哈斯，周家民，韓玲鈺，鄒宇，馬堃，李婷婷

（大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遼寧大連 116600）

由于水產(chǎn)品的開發(fā)利用相對較低，其容易在微生物的作用下腐敗變質(zhì)，而馬鮫魚（Scomberomorus niphonius）是一種容易在腐敗變質(zhì)后發(fā)生生物胺中毒的魚[1]。馬鮫魚具有分布較廣、產(chǎn)量較高、生長較快等特點，已經(jīng)在東北地區(qū)成為一種主要的經(jīng)濟魚類[2,3]。生物胺（Biogenic amines，BAs）是一類低分子質(zhì)量含氮有機化合物，廣泛存在于富含蛋白質(zhì)和氨基酸的食物中，大多可由具有脫羧酶活性的微生物將氨基酸分解生成[4]。生物胺根據(jù)結(jié)構(gòu)可劃分為芳香族胺、脂肪族胺和雜環(huán)族胺；根據(jù)組成可分為單胺和多胺。生物胺產(chǎn)生主要有兩種方式，一種是游離的氨基酸經(jīng)微生物的脫羧作用，另一種則通過氨基酸脫羧酶脫羧作用[5]。水產(chǎn)品在運輸和貯藏的過程中十分容易受到微生物的污染而產(chǎn)生大量的生物胺，由于其含有大量的氨基酸和蛋白質(zhì)。一部分微生物可以通過控制氨基酸脫羧酶，產(chǎn)生相應(yīng)的代謝物質(zhì)來促進生物胺的產(chǎn)生，從而導(dǎo)致水產(chǎn)品的腐敗變質(zhì)，在水產(chǎn)品中分離得到的腸桿菌科、氣單胞菌屬、假單胞菌屬、弧菌屬、梭菌屬、肺炎克雷伯氏桿菌、鏈球菌屬、埃希氏菌屬、變形桿菌屬等多種微生物種群都可以產(chǎn)生生物胺[6]。含有高濃度生物胺的食物可能是魚類，魚類衍生物和發(fā)酵產(chǎn)品[7]。適量的生物胺可維持正常的生理代謝，但過量的生物胺會使人體中毒并引起嚴(yán)重的反應(yīng)，如頭痛、血壓變化、呼吸系統(tǒng)疾病、心悸等[8,9]。因此如何抑制生物胺的產(chǎn)生成為越來越重要的研究問題同時也受到了越來越多人的關(guān)注。

通常認(rèn)為，生物胺的形成能力似乎與菌株有關(guān)，而不是特定物種[10]。腸桿菌科細(xì)菌顯示出通過精氨酸脫羧分別產(chǎn)生多胺，特別是腐胺的強大能力[11]。大腸桿菌中腐胺的合成涉及精氨酸脫羧酶將精氨酸脫羧生成胍丁胺，然后將其通過胍丁胺尿素水解酶水解，或通過精氨酸脫羧酶水解精氨酸[12]。在之前的工作中，發(fā)現(xiàn)馬鮫魚體內(nèi)含有大量腐胺。通過16s rRNA 鑒定的來自馬鮫魚的菌株為霍氏腸桿菌。因此，在這項研究中，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）克隆和表達了來自霍氏腸桿菌中精氨酸脫羧酶基因（ADC），還對其進行了一系列的生物信息學(xué)分析，為后續(xù)的深入研究提供參考。今后在基因克隆的基礎(chǔ)上，將進行蛋白質(zhì)的表達、分離純化和性質(zhì)研究，進一步解析精氨酸脫羧酶。

1 材料和方法

1.1 材料

馬鮫魚，購置于大連樂購冷鮮超市冷庫；霍氏腸桿菌Ho-01（分離于馬鮫魚體內(nèi)）LB 培養(yǎng)基，北京索萊寶生物科技公司；PrimeSTAR? Max DNA Polymerase 高保真酶試劑盒，大連Takara 公司；50×TAE 緩沖液、異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）、X-Gal、氨芐青霉素，北京索萊寶生物科技公司；Mighty TA-cloning Reagent Set for PrimeSTAR?試劑盒，大連Takara 公司；TIANprep Mini Plasmid Kit 質(zhì)粒小提試劑盒，大連Takara 公司；pMD20-T vector 克隆載體、E. coli JM109 Competent Cells，大連Takara 公司；溴化乙錠核酸染色劑、DNA Maker、瓊脂糖，上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 實驗儀器

防蒸發(fā)梯度PCR 儀，德國Eppendorf 公司；LRH型生化培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；LDZX-50FBS立式高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；DK-8D型恒溫水浴槽，上海一恒科技有限公司；PE Victor X3酶標(biāo)儀，美國Perkin Elmer 公司；HZQ-X300C 型恒溫振蕩器，上海一恒科技有限公司；Purifier 生物安全柜，美國LABCONCO 公司；Legend Micro21R 微量冷凍離心機，美國Thermo 公司；Ge1Doc XR+全自動凝膠成像系統(tǒng)，美國Bio-Rad 公司；PE Victor X3 酶標(biāo)儀，美國Perkin Elmer 公司。

1.3 菌種活化及基因組DNA 提取

霍氏腸桿菌的活化，從-80 ℃超低溫冰箱中取出保存的菌種，平板劃線于LB 固體培養(yǎng)基，28 ℃倒置培養(yǎng)12～16 h，挑取單菌落于10 mL LB 液體培養(yǎng)基中，28 ℃、160 r/min 搖床過夜培養(yǎng)用。將細(xì)菌溶液放入1.5 mL EP 管中，離心10 min 以棄去上清液。加入1 mL TE 緩沖液重懸菌體，旋渦使菌體充分混勻。將細(xì)菌溶液置于1.5 mL EP 管中，并在沸水浴中加熱10 min，離心并以上清液為模板。得到的DNA用50～100 μL TE Buffer 溶解，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 霍氏腸桿菌Ho-01 目的基因ADC 的克隆及測序

根據(jù)NCBI 數(shù)據(jù)庫中的霍氏腸桿菌基因序列（GenBank：CP036310.1），利用primer primer 5 軟件進行擴增引物的設(shè)計。在上海生工生物工程有限股份公司合成基因擴增引物序列（表1 所示）。

表1 ADC 基因擴增引物序列Table 1 ADC gene amplification primer sequence

以霍氏腸桿菌Ho-01 的基因組DNA 為模板，利用高保真酶試劑盒PrimeSTAR? HS DNA Polymerase 進行PCR 實驗，并根據(jù)使用說明書及優(yōu)化試驗確定PCR擴增反應(yīng)體系及條件。ADC 基因擴增反應(yīng)條件為：98 ℃，10 s；58 ℃，5 s；72 ℃，5 s；30 個循環(huán)；4 ℃恒溫。

表2 生物信息學(xué)分析工具Table 2 Bioinformatics analysis tools

擴增所得的目的片段，通過大連Takara 公司的MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction 試劑盒進行PCR 產(chǎn)物純化，然后與pMD20-T 載體進行連接，重組的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coli JM109 感受態(tài)細(xì)胞，通過藍(lán)白斑篩選挑取陽性克隆子，送至Takara 公司進行測序，測序結(jié)果利用NCBI 網(wǎng)站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）進行比對分析。

1.5 精氨酸脫羧酶的生物信息學(xué)分析

將測序獲得的ADC 核酸序列使用NCBI 網(wǎng)站中的ORFfinder 工具翻譯為氨基酸序列，翻譯得到的ADC 蛋白的氨基酸序列上傳至NCBI 網(wǎng)站，進行序列BLAST 分析，蛋白數(shù)據(jù)庫選用Swiss-Prot Database，將高相似性蛋白比對序列下載至本地，按照系統(tǒng)發(fā)育分析軟件MEGA 7.0 進行序列同源性比對，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。生物信息學(xué)分析工具如表2 所示。

2 結(jié)果與分析

圖1 重組質(zhì)粒ADC 目的片段的PCR 產(chǎn)物Fig.1 The PCR amplification products of ADC fragments

2.1 ADC 基因克隆及測序

如圖1 所示，通過PCR 從霍氏腸桿菌的總DNA中擴增了一個基因片段，目的片段大小約為260 bp,與測序結(jié)果基本吻合，在NCBI 網(wǎng)站對測序結(jié)果比對分析，由霍氏腸桿菌中克隆測序獲取的基因片段序列與GenBank 中登錄的霍氏腸桿菌精氨酸脫羧酶基因speA 序列的同源性達99%，可初步確定菌株中存在精氨酸脫羧酶基因，為精氨酸脫羧酶基因的后續(xù)表達及其編碼蛋白的功能探究奠定了基礎(chǔ)。

2.2 ADC 蛋白一級結(jié)構(gòu)的確定及序列比對分析

利用NCBI 網(wǎng)站中ORFfinder 工具將ADC 核酸序列分別翻譯為氨基酸序列，將翻譯得到的ADC 蛋白的氨基酸序列分別上傳至NCBI 網(wǎng)站，進行序列BLAST 分析，比對結(jié)果顯示該序列與GenBank 中登錄的霍氏腸桿菌精氨酸脫羧酶基因（speA）序列的同源性達100%（圖2）。

2.3 ADC 蛋白的同源性分析

通過NCBI 數(shù)據(jù)庫的smart BLAST 工具搜索ADC 蛋白的相似性較高的序列，將下載的序列用DANMAN 8.0軟件進行多序列比對，結(jié)果如圖3所示，ADC 蛋白與腸桿菌科生物合成精氨酸脫羧酶（登錄號：WP_001295380.1）相似度較高?；贏DC 的多序列比對結(jié)果，利用MEGA 7.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹（圖4）。

圖2 ADC 蛋白的氨基酸序列比對Fig.2 Amino acid sequence alignment of ADC protein

圖3 ADC 蛋白多序列比對Fig.3 ADC protein multiple sequence alignment

圖4 ADC 基因系統(tǒng)進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of ADCgene

2.4 ADC 蛋白理化性質(zhì)預(yù)測

將目的蛋白的氨基酸序列輸入至 ExPASy-ProtParam 在線分析軟件中進行蛋白質(zhì)理化性質(zhì)預(yù)測，結(jié)果如表2 所示，ADC 蛋白由93 個氨基酸構(gòu)成，預(yù)估分子量大小約為10.82 ku、理論等電點是8.64、原子組成為C492H746N136O135S3、半衰期＞10 h（大腸桿菌，體內(nèi)）、脂肪系數(shù)為86.02；總平均親水性是-0.35 整體表現(xiàn)親水性，屬于可溶性蛋白；不穩(wěn)定系數(shù)為48.57，根據(jù)不穩(wěn)定系數(shù)數(shù)值＜40 屬于穩(wěn)定蛋白的標(biāo)準(zhǔn)，推斷ADC 蛋白為不穩(wěn)定蛋白。

表2 ADC 蛋白理化性質(zhì)的預(yù)測Table 2 The prediction of physicochemical properties of ADC proteins

2.5 ADC 蛋白親疏水分析

使用ProtScale 工具分析ADC 蛋白親疏水性，由圖3 可知，其中負(fù)值代表親水，數(shù)值越小親水性越強，而正值代表疏水，數(shù)值越大疏水性越強。疏水區(qū)最大值為第58 位氨基酸（1.878），親水區(qū)最小值為47 位氨基酸（-2.522），圖中可以看出在0 以下的區(qū)域有很多氨基酸，即親水性區(qū)域，所以ADC 蛋白為親水性蛋白質(zhì)，這與Expasy Protaram 預(yù)測得到的總平均疏水指數(shù)（GRAVY=-0.35）結(jié)果是一致。

圖5 ADC 蛋白的疏水性分析Fig.5 The Hydrophobic forecast of ADCproteins

2.6 ADC 蛋白跨膜結(jié)構(gòu)及信號肽預(yù)測

圖6 ADC 蛋白的跨膜區(qū)預(yù)測Fig.6 The transmembrane region prediction of ADC proteins

圖7 ADC 蛋白的信號肽預(yù)測Fig.7 The signal peptide prediction of ADC proteins

通過TMHMM Serverv. 2.0 在線工具預(yù)測跨膜與跨膜螺旋結(jié)構(gòu)特征，ADC 蛋白預(yù)測的跨膜螺旋（Transmembrane Helix，TMH）數(shù)為0，N’末端在膜的細(xì)胞質(zhì)側(cè)的總概率為0.45，可以推測ADC 蛋白都處于膜外，為非跨膜蛋白（圖6）。用Signal P 4.0 Server軟件預(yù)測ADC 蛋白信號肽，通過綜合剪切點分值C的最大值來預(yù)測信號肽的剪切位點，通過信號肽分值（S＞0.5）來判斷ADC 蛋白是否為分泌蛋白，第50位氨基酸CMax＝0.11，S 平均值為0.13（＜0.5），說明ADC 蛋白均不具有分泌信號肽的特征（圖7）。

2.7 ADC 蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

圖8 ADC 蛋白的二級結(jié)構(gòu)Fig.8 The secondary structure prediction of ADC proteins

蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測有利于探究氨基酸序列和三維構(gòu)象之間的聯(lián)系。利用SOPMA 在線工具分析ADC 蛋白的二級結(jié)構(gòu)（圖8），由預(yù)測結(jié)果可知，ADC蛋白中α-螺旋（h 表示）為38.71%，β-轉(zhuǎn)角（t 表示）為9.68%，氨基酸殘基構(gòu)成的延伸鏈（e 表示）為24.73%，無規(guī)則卷曲（c 表示）占26.88%。蛋白質(zhì)肽鏈中構(gòu)成配體/受體結(jié)合的活性部位是無規(guī)則卷曲，容易受到側(cè)鏈相互影響而改變空間構(gòu)象，ADC 蛋白二級結(jié)構(gòu)中如果含有大量的無規(guī)則卷曲可能影響蛋白質(zhì)肽鏈的活性，從而影響蛋白質(zhì)的功能。

2.8 ADC 蛋白的三維構(gòu)象模型預(yù)測

經(jīng)SWISS-MODEL 在線分析平臺，ADC 蛋白與生物合成的精氨酸脫羧酶有98.90%相似，能夠用于同源建模。由圖9 可知，ADC 蛋白主要有α-螺旋和無規(guī)則卷曲構(gòu)成，與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測的結(jié)果是一致的。

圖9 ADC 蛋白的三級結(jié)構(gòu)Fig.9 The tertiary structure prediction of ADC proteins

3 結(jié)論

3.1 本實驗對馬鮫魚中霍氏腸桿菌鳥氨酸脫羧酶基因進行研究，包括基因克隆和生物信息學(xué)分析。通過PCR 擴增獲得目的基因，構(gòu)建T-A 克隆重組質(zhì)粒進行檢測最終獲得ADC 基因的堿基序列。同時預(yù)測了ADC 蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)、ADC蛋白質(zhì)功能、三維構(gòu)象五項內(nèi)容。

3.2 實驗結(jié)果表明ADC蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)由93個氨基酸組成，二級結(jié)構(gòu)由螺旋結(jié)構(gòu)、折疊結(jié)構(gòu)、無規(guī)卷曲和氨基酸殘基構(gòu)成的延伸鏈組成，其中螺旋結(jié)構(gòu)占38.71%占總結(jié)構(gòu)的三分之一以上。在理化性質(zhì)和功能預(yù)測中我們得知其分子量大小約為10.82 ku、理論等電點為8.64、原子組成為C492H746N136O135S3、半衰期＞10 h（大腸桿菌，體內(nèi)）、脂肪系數(shù)為86.02；總平均親水性為-0.35 整體表現(xiàn)親水性，屬于可溶性蛋白，而且不存在信號肽及跨膜區(qū)。上述研究首次報道馬鮫魚中產(chǎn)胺菌-霍氏腸桿菌中精氨酸脫羧酶的生物信息學(xué)特性，今后在基因克隆的基礎(chǔ)上，將進行蛋白質(zhì)的表達、分離純化和性質(zhì)研究，進一步解析精氨酸脫羧酶。