AKT2細(xì)胞系的構(gòu)建。 用Pure Yield(TM)質(zhì)粒中提試劑盒提取菌液中的質(zhì)粒，利用FuGENE?6將pCMV-EGFP-ScAKT2載體和pCMV-EGFP空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至CPB細(xì)胞中，培養(yǎng)24 h后觀察熒光表達(dá)情況。使用半致死質(zhì)量濃度為 1 000 μg/mL的G418對(duì)轉(zhuǎn)染成功的CPB細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)加壓，直至綠色熒光蛋白充滿整個(gè)視野且可以穩(wěn)定傳代。

(4)過表達(dá)AKT2細(xì)胞系的鑒定。以穩(wěn)定傳代的過表達(dá)AKT2細(xì)胞系為試驗(yàn)組，穩(wěn)定傳代pCMV-EGFP空載的細(xì)胞系為對(duì)照組，取3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和蛋白水平上的鑒定。以18S為內(nèi)參，用熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)AKT2 m-RNA的表達(dá)水平。根據(jù)GenBank 中的ScAKT2序列(GenBank 號(hào)：KY984992.1)，設(shè)計(jì)引物F(AGCCACAAGTTCTTCACCTCCATC)和R(CGCTGATCTGAATCCTCCGCATC)，擴(kuò)增片段大小為188 bp；以cDNA為模板，18S為內(nèi)參(所用引物的相關(guān)信息見表1)，使用TB Green?Premix ExTaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus)檢測(cè)AKT2 mRNA的表達(dá)水平?？傮w系為20 μL：2×SYBR預(yù)混劑TaqTM10 μL,正、反引物(10 μmol/L) 0.5 μL,ROX參比染料Ⅱ0.5 μL,cDNA 2 μL,水6.5 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性 30 s；95 ℃ 變性 5 s，56 ℃復(fù)性 30 s，共 40 個(gè)循環(huán)。采集熒光信號(hào)，采用2-ΔΔCt法計(jì)算AKT2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。以β-actin蛋白為內(nèi)參，用Western blot檢測(cè)過表達(dá)AKT2細(xì)胞蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

表1 熒光定量PCR所用的引物及其相關(guān)信息Table 1 Related information of the primers used in fluorescence quantitative PCR

1.2.6 過表達(dá)AKT2的CPB細(xì)胞抗病毒能力分析 (1)過表達(dá)AKT2對(duì)ISKNV病毒拷貝數(shù)的影響。根據(jù)ISKNV在CPB細(xì)胞上的增殖周期[13]，用構(gòu)建成功的過表達(dá)AKT2和空載的CPB細(xì)胞分別感染ISKNV (感染復(fù)數(shù)(MOI)為1)，在感染后于ISKNV的增殖早期(36，48 h)提取CPB細(xì)胞的DNA，以提取的DNA為模板，用qPCR法[14]測(cè)定ISKNVORF007基因的病毒拷貝數(shù)，所用的ORF007引物及探針引物ORF007-probe的相關(guān)信息見表1。

(2)過表達(dá)AKT2對(duì)ISKNV-MCP蛋白的影響。在感染ISKNV 48 h后，提取CPB細(xì)胞的總蛋白，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，以ISKNV-MCP(1∶500)單抗、β-actin抗體(1∶5 000)(內(nèi)參)為一抗，用Western blot檢測(cè)ISKNV-MCP蛋白的表達(dá)情況。

(3)過表達(dá)AKT2對(duì)先天免疫因子在轉(zhuǎn)錄水平上相對(duì)表達(dá)量的影響。以cDNA為模板，18S為內(nèi)參，用qRT-PCR法檢測(cè)ScIRF3、ScIRF7、ScIL8、ScMx、ScTRAF2、ScTRAF3等先天免疫因子在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)情況。根據(jù)GenBank中公布的相關(guān)序列，采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物的相關(guān)信息見表1。PCR反應(yīng)體系和程序同1.2.5(4)，采用2-ΔΔCt方法計(jì)算各基因mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用GraphPad prime 6.0進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和制圖，使用SPASS 21.0進(jìn)行數(shù)據(jù)差異相關(guān)性分析。試驗(yàn)數(shù)據(jù)表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”，n=3，以“*”代表P<0.05，“**”代表P<0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 ScAKT2 ORF的克隆及原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

經(jīng)PCR擴(kuò)增得到約1 400 bp的AKT2 ORF片段(圖1-A)，與預(yù)期大小相符。測(cè)序結(jié)果表明，鱖AKT2的ORF為1 449 bp。原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a-ScAKT2的PCR擴(kuò)增獲得了約1 400 bp的片段(圖1-B)，測(cè)序鑒定獲得了1 449 bp的片段，表明原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a-ScAKT2構(gòu)建成功。

A.鱖AKT2 ORF的克??；B.原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a-ScAKT2的PCR鑒定；M.DNA Marker DL15000;1～4.AKT2ORF的克隆；5，9.AKT2 ORF轉(zhuǎn)化失敗的樣品；6～8.AKT2 ORF轉(zhuǎn)化成功的樣品A.Cloning of AKT2 ORF；B.PCR identification of prokaryotic expression plasmid pET32a-ScAKT2.M；DNA Marker DL15000;1-4.Cloning of AKT2 ORF；5,9.Samples failed transfected with AKT2 ORF；6-8.Samples successfully transfected with AKT2 ORF圖1 鱖AKT2 ORF克隆及原核表達(dá)質(zhì)粒的鑒定Fig.1 Cloning of AKT2 ORF and identification of prokaryotic expression plasmid

2.2 ScAKT2重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)，在沉淀中檢測(cè)到約72 ku(含標(biāo)簽約20 ku)的條帶(圖2-A)，說明ScAKT2重組蛋白以包涵體的形式表達(dá)。純化后，重組蛋白主要集中在72 ku左右 (圖2-B)，可以進(jìn)行后續(xù)免疫試驗(yàn)。

A.AKT2融合蛋白的SDS-PAGE 分析；B.AKT2融合蛋白的純化；M.蛋白Marker；1.沉淀；2.上清;3.純化后的AKT2融合蛋白A.SDS-PAGE analysis of AKT2 fusion protein;B.Purification of AKT2 fusion protein;M.Protein Marker;1.Precipitation;2.Supernatant;3.ScAKT2 fusion protein after purification圖2 鱖AKT2融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化Fig.2 Induction,expression and purification of ScAKT2 fusion protein

2.3 抗ScAKT2多克隆抗體的制備

用純化的重組AKT2蛋白免疫日本大耳兔，間接ELISA法測(cè)定血清免疫效價(jià)可達(dá)1∶256 000(圖3-A)。對(duì)純化的ScAKT2多克隆抗體進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，結(jié)果有兩條條帶，其中一條為多克隆抗體的重鏈(約45 ku)，另一條為輕鏈(約25 ku)，純化效果良好(圖3-B)。經(jīng)BCA法測(cè)定，純化后的抗體質(zhì)量濃度約為10 mg/mL。

A.抗ScAKT2抗體的免疫效價(jià)；B.抗ScAKT2抗體的純化；M.蛋白Marker；1.純化后的抗體A.The immune titer of anti-ScAKT2 antibody;B.Anti-ScAKT2 antibody purification；M.Protein Marker;1.Purified antibody圖3 抗ScAKT2多克隆抗體效價(jià)的測(cè)定與純化Fig.3 Determination of anti-ScAKT2 polyclonal antibody titer and purified antibody

制備的多抗經(jīng)Western blot鑒定，在約60 ku處有1條特異性條帶(圖4-A)，表明制備的多克隆抗體能特異性識(shí)別CPB細(xì)胞的AKT2蛋白。間接免疫熒光試驗(yàn)證實(shí)，所制備的抗ScAKT2多抗可識(shí)別CPB細(xì)胞，且ScAKT2主要在CPB細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)(圖4-B)。

A.Western blot結(jié)果；B.間接免疫熒光結(jié)果；M.蛋白Marker；1.抗體與CPB細(xì)胞特異性結(jié)合A.Western blot result;B.Indirect fluorescent immune result；M.Protein Marker;1.Specific binding between antibodies and CPB cells圖4 抗ScAKT2多克隆抗體的特異性分析Fig.4 Analysis of specificity of anti-ScAKT2 polyclonal antibody

2.4 ScAKT2過表達(dá)CPB細(xì)胞系的構(gòu)建

經(jīng)PCR擴(kuò)增得到約1 400 bp的帶有酶切位點(diǎn)EcoR Ⅰ、KpnⅠ的ScAKT2 ORF片段(圖5-A);測(cè)序結(jié)果顯示,成功克隆到1 449 bp的ORF片段。過表達(dá)載體pCMV-EGFP-ScAKT2 PCR擴(kuò)增獲得了約1 400 bp的片段(圖5-B)，測(cè)序結(jié)果表明,過表達(dá)載體pCMV-EGFP-ScAKT2構(gòu)建成功。

A.鱖AKT2 ORF的克?。籅.真核表達(dá)質(zhì)粒pCMV-EGFP-AKT2的PCR鑒定；M.DNA Marker DL10000;1～3.AKT2 ORF的克?。?,10.轉(zhuǎn)化失敗的樣品；6～9.轉(zhuǎn)化成功的樣品A.Cloning of AKT2 ORF；B.PCR identification of eukaryotic expression plasmid pCMV-EGFP-AKT2；M.DNA Marker DL10000;1-3.Cloning of AKT2 ORF；5,10.Samples failed transfected with AKT2 ORF；6-9.Samples successfully transfected with AKT2 ORF圖5 鱖AKT2 ORF的克隆及真核表達(dá)質(zhì)粒的鑒定Fig.5 Cloning of AKT2 ORF and identification of eukaryotic expression plasmid

經(jīng)過G418多次加壓篩選，pCMV-EGFP和pCMV-EGFP-ScAKT2 CPB的細(xì)胞系約有80%的細(xì)胞可穩(wěn)定表達(dá)EGFP(圖6-A、B)。qRT-PCR結(jié)果表明，在pCMV-EGFP-ScAKT2的CPB細(xì)胞系中，ScAKT2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量極顯著高于pCMV-EGFP CPB細(xì)胞系(圖6-C)。Western blot結(jié)果顯示，在pCMV-EGFP-ScAKT2的CPB細(xì)胞系中，ScAKT2蛋白的表達(dá)量明顯高于pCMV-EGFP細(xì)胞系(圖6-D)。以上結(jié)果表明，已成功獲得了ScAKT2過表達(dá)CPB細(xì)胞系。

A.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pCMV-EGFP的CPB細(xì)胞；B.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pCMV-EGFP-ScAKT2的CPB細(xì)胞；C.ScAKT2 mRNA相對(duì)表達(dá)量；D.ScAKT2蛋白的表達(dá)量。圖柱上標(biāo)**表示與pCMV-EGFP CPB組差異極顯著(P<0.01)A.CPB cells stably transfected with pCMV-EGFP;B.CPB cells stably transfected with pCMV-EGFP-ScAKT2;C.Relative expression of ScAKT2 mRNA;D.The expression of ScAKT2 protein.**indicates extremely significant difference from the pCMV-EGFP CPB group (P<0.01)圖6 過表達(dá)ScAKT2細(xì)胞系的構(gòu)建與鑒定Fig.6 Construction and identification of overexpression ScAKT2 cell lines

2.5 過表達(dá)ScAKT2 CPB細(xì)胞的抗病毒能力分析

分別于感染ISKNV后36 和48 h提取DNA樣品，用qPCR法測(cè)定ISKNV含量。結(jié)果(圖7)顯示，pCMV-EGFP-ScAKT2 CPB細(xì)胞中的ISKNV含量極顯著低于pCMV-EGFP CPB細(xì)胞系。同時(shí),于48 h收取總蛋白樣品，用Western blot法測(cè)定ISKNV-MCP蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果見圖8。圖8顯示,在過表達(dá)ScAKT2的CPB細(xì)胞中，ISKNV-MCP蛋白的表達(dá)被抑制。在感染ISKNV后分別于36和48 h提取細(xì)胞總RNA樣品，用RT-PCR法檢測(cè)先天免疫因子的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果(圖9)顯示，ScIRF3、ScIRF7、ScIL8、ScMx、ScTRAF2和ScTRAF3的mRNA均顯著上調(diào),且上調(diào)效果具時(shí)間依賴性。

圖柱上“**”表示差異極顯著(P<0.01)** on the column indicates an extremely significant difference (P<0.01)圖7 過表達(dá)ScAKT2對(duì)ISKNV增殖的影響Fig.7 Effect of the proliferation of ISKNV with overexpression ScAKT2

圖8 過表達(dá)ScAKT2對(duì)ISKNV-MCP蛋白的影響Fig.8 Effect of ISKNV-MCP protein with overexpression ScAKT2

圖柱上標(biāo)*、**表示與pCMV-EGFP CPB轉(zhuǎn)染組相比差異顯著(P<0.05))或極顯著(P<0.01)*，** on the column indicates a significant difference (P<0.05) or an extremely significant difference (P<0.01) from the pCMV-EGFP CPB group圖9 過表達(dá)ScAKT2對(duì)先天免疫因子mRNA表達(dá)的影響Fig.9 Effect of the mRNA expression of innate immune factors with overexpression ScAKT2

3 討 論

AKT是多種細(xì)胞過程的關(guān)鍵調(diào)控因子，在細(xì)胞存活和凋亡中扮演著重要角色。已有大量研究表明，病毒侵染細(xì)胞期間，AKT途徑被激活，進(jìn)而抑制病毒的增殖。本研究結(jié)果表明，鱖AKT2可抑制ISKNV復(fù)制增殖，這為鱖傳染性脾腎壞死病毒病的防控提供了新的靶點(diǎn)。

AKT作為一個(gè)抗病毒靶標(biāo)，對(duì)許多病毒的增殖有抑制作用。登革熱病毒(dengue virus，DENV) 和日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)感染可激活機(jī)體的AKT途徑，抑制病毒的復(fù)制增殖[15]。阻斷AKT的激活，可提高血清型3型呼腸孤病毒(the sero-type 3 reovirus)RNA的增殖[16]。在乙型肝炎(HBV)[17]和丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)[18]持續(xù)感染的情況下，機(jī)體AKT途徑被激活，從而抑制病毒復(fù)制，促進(jìn)細(xì)胞存活?？谔阋卟《?foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV)的VP1蛋白可抑制AKT途徑，從而促進(jìn)病毒的復(fù)制增殖[19]。機(jī)體AKT的活化，可抑制腸道病毒71型(enterovirus 71，EV71)的感染，為EV71的防控提供新的靶標(biāo)[20-21]。在牛流行熱病毒(bovine ephemeral fever virus，BEFV)感染后期，機(jī)體AKT途徑被抑制，進(jìn)而導(dǎo)致病毒的增殖增強(qiáng)[22]。 寨卡病毒(ZIKV)的NS4A和NS4B蛋白可感染人胚胎神經(jīng)干細(xì)胞，導(dǎo)致AKT被抑制[23]，使病毒的復(fù)制增強(qiáng)，最終導(dǎo)致神經(jīng)發(fā)生缺陷。為了研究ScAKT2的抗病毒功能，本試驗(yàn)制備了ScAKT2多克隆抗體，間接免疫熒光(IFA)和Western blot試驗(yàn)證實(shí)，ScAKT2多克隆抗體可以與ScAKT2蛋白進(jìn)行特異性反應(yīng)。本試驗(yàn)進(jìn)一步構(gòu)建了ScAKT2過表達(dá)細(xì)胞系，并用qPCR和Western blot法檢測(cè)了過表達(dá)ScAKT2后ISKNV復(fù)制的變化情況，結(jié)果顯示，ScAKT2過表達(dá)可抑制ISKNV的增殖，表明在ISKNV侵染細(xì)胞過程中，ScAKT2對(duì)ISKNV的復(fù)制增殖具有抑制作用。

哺乳動(dòng)物感染呼腸孤病毒(mammalian reovirus)后，機(jī)體AKT被活化從而會(huì)激活I(lǐng)FN刺激反應(yīng)元件(ISRE)，并上調(diào)IFN刺激基因(ISGs)[24]。Hrincius等[25]研究表明，機(jī)體感染流感病毒時(shí)，AKT可以通過維甲酸誘導(dǎo)基因Ⅰ(retinoic acid-inducible gene Ⅰ，RIG-Ⅰ)依賴性的信號(hào)途徑被激活，并促進(jìn)IRF3激活和Ⅰ型干擾素表達(dá)。有報(bào)道指出，AKT3的敲除可抑制IRF3的活化，顯著降低IFN-β的產(chǎn)生，并提高病毒載量；AKT3的活化可激活I(lǐng)RF3，從而提高IFN-β的產(chǎn)生和增強(qiáng)抗病毒功能[26]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)ScAKT2的CPB細(xì)胞可通過上調(diào)先天免疫因子ScIRF3、ScIRF7和ScTRAF2等的表達(dá)來抑制ISKNV的增殖，這為鱖病毒治療藥物的研發(fā)提供了一個(gè)新的靶點(diǎn)，也為更深入地探討ISKNV與寄主互作的致病機(jī)制提供了新的方向。