徐藝丹 徐彬彬 韓銀淑

(廈門醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生與醫(yī)學(xué)技術(shù)系醫(yī)學(xué)美容教研室，福建 廈門 361023)

千年草是生長在韓國濟(jì)州島、牙山等地的一種仙人掌，被稱為"手巴掌仙人掌"，是一種可食用仙人掌。該品種個(gè)頭矮小，果實(shí)為紅色，具有很強(qiáng)的抗寒能力，能耐受-5℃的酷寒〔1〕。其果肉富含多種蛋白質(zhì)、維生素、微量元素等，營養(yǎng)豐富，仙人掌還具有抑菌、消炎、增強(qiáng)免疫力、降血糖、抗脂質(zhì)過氧化、促進(jìn)血液循環(huán)等多種藥用價(jià)值，臨床廣泛用于治療消化不良、胃痛、痢疾、痔血、咳嗽、糖尿病等多種疾病。除了食用價(jià)值和藥用價(jià)值，研究報(bào)道仙人掌果實(shí)具有抗氧化性，能加速創(chuàng)口愈合，抗衰老，增加皮膚的柔軟度，補(bǔ)充皮膚水分防止皮膚干燥，是保養(yǎng)皮膚的佳品〔2，3〕。本研究分別通過熱水和乙醇提取千年草的皮、莖和籽，探究各種千年草仙人掌提取物體外抗氧化作用，及細(xì)胞內(nèi)清除活性氧(ROS)作用，對(duì)細(xì)胞的增殖作用，對(duì)膠原蛋白合成的影響。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 千年草仙人掌、1，1二苯基-2三硝基苯肼(DPPH)、偶氮二異丁脒鹽酸鹽(AAPH)購自Sigma 公司；人皮膚成纖維細(xì)胞系 HSAS1購自繼和生物科技，其余化學(xué)試劑均為分析純。電子天平購自上海精密儀器儀表有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；RE-5299(2L)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀鞏義市瑞力儀器有限公司；紫外光分光度計(jì)上海棱光技術(shù)有限公司；艾本德 5810R臺(tái)式高速離心機(jī)；超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司。

1.2提取工藝 千年草分為籽、皮和莖三部分，經(jīng)統(tǒng)一干燥，粉碎，過60目篩，得到對(duì)應(yīng)的千年草仙人掌籽、皮、莖粉末。水提液:分別稱千年草仙人掌籽、皮、莖粉末各10 g，分別加入250 ml 65℃熱水，60℃水浴、200W超聲功率浸泡提取1 h，抽慮，重復(fù)上述步驟3次，合并濾液，以3 000 r/min離心10 min，取上清液備用。乙醇提液∶分別稱千年草仙人掌籽、皮、莖粉末各10 g，分別加入250 ml 60%乙醇，60℃水浴、200 W超聲功率浸泡提取1 h，抽慮，重復(fù)上述步驟3次，合并濾液，以3 000 r/min離心10 min，取上清液備用。水提液和乙醇提液分別在60℃下減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)為10 ml，經(jīng)冷凍干燥分別得到籽、皮和莖的干燥粉末。

1.3DPPH清除活性〔4〕在96孔板中依次加入不同濃度的千年草熱水提物和乙醇提物100 μl和DPPH溶液，避光放置孵育30 min后，在517 nm波長處測(cè)定其吸光度(A1)。以等體積蒸餾水替代DPPH溶液，按上述步驟操作，測(cè)定吸光度值A(chǔ)2。以等體積的95%乙醇代替樣品溶液作為空白對(duì)照，按上述步驟操作，測(cè)定吸光度(A3)。以Vit C(VC)為陽性對(duì)照，DPPH自由基清除率(%)=〔1-(A1-A2)/A3〕×100%，計(jì)算半抑制濃度IC50。

1.42，2聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)清除活性〔5〕在96孔板中依次加入不同濃度的千年草水提物和醇提物250 μl和ABTS溶液50 μl，避光放置孵育6 min后，在734 nm波長處測(cè)定其吸光度(A3)。以等體積蒸餾水替代ABTS溶液，按上述步驟操作，測(cè)定吸光度值A(chǔ)4。以等體積的95%乙醇代替樣品溶液作為空白對(duì)照，按上述步驟操作，測(cè)定吸光度(A5)。以VC為陽性對(duì)照，ABTS自由基清除率(%)=〔1-(A3-A4)/A5〕×100%，計(jì)算半抑制濃度IC50。

1.5人皮膚成纖維細(xì)胞培養(yǎng) 將復(fù)蘇后的人皮膚成纖維細(xì)胞置于含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，每2 d更換1次培養(yǎng)液，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期。

1.6千年草提取物細(xì)胞內(nèi) ROS清除活性將傳代培養(yǎng)至第48代的人皮膚成纖維細(xì)胞配制成5×104個(gè)/ml的細(xì)胞懸浮液，于96孔培養(yǎng)板接種，培養(yǎng)24 h 后分別使用不同濃度的偶氮二異丁脹鹽酸鹽(AAPH)溶液處理2、4、6、8 h，采用2′，7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯 (DCFHDA)試劑盒測(cè)定 ROS活性氧清除能力，所有操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行，確定AAPH最佳造模濃度和處理時(shí)間。以最佳的AAPH濃度和造模時(shí)間為模型，37℃5%CO2培養(yǎng)，在細(xì)胞貼壁培養(yǎng)24 h后分別加入1、10、50、100 μg/ml濃度的熱水提物和乙醇提物培養(yǎng)1 h(對(duì)照組加入等體積血清)后，加入最佳AAPH造模濃度進(jìn)行最佳處理時(shí)間處理，處理完畢后，除去AAPH，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，再加入新鮮無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至16 h，使用2 μl DCFHDA熒光探針試劑盒進(jìn)行ROS活性氧清除能力檢測(cè)，使用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)拍照，激發(fā)波長為485 nm，發(fā)射波長為530 nm。

1.7千年草提取物的細(xì)胞增殖作用 配置1.6中細(xì)胞懸浮液于96孔培養(yǎng)板接種，待細(xì)胞貼壁生長24 h后分別加入1、10、50、100 μg/ml濃度的水提物和醇提物，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)平行樣，對(duì)照組加入等體積空白血清，37℃ 5%CO2培養(yǎng)72 h，用PBS沖洗，再加入2 mg/ml的噻唑藍(lán)(MTT)溶液30 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，除去上清液，加入150 μl DMSO，充分震蕩，于570 nm波長下測(cè)定其吸光度值，與空白對(duì)照比較，計(jì)算細(xì)胞增殖率。

1.8千年草提取物對(duì)膠原蛋白合成的影響 將2 ml培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的人皮膚成纖維細(xì)胞以3×105個(gè)/ml濃度植入帶有蓋玻片的培養(yǎng)版中，蓋玻片在培養(yǎng)前經(jīng)多聚賴氨酸處理，用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后，分別加入1、10、50、100 μg/ml濃度的千年草熱水提物和乙醇提物，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)平行樣，對(duì)照組加入等體積血清，培養(yǎng)7 d后，使用 PBS緩沖液清洗蓋玻片，然后用5%丙酮固定，使用H2O2去除過氧化物酶，加入一抗，37℃下孵育2 h，加入二抗，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，采用蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，中性樹膠封固。使用光學(xué)顯微鏡觀察，以棕黃色為陽性，每張蓋玻片隨機(jī)選擇10個(gè)視野進(jìn)行觀察，通過LEICAQ軟件進(jìn)行灰度分析，觀察Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)，灰度值越低表示Ⅰ型膠原蛋白含量越高。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)、單因素方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1DPPH、ABTS清除活性 千年草籽、皮、莖的熱水提取物和乙醇提取物的DPPH、ABTS清除率均隨著濃度的增加而升高(P<0.05)。千年草提取物的DPPH、ABTS清除率均明顯低于同等濃度的陽性對(duì)照組(P<0.05)。見表1、表2。千年草各部分提取物的DPPHIC50、 ABTS IC50值均明顯高于陽性對(duì)照組(均P<0.05),千年草各部分提取物中，千年草籽乙醇提取物的DPPH、ABTS清除能力最強(qiáng)，見表3。

表1 千年草不同提取物及陽性對(duì)照組的DPPH清除率

表2 千年草不同提取物及陽性對(duì)照組的ABTS清除率

表3 千年草提取物 DPPH、ABTS清除活性

2.2千年草提取物細(xì)胞內(nèi)ROS清除活性 隨著千年草提取物濃度的升高人皮膚成纖維細(xì)胞ROS活性逐漸被抑制，其中，50 μg/ml，100 μg/ml 濃度的千年草籽乙醇提取物的ROS清除活性最強(qiáng)，見表4。

2.3千年草提取物的細(xì)胞增殖作用 隨著千年草提取物濃度的升高人皮膚成纖維細(xì)胞的增殖率逐漸升高，與1 μg/ml千年草熱水提取物和乙醇提取物相比，10 μg/ml以上濃度的對(duì)應(yīng)部分的千年草提取物能夠使人皮膚成纖維細(xì)胞的增殖率顯著上升(P<0.05)，且100 μg/ml千年草籽的乙醇提取物和熱水提取物的促進(jìn)作用最強(qiáng)，見表4。

表4 千年草提取物對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞ROS清除活性的影響

2.4千年草提取物對(duì)膠原蛋白合成的影響 隨著千年草提取物濃度的升高人皮膚成纖維細(xì)胞膠原蛋白合成率逐漸增強(qiáng)(P<0.05)，其中，濃度為50 μg/ml的千年草籽熱水提取物膠原蛋白合成率最高，見表5。

表5 千年草提取物對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞膠原蛋白合成率的影響

3 討 論

仙人掌含有多種多糖、生物堿、黃酮類、化黃酮合物、皂苷、蔽類等活性成分〔6〕，本研究分別采用熱水浸提和乙醇浸提，提取物主要成分可能為粗多糖、多酚類、黃酮類物質(zhì)，這類物質(zhì)均具有良好的抗氧化活性。國內(nèi)常見的米邦塔、仙巴掌、梨果仙人掌、量天和仙人掌都具有良好的清除自由基能力，文獻(xiàn)報(bào)道這4種仙人掌的羥自由基清除活性低于蘆丁〔7〕。本研究發(fā)現(xiàn)千年草提取物均具有清除DPPH、ABTS自由基活性，但其活性弱于同濃度的VC，各種提取物中，千年草籽乙醇提物的清除 DPPH、ABTS 自由基能力最強(qiáng)，IC50濃度最低。ROS 是一種強(qiáng)氧化劑，是細(xì)胞內(nèi)代謝后的有害產(chǎn)物，活性氧包括氧自由基、丙二醛等，可以對(duì)脂質(zhì)造成過氧化，損害細(xì)胞的脂質(zhì)雙分子層，加速細(xì)胞衰老，損害細(xì)胞功能，過量的ROS會(huì)損害膠原蛋白，引起皮膚松弛、產(chǎn)生皺紋，過量的ROS還會(huì)引起機(jī)體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)過度，引起多種疾病〔8〕。本研究結(jié)果表明千年草熱水提取物和乙醇提取物對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞 ROS活性均具有抑制作用，其中千年草籽乙醇提取物的ROS抑制作用最強(qiáng)，說明千年草仙人掌具有一定的抗氧化、清除自由基能力，這與Cho等〔9〕報(bào)道有相似之處。但對(duì)于其發(fā)揮抗氧化清除自由基的具體有效成分還需進(jìn)一步研究。

皮膚衰老和皮膚受損后的修復(fù)是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過程，成纖維細(xì)胞能夠合成I型膠原蛋白活性，是重要的修復(fù)細(xì)胞之一。皮膚修復(fù)的生物過程通常是由成纖維細(xì)胞的增殖分化來完成的，人皮膚成纖維細(xì)胞是研究膠原蛋白、皮膚衰老的常用細(xì)胞模型〔10〕。研究認(rèn)為人皮膚成纖維細(xì)胞的膠原蛋白分泌量在1 w左右達(dá)到峰值〔11〕。本研究發(fā)現(xiàn)千年草提取物在10 μg/ml以上時(shí)對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞增殖均有一定的促進(jìn)作用，且隨著濃度增加，其促進(jìn)作用增強(qiáng)，同一濃度的不同提取方法及不同部位千年草提取物對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞的增殖作用無顯著差異，說明千年草提取物無明顯細(xì)胞毒性，且對(duì)Ⅰ型膠原蛋白的合成具有促進(jìn)作用，隨著濃度增加，促進(jìn)作用增強(qiáng)，濃度為50 μg/ml的千年草籽熱水提取物膠原蛋白增加率最高。牟麗秋等〔12〕采用杜仲提取液與MC3T3-EI成骨細(xì)胞在體外進(jìn)行共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)杜仲提取液具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化的作用，認(rèn)為京尼平苷和綠原酸是促進(jìn)其增殖的主要有效成分，京尼平苷和桃葉珊瑚苷是促進(jìn)大鼠膠原蛋白合成的有效成分。ROS會(huì)促進(jìn)膠原蛋白凋亡，引起細(xì)胞損傷，千年草提取物具有清除ROS活性，這可能是其對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞的增殖作用及對(duì)Ⅰ型膠原蛋白活性的促進(jìn)作用、抗衰老的原因之一