王 爽，劉雪松，徐 馨，吳 憲，張鵬宇，陳 曦，李 莉，江波濤

(黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院，黑龍江齊齊哈爾 161005)

生物活性肽(Bioactive peptides，BAP)是一類具有生物學(xué)活性、能夠?qū)C(jī)體產(chǎn)生一定影響的肽[1]。早期研究認(rèn)為，蛋白質(zhì)的消化需要經(jīng)過消化道各種酶類的水解，從而形成大量的氨基酸而被機(jī)體吸收利用。但是，隨著研究的深入，逐漸發(fā)現(xiàn)以氨基酸的形式進(jìn)行吸收只是蛋白質(zhì)的吸收方式之一，更多的則是以短肽的方式被吸收。因短肽可以直接對(duì)生命活動(dòng)進(jìn)行調(diào)控，其吸收方式要優(yōu)于蛋白質(zhì)及氨基酸[2]。生物活性肽一般為2～5個(gè)氨基酸合成的短肽，也有10～50個(gè)氨基酸組成的多肽，隨著研究的深入，開發(fā)了許多具有抗氧化、降血壓、降血脂、抗疲勞以及免疫調(diào)節(jié)等功能的生物活性肽，對(duì)機(jī)體健康具有良好的調(diào)控作用。生物活性肽的來源較為廣泛，包括了動(dòng)物源以及植物源等。其中動(dòng)物源的生物活性肽占據(jù)了重要的地位。動(dòng)物源的生物活性肽一般來自于動(dòng)物的肉類、血液以及組織等。因動(dòng)物源的生物活性肽來源較為廣泛、性價(jià)比較高，得到了市場(chǎng)的廣泛認(rèn)可。

1 生物活性肽的提取

1.1 酶解 酶解一般是從動(dòng)物的血液、蛋、奶以及不同組織中提取生物活性肽的第一步。在蛋白質(zhì)的氨基酸長(zhǎng)鏈中，存在著一些不具備生物活性肽的多肽片段。經(jīng)過酶解后，許多具有生物學(xué)活性的肽才能被釋放出來，發(fā)揮功能[5]。常用的酶包括了胰蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶以及木瓜蛋白酶等[6]。一般通過蛋白酶的水解作用，可將蛋白質(zhì)中的長(zhǎng)鏈變?yōu)槎替?。?jīng)過水解后的蛋白水解液，相比未經(jīng)過水解的蛋白質(zhì)，蛋白條帶會(huì)顯著減少，且蛋白大小會(huì)顯著下降[7]。相比較于其他的提取方法，酶解具有價(jià)格便宜、化學(xué)試劑以及毒性物質(zhì)殘留少的優(yōu)點(diǎn)被廣泛使用在生物活性肽保健品的制備工藝中[8]。Young等通過利用酶解技術(shù)從大眼金槍魚的肌肉中提取到了一種抗氧化的活性肽，通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)提取的生物活性肽具有優(yōu)良的抗氧化活性[9]。柳慧琴通過堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶復(fù)合酶解牛脊髓后，得到了抗氧化的牛脊髓肽[1]。馬利華等采用木瓜蛋白酶和中興蛋白酶的復(fù)合酶解方法，從鴨血中分離出來具有優(yōu)良效果的抗氧化肽[10]。酶解因其多種優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于生物活性肽的制備。

1.2 超濾 超濾是一種壓力驅(qū)動(dòng)的膜分離技術(shù)，通過超濾膜的表面微孔截流住大分子的溶質(zhì)，而小分子的物質(zhì)可順利通過微孔[11]。通過超濾技術(shù)，可以對(duì)分子量不同大小的肽進(jìn)行分離，從而確定不同分子量大小的肽的生物學(xué)特性。超濾在超濾膜的使用期限內(nèi)，可實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定的分離。在大規(guī)模的制備時(shí)，經(jīng)常使用超濾膜。而在實(shí)驗(yàn)室的試驗(yàn)階段，可以使用超濾管進(jìn)行替代；超濾在生物活性肽的制備上應(yīng)用也較為廣泛。崔學(xué)超等采用超濾方法分離鹿血抗氧化肽提取液，得到了4種不同分子質(zhì)量的鹿血抗氧化肽，通過不同肽段氧化自由基清除能力的測(cè)定，得出了分子量小于3 kD的肽段抗氧化性最強(qiáng)[12]。Nadalian等通過超濾的方法從肉雞的雞皮中獲得了一種抗氧化肽，并確認(rèn)具有良好的自由基清除能力[13]。葉孟亮通過對(duì)酶解后的牦牛骨膠原蛋白進(jìn)行超濾，發(fā)現(xiàn)小于3 kD的組分表現(xiàn)出了較高的促成骨細(xì)胞增殖活性[14]。在一般情況下，超濾是為酶解后得到的肽段進(jìn)行純化的方法。可有效將酶解后的肽按照分子量大小進(jìn)行分離，被廣泛應(yīng)用在生物活性肽的純化中。

1.3 凝膠色譜 凝膠色譜法的原理是凝膠能夠形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，根據(jù)樣品的分子量以及形狀差異，在網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中儲(chǔ)備的時(shí)間不同，進(jìn)而達(dá)到分離的目的[15]。凝膠具有分子篩的作用，不同的組分因分子粒徑的不同，移動(dòng)路程與洗脫時(shí)間不同而得到分離，從而可進(jìn)行多肽相對(duì)分子量的分布以及分級(jí)分析[16]。凝膠色譜具有條件溫和、樣品破壞性小、分離效果好等優(yōu)點(diǎn)，但單獨(dú)使用往往效果不佳，常與其他分離純化方法聯(lián)合使用。凝膠色譜法中常用的添料為葡聚糖Sephadex G-25、Sephadex G-15以及大孔樹脂等[17]。石菊芬通過凝膠色譜技術(shù)將羊胎盤胎通過葡聚糖Sephadex G-15分離后得到了4個(gè)組分，經(jīng)過鑒定后F-2組分的抗氧化能力最強(qiáng)[18]。曾珍等通過凝膠色譜技術(shù)利用葡聚糖Sephadex G-25對(duì)豬骨中的肽進(jìn)行了分離純化，得到了豬骨源的免疫活性肽[19]。宋曉光等利用DA201-C大孔樹脂對(duì)水蛭活性肽進(jìn)行了純化，發(fā)現(xiàn)其純化效果優(yōu)良[20]。周自福采用DA201-C大孔樹脂對(duì)牡蠣水解物進(jìn)行凝膠層析，從而獲得了具有抗高血壓的牡蠣生物活性肽[21]。

1.4 反相液相色譜 反相液相色譜法(RP-HPLC)是分離多肽的一種常用方法，其原理是利用多肽分子的疏溶劑或者疏水作用，非極性或弱極性的多肽分子會(huì)與非極性的固定相相結(jié)合，而這種結(jié)合會(huì)由于流動(dòng)相的變化而發(fā)生下降，進(jìn)而使溶質(zhì)分子被洗脫分離[22]。液相色譜分為分析液相和制備液相，對(duì)生物活性肽進(jìn)行分離的為制備液相。與凝膠色譜技術(shù)一樣，反相液相色譜技術(shù)多與其他的技術(shù)相結(jié)合用于生物活性肽的分離與純化。葉孟亮通過反相液相色譜技術(shù)對(duì)牦牛骨膠原蛋白肽進(jìn)行了進(jìn)一步的純化，獲得了較強(qiáng)的骨細(xì)胞增殖活性的肽[15]。劉東陽(yáng)用反相液相色譜技術(shù)對(duì)馬鮫魚源的生物活性肽進(jìn)行純化，得到了抗氧化活性優(yōu)良的活性肽[23]。

1.5 其他方法 除以上方法外，也有一些方法能夠?qū)ι锘钚噪倪M(jìn)行分離純化，如親和層析、雙水相萃取技術(shù)以及毛細(xì)管電泳等技術(shù)。但這些方法因?qū)?shí)驗(yàn)室設(shè)備要求較高以及操作復(fù)雜等問題，在生物活性肽的分離純化技術(shù)中使用相對(duì)較少。

2 結(jié)構(gòu)鑒定

2.1 電泳法 電泳技術(shù)是利用多肽的相對(duì)分子質(zhì)量以及等電點(diǎn)的不同對(duì)其鑒定的方法，其中，最常用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。電泳法操作簡(jiǎn)單、速度快，可以迅速地了解制備的肽的大致信息，但電泳法只能了解肽的相對(duì)分子質(zhì)量以及等電點(diǎn)，無法了解其具體序列[27]。劉麗君通過SDS-PAGE技術(shù)確定了酶解后的小于3 kD的駱血生物活性肽具有良好的抗氧化活性[11]。柳慧琴通過SDS-PAGE技術(shù)確定了牛脊髓蛋白分子集中分布在了18.5 kD，為接下來的牛脊髓源生物活性肽的分離與制備提供了依據(jù)[1]。電泳技術(shù)多用于生物活性肽結(jié)構(gòu)鑒定的第一步，是了解生物活性肽結(jié)構(gòu)的最基礎(chǔ)的一種方法。

2.2 質(zhì)譜法 質(zhì)譜法(Mass spectrommetry，MS)是利用質(zhì)譜儀器將肽轟擊成離子和離子碎片，然后按照質(zhì)荷比的不同對(duì)成分以及結(jié)構(gòu)分析的方法。其中包括了電噴霧電離質(zhì)譜法(ESI-MS)、基質(zhì)輔助激光解析電離質(zhì)譜法(MALDI-MS)以及四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜(Q-Exactive)等[28,29]。馬志鷹通過ESI-MS/MS對(duì)駝血源降血壓以及降血脂肽進(jìn)行了測(cè)序，確定了其分離純化的生物活性肽的氨基酸序列[30]。張寶林對(duì)馬鮫魚魚骨源的降血脂生物活性肽進(jìn)行了質(zhì)譜分析，確定了該種肽的氨基酸序列[31]。Wang等利用Q-Exactive質(zhì)譜技術(shù)對(duì)鯖魚源生物活性肽進(jìn)行了分析，確定了具有抗氧化活性肽的具體序列[32]。

2.3 其他方法 對(duì)于生物活性肽的結(jié)構(gòu)鑒定常用以上的兩種方法，但是也有一些其他的方法可以進(jìn)行生物活性肽的結(jié)構(gòu)鑒定，其中包括了紫外/紅外光譜法、核磁共振法以及圓二色譜法等。此類方法除了可以對(duì)生物活性肽的氨基酸進(jìn)行測(cè)序以外，也可以對(duì)活性肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行測(cè)定[16]。

3 功 能

3.1 抗氧化 機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的氧化可以產(chǎn)生自由基，如果機(jī)體內(nèi)的自由基過多，可能會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)以及DNA進(jìn)行破壞，從而引發(fā)疾病[33]。研究表明，體內(nèi)自由基過多會(huì)引發(fā)糖尿病、癌癥以及癡呆等疾病?？刂企w內(nèi)自由基在一個(gè)穩(wěn)定的數(shù)量對(duì)機(jī)體的健康具有重要意義[34]?？寡趸锘钚噪目捎行宄杂苫??？寡趸纳锘钚噪膩碓摧^為廣泛，其中以動(dòng)物來源較多[35]。一般采用體外化學(xué)法驗(yàn)證提取的活性肽抗氧化活性，其中包括了DPPH自由基清除測(cè)定、ABTS自由基清除測(cè)定、超氧陰離子自由基清除、羥自由基清除率以及亞鐵離子螯合能力的測(cè)定。劉麗君從駝血中分離純化出了具有抗氧化能力的生物活性肽，并通過了DPPH自由基清除試驗(yàn)以及亞鐵離子螯合試驗(yàn)驗(yàn)證了其抗氧化活性[11]。崔雪超等從鹿血中分離出了具有抗氧化的生物活性肽，并通過亞鐵還原能力以及DPPH自由基清除測(cè)定等方式，驗(yàn)證了該種肽的抗氧化能力[12]。

3.2 降血壓 高血壓是常見的慢性疾病，其可以增加心臟病以及中風(fēng)等疾病的幾率。血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化酶(ACE，EC 3.4.1.5.1)在血壓調(diào)節(jié)系統(tǒng)腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)和激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)(KKS)中起著重要作用[38]。在RAS中，ACE將血管緊張素Ⅰ裂解為有活性的血管緊張素Ⅱ，血管緊張素Ⅱ可以通過血管收縮進(jìn)而引發(fā)高血壓。在KKS中，ACE在激肽酶的C末端連續(xù)切割兩個(gè)氨基酸，導(dǎo)致該血管擴(kuò)張劑失效。因此，具有ACE抑制活性的生物活性肽可通過降低血管緊張素Ⅱ水平或者增加激肽水平來降低血壓[39]。對(duì)于抑制ACE活性肽的考察方法分為體外和體內(nèi)兩種。體外法最常用的就是測(cè)定馬尿酸法，它是基于ACE酶與底物馬尿酰-組氨酸-亮氨酸(HHL)之間的反映生成馬尿酸的原理，ACE活性與馬尿酸的生成量直接相關(guān)，直接通過測(cè)定馬尿酸的含量，從而評(píng)估ACE的抑制程度[40]。體內(nèi)試驗(yàn)是使用動(dòng)物模型的方式來驗(yàn)證對(duì)ACE抑制的活性。原發(fā)性高血壓大鼠(SHR)和人體高血壓有著相近的病例癥狀，一般用這個(gè)動(dòng)物模型來進(jìn)行體內(nèi)的ACE抑制活性考察[41]。馬志鷹在駝血中分離純化出了降血壓活性肽，并通過液相色譜測(cè)定馬尿酸含量的方法對(duì)其所具有的抑制ACE活性進(jìn)行考察[30]。張可佳在牡蠣中分離出了ACE抑制肽，并利用了SHR模型驗(yàn)證了該種肽抑制ACE的活性[42]。

3.3 降血脂 血液中的脂質(zhì)包括了乳糜微粒(CM)、極低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白(LDL)以及高密度脂蛋白(HDL)。如果血液中任何一種脂質(zhì)成分非正常升高，則可能是高脂血癥的前兆[30]。經(jīng)過流行病學(xué)調(diào)查以及臨床試驗(yàn)等都發(fā)現(xiàn)了高脂血癥與心臟疾病的發(fā)生關(guān)系緊密。維持血脂含量在一個(gè)正常水平對(duì)于預(yù)防心臟疾病有著重要意義?，F(xiàn)階段，市場(chǎng)上出現(xiàn)的降血脂藥物，價(jià)格昂貴并且有可能引發(fā)多種副作用。因此，研究人員逐漸研究開發(fā)降血脂的生物活性肽。對(duì)具有降血脂的生物活性肽活性的考察多使用的方法是HMG-CoA還原酶抑制方法。HMG-CoA還原酶是體內(nèi)催化3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A(HMG-CoA)生成二羥甲基戊酸(MVA)的關(guān)鍵酶，這一步是體內(nèi)合成膽固醇的限速步驟，也是目前最主要的高血脂癥臨床藥物的靶點(diǎn)[43]。楊玉英從蠶蛹中分離純化了具有降血脂活性的生物活性肽，并通過HMG-CoA還原酶抑制方法驗(yàn)證了其降血脂功能[44]。江錕等從鱸魚中分離出了具有降血脂活性的肽，并通過體外試驗(yàn)驗(yàn)證了其降血脂活性[45]。

3.4 免疫調(diào)節(jié) 免疫活性肽可以調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫系統(tǒng)，調(diào)節(jié)自身免疫力，刺激機(jī)體的淋巴細(xì)胞增殖能力和吞噬細(xì)胞的吞噬活性，提高機(jī)體對(duì)外源有害物質(zhì)和自身產(chǎn)生的老化凋亡細(xì)胞的抵抗清除能力[46]。根據(jù)免疫細(xì)胞的分類，免疫調(diào)節(jié)肽對(duì)免疫細(xì)胞的影響可以分為淋巴細(xì)胞、吞噬細(xì)胞、K淋巴細(xì)胞以及NK淋巴細(xì)胞。免疫調(diào)節(jié)肽也可以對(duì)多種細(xì)胞因子起作用，其主要調(diào)節(jié)TNF-α、IL-10、IL-2以及IL-6等細(xì)胞因子的分泌，達(dá)到對(duì)局部吞噬細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用，從而發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)功能。付勱從雞胚中分離出具有免疫調(diào)節(jié)作用的活性肽，并且將小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7給予活性肽驗(yàn)證其免疫調(diào)節(jié)活性，得出雞胚活性肽具有良好的免疫調(diào)節(jié)能力[47]。張東東對(duì)中國(guó)林蛙皮膚抗菌肽體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)作用進(jìn)行了研究，得出了源于中國(guó)林蛙皮膚分泌物的抗菌肽Temproin-CEa和chensinin-1b具有良好的免疫調(diào)節(jié)活性[48]。

3.5 其他 除了上述種類的生物活性肽以外，還有抗疲勞肽、降糖肽、神經(jīng)活性肽、酶調(diào)節(jié)及抑制肽以及抗菌肽等。這些肽都能對(duì)維持機(jī)體健康起到良好的作用。

4 小結(jié)與展望

生物活性肽是近些年來研究較為熱門的一個(gè)領(lǐng)域，由于其擁有著豐富的功能被廣大研究者們以及市場(chǎng)所接受。動(dòng)物源生物活性肽對(duì)維持機(jī)體的穩(wěn)定與健康發(fā)揮著重要的作用。從動(dòng)物血、骨頭、皮膚以及不同的臟器中分離出來的生物活性肽具有良好的功能，并且具有安全以及高效的優(yōu)點(diǎn)。因此，在食品行業(yè)、養(yǎng)殖行業(yè)以及化妝品行業(yè)中得到了廣泛應(yīng)用。目前，動(dòng)物源生物活性肽的研究還有一些不足之處，如大多數(shù)生物活性肽為多肽混合物，未能夠徹底進(jìn)行分離與純化，相應(yīng)的機(jī)理研究不全，以及相應(yīng)產(chǎn)品轉(zhuǎn)化率較低等問題。應(yīng)針對(duì)以上問題開展深入研究，向著高效、快速以及全面的方向發(fā)展，為動(dòng)物源生物活性肽的研究提供新思路以及新的方向，為維持機(jī)體健康提供更多優(yōu)良的產(chǎn)品。