薛偉 康少英 郭洪生 王培霞 王振興 高慶亮 李巖 張英民 王華軍 鄭小飛

1邯鄲市中心醫(yī)院骨三科（河北邯鄲056001）；2暨南大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨關(guān)節(jié)與運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)中心（廣州510630）

骨巨細(xì)胞瘤（giant cell tumor of bone，GCTB）是原發(fā)骨腫瘤，臨床上較為常見，約占全部骨腫瘤的6%［1］。多見于20～40 歲青年人群，好發(fā)于四肢長骨［2］。骨巨細(xì)胞瘤具有極強(qiáng)的侵襲能力，產(chǎn)生嚴(yán)重的溶骨性骨破壞［3］。溶骨性骨破壞引起嚴(yán)重骨痛并可導(dǎo)致病理性骨折，嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量［4］?；|(zhì)細(xì)胞（spindle-like stromal cells of GCTB，GCGSC）被認(rèn)為是骨巨細(xì)胞瘤中唯一具有無限增殖能力的腫瘤成分細(xì)胞，在溶骨性骨破壞和腫瘤異常增殖過程中起關(guān)鍵作用［5］。長鏈非編碼RNA（LncRNA）不僅在多種腫瘤中發(fā)揮重要作用［6］，而且對骨生長、分化等功能也有調(diào)節(jié)作用［7］。研究表明LncRNA MALAT1 通過多種信號通路調(diào)節(jié)骨肉瘤發(fā)生發(fā)展［8-11］，可能是骨肉瘤的治療靶點(diǎn)之一［12］。然而MALAT1 對于骨巨細(xì)胞瘤的調(diào)控作用未知。另一方面，MALAT1 作為miRNA（微小核糖核酸）海綿（microRNA sponge），競爭miRNAs 結(jié)合區(qū)域，使得miRNA 無法與下游靶基因結(jié)合，從而抑制miRNA 的功能，影響蛋白質(zhì)編碼轉(zhuǎn)錄［13］。因此，闡明MALAT1 對骨巨細(xì)胞瘤的作用，明確其海綿的靶miRNA，可以為臨床治療骨巨細(xì)胞瘤提供理論基礎(chǔ)和治療靶點(diǎn)，具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源選取2017年1月到2019年6月在邯鄲市中心醫(yī)院就診的3 例骨巨細(xì)胞瘤患者術(shù)后樣本，均經(jīng)病理切片確診，并取同一患者未有腫瘤侵襲的松質(zhì)骨組織（癌旁組織）作為對照樣本。取樣符合本單位的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)并得到了批準(zhǔn)，且取樣獲得患者或家屬的知情同意。

1.2 體外培養(yǎng)原代骨巨細(xì)胞瘤細(xì)胞系取骨巨細(xì)胞瘤腫瘤組織，PBS 沖洗后剪碎，置于含20%胎牛血清的高糖DMEM 培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h 后半量換液，觀察細(xì)胞生長狀況。細(xì)胞經(jīng)過8 次傳代后可獲得純度較大的基質(zhì)細(xì)胞［14］，凍存一批備用（Stromal cells，圖1）。建系成功后的骨巨細(xì)胞瘤細(xì)胞培養(yǎng)于96 孔板，6 孔板進(jìn)行相應(yīng)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。

圖1 體外培養(yǎng)的骨巨細(xì)胞瘤基質(zhì)細(xì)胞典型形態(tài)（200×）Fig.1 Presentative images of cultured stromal cells of giant cell tumor of bone（200×）

1.3 MTT 檢測細(xì)胞增殖復(fù)蘇培養(yǎng)骨巨細(xì)胞瘤基質(zhì)細(xì)胞以5 × 105∕mL 的密度接種于96 孔板。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)結(jié)束后每孔添加20 μL 的MTT∕PMS 混合液（購于碧云天公司），按試劑盒說明書進(jìn)行相應(yīng)處理，再次培養(yǎng)2 h，最后用酶標(biāo)儀在490 nm波長下對樣本進(jìn)行定量檢測。計(jì)算細(xì)胞增殖生長速度。

1.4 qPCR 檢測lncRNA 及miRNA 水平骨巨細(xì)胞瘤組織或細(xì)胞于液氮下研磨，加入TRIZOL（購自Invitrogen）裂解細(xì)胞，按常規(guī)步驟提取總RNA。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TAKARA 公司（日本），按照試劑盒操作程序進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，-80 ℃保存?zhèn)溆?。為檢測lncRNA MALAT1 及miR-30 表達(dá)水平，參照文獻(xiàn)合成對應(yīng)的探針引物進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR 反應(yīng)（ABI Taqman lnc∕miRNA RT 試劑盒）。反應(yīng)體系：初始95 ℃10 min；95 ℃30 s，解鏈；58 ℃30 s 退火；70 ℃10 s 延伸，設(shè)置30 個(gè)循環(huán)；70 ℃10 min后-80 ℃保存。以內(nèi)參為對照，取三復(fù)孔進(jìn)行平均，對照組設(shè)為100%，對實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行相對定量。

1.5 熒光素酶報(bào)道基因設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增lncRNA MALAT1 的3′UTR 區(qū)序列，將其克隆到PGL3 basic載體，構(gòu)建PGL3-MALAT1-WT 質(zhì)粒；設(shè)計(jì)相應(yīng)的MALAT1 突變 質(zhì)粒，構(gòu)建PGL3-MALAT1-MUT 質(zhì)粒。GenePharm 吉瑪公司合成miR-30 的mimic 及inhibitor 片段，在293 細(xì)胞轉(zhuǎn)染相應(yīng)的質(zhì)粒及miR-30 片段。48 h 后裂解細(xì)胞，檢測熒光素酶活性。

1.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與Transwell細(xì)胞遷移和侵襲基質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞融合至50%，采用Lipofectamine 2000 試劑盒 轉(zhuǎn) 染MALAT1 質(zhì) 粒 和∕或miR-30 mimic∕inhibitor片段（由GenePharm 吉瑪公司合成）。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，收集各組處理細(xì)胞，用100 μL 無血清重懸轉(zhuǎn)入Transwell 小室，進(jìn)行遷移和侵襲（鋪Matrigel 膠），在37 ℃，5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育24 h 后取出小室，4%多聚甲醛固定20 min，PBS 洗滌1 次，結(jié)晶紫染色10 min，PBS 洗干凈，并于顯微鏡下觀察細(xì)胞是否穿透小孔，并進(jìn)行拍照，200×光鏡選取5 個(gè)視野計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞個(gè)數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MALAT1 及miR-30 在骨巨細(xì)胞瘤組織中的表達(dá)情況通過實(shí)時(shí)定量qPCR 技術(shù)，對臨床收集的3 例骨巨細(xì)胞瘤組織及松質(zhì)骨對照組織進(jìn)行MALAT1 及miR-30 表達(dá)水平的檢測。結(jié)果表明，與對照組相比，miR-30在骨巨細(xì)胞瘤組織中的表達(dá)水平顯著升高［（1.032±0.064）vs.（2.135±0.240），P＜0.05］，而MALAT1 的水平則顯著減低［（1.086±0.119）vs.（0.630±0.100），P＜0.05］。見圖2。

圖2 實(shí)時(shí)定量PCR 檢測骨巨細(xì)胞瘤組織中miR-30 及MALAT1 表達(dá)情況Fig.2 The levels of miR-30 and MALAT1 in GCTB tissues were detected by quantitative PCR

2.2 熒光素酶報(bào)道基因檢測MALAT1 靶向吸附miR-30 的情況生物信息學(xué)工具ENCORI 分析發(fā)現(xiàn)，MALAT1 的chr11：65267543-65267564 區(qū)域有miR-30的結(jié)合位點(diǎn)，提示MALAT1可能是miR-30的靶基因。構(gòu)建包含miR-30 靶向的MALAT1 3′UTR區(qū)域的熒光素酶報(bào)道基因（MALAT1 WT）及相應(yīng)的突變（MALAT1 MUT）質(zhì)粒，合成miR-30 mimic 相似物。見圖3A。

熒光素酶報(bào)道基因?qū)嶒?yàn)的結(jié)果表明，過表達(dá)MALALT1 WT 和miR-30 片段后，熒光素酶報(bào)道的熒光信號明顯減弱［（1.012 ± 0.126）vs.（0.479 ±0.062），P＜0.05］。過表達(dá)miR-30 mimic 相似物對突變質(zhì)粒的熒光信號不產(chǎn)生影響。結(jié)果說明miR-30 及MALAT1 有直接調(diào)控關(guān)系。見圖3B。

圖3 MALAT1 表達(dá)對miR-30 的影響Fig.3 The influence of MALAT1 expression on miR-30

2.3 MALAT1、miR-30單獨(dú)對骨巨細(xì)胞瘤基質(zhì)細(xì)胞生長及遷移侵襲的調(diào)控通過MTT實(shí)驗(yàn)及Transwell實(shí)驗(yàn)觀察過表達(dá)MALAT1 及抑制miR-30 對細(xì)胞的生長、遷移和侵襲的影響。過表達(dá)MALAT1之后，基質(zhì)細(xì)胞生長明顯被抑制，其生長曲線變得平緩；而且Transwell 的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，過表達(dá)MALAT1 后，細(xì)胞的遷移和侵襲能力顯著下降（P＜0.05）。見圖4A-C。過表達(dá)miR-30 inhibitor抑制物之后，基質(zhì)細(xì)胞的生長（圖4D）、遷移（P＜0.05，圖4E）和侵襲（P＜0.05，圖4F）能力也同樣受到抑制。

圖4 MALAT1、miR-30 對骨巨細(xì)胞瘤基質(zhì)細(xì)胞生長、遷移和侵襲的影響Fig.4 The role of MALAT1 and miR-30 on the growth，migration and invasion of stromal cells

2.4 MALAT1 通過miR-30 對骨巨細(xì)胞瘤基質(zhì)細(xì)胞生長及遷移侵襲的調(diào)控上下游拮抗實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5。過表達(dá)miR-30 mimic 類似物可顯著促進(jìn)細(xì)胞的生長，而如果同時(shí)過表達(dá)MALAT1 則可以抵消miR-30 mimic 類似物的促進(jìn)作用（圖5A）；同樣的，過表達(dá)miR-30 mimic 類似物會促進(jìn)細(xì)胞的遷移和侵襲，而同時(shí)過表達(dá)MALAT1 則可抑制miR-30 mimic 類似物的促進(jìn)作用（圖5B-E）。

圖5 MALAT1 通過miR-30 發(fā)揮調(diào)控骨巨細(xì)胞瘤基質(zhì)細(xì)胞生長、遷移和侵襲的作用Fig.5 MALAT1 regulate miR-30 to affect the growth，migration and invasion of stromal cells

3 討論

骨巨細(xì)胞瘤是一種局部侵襲性溶骨性腫瘤，可引起嚴(yán)重的骨破壞［15］。骨巨細(xì)胞瘤一般為良性腫瘤，但具有惡變成為惡性的骨巨細(xì)胞瘤的傾向［16］。外科手術(shù)治療后，27%～65%的骨巨細(xì)胞瘤患者表現(xiàn)出局部復(fù)發(fā)［17］，并且高達(dá)6%的骨巨細(xì)胞瘤發(fā)生肺轉(zhuǎn)移［18-19］。眾多的文獻(xiàn)主要集中在探討骨巨細(xì)胞瘤發(fā)生的原因及危險(xiǎn)因素，而對具體的生理病理機(jī)制缺乏深入了解?；|(zhì)細(xì)胞是骨巨細(xì)胞瘤遷移和侵襲的主要細(xì)胞成分，研究調(diào)控基質(zhì)細(xì)胞分化、遷移和侵襲的機(jī)制，有助于為臨床治療骨巨細(xì)胞瘤提供新的思路和理論依據(jù)。本研究發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA MALAT1 在骨巨細(xì)胞瘤組織中低表達(dá)而微小RNA miR-30 則高表達(dá)，而進(jìn)一步通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)MALAT1 存在吸附抑制miR-30的靶向序列，且通過熒光素酶報(bào)道基因及突變實(shí)驗(yàn)證明了MALAT1 可靶向調(diào)控miR-30；單獨(dú)過表達(dá)MALAT1 或者抑制miR-30 均可抑制骨巨細(xì)胞瘤基質(zhì)細(xì)胞生長遷移和侵襲；而且MALAT1 是通過miR-30 調(diào)控骨巨細(xì)胞瘤發(fā)展發(fā)揮作用。因此，MALAT1∕miR-30 信號通路是介導(dǎo)骨巨細(xì)胞瘤基質(zhì)細(xì)胞生長的關(guān)鍵通路。

骨巨細(xì)胞瘤是骨破壞腫瘤，因此抑制骨吸收是降低骨巨細(xì)胞瘤復(fù)發(fā)的有效治療策略［20］。研究表明，雙膦酸鹽具有抗骨溶解的保護(hù)作用，可廣泛用于骨巨細(xì)胞瘤的臨床治療中［21-22］。然而，長期服用雙膦酸鹽可能導(dǎo)致長骨骨骼壞死和非典型性骨折［23］。地諾單抗（Denosumab）是一種針對RANKL的單克隆抗體，最近已被批準(zhǔn)用于骨轉(zhuǎn)移治療，對雙膦酸鹽難治性惡性高鈣血癥和某些巨細(xì)胞瘤發(fā)揮作用［24-25］。地諾單抗由于其抗吸收作用，骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志立即下降，但骨堿性磷酸酶注射后1 個(gè)月才下降［26-27］。因此，RANK∕RANKL 及其下游分子的受體激活劑的治療途徑可能代表治療骨巨細(xì)胞瘤的靶點(diǎn)。RunX2 在多種腫瘤中被報(bào)道與RANK∕RANKL信號密切相關(guān)［28-29］，且RANK∕RANKL∕RunX2 信號通路與成骨破骨細(xì)胞的功能調(diào)節(jié)密切相關(guān)［30-31］。有文獻(xiàn)報(bào)道，miR-30a 可以通過與其3′-UTR 結(jié)合來調(diào)節(jié)RunX2 的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的分化并促進(jìn)骨巨細(xì)胞瘤中的骨生成［32］。本研究結(jié)果顯示，miR-30 參與調(diào)控骨巨細(xì)胞瘤，而且MALAT1 可直接靶向調(diào)控miR-30。

LncRNA 屬于長鏈非編碼RNA，有很強(qiáng)的組織和細(xì)胞特異性，與多種疾病特別是骨科疾病，如骨關(guān)節(jié)炎、骨肉瘤等疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［7］。LncRNA 可通過相互作用位點(diǎn)與下游靶miRNA 競爭性相互作用，成為miRNA 的“分子海綿”，吸附性抑制miRNA 使其不能發(fā)揮作用。MALAT1 與骨科疾病的關(guān)系密切相關(guān)，有報(bào)道MALAT1 通過靶向人骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞中的miRNA-143 來促進(jìn)osterix 表達(dá)以調(diào)節(jié)成骨分化［33］。MALAT1 可調(diào)節(jié)肺癌的骨轉(zhuǎn)移［34］。MALAT1 上調(diào)的ZEB-1 可被β-catenin 協(xié)調(diào)，增強(qiáng)HGF 介導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化的端粒酶活性［35］。骨巨細(xì)胞瘤可惡化為骨肉瘤，MALAT1 可調(diào)控骨肉瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展［36］。本研究結(jié)果表明，MALAT1 在骨巨細(xì)胞瘤中下調(diào)，低表達(dá)的MALAT1 不能很好的靶向吸附性抑制miR-30，從而使得骨巨細(xì)胞瘤基質(zhì)細(xì)胞生長。

miRNA 被報(bào)道參與骨巨細(xì)胞瘤發(fā)生發(fā)展的多個(gè)環(huán)節(jié)的調(diào)控［37］。據(jù)報(bào)道，miR-126-5p 在骨巨細(xì)胞瘤的紡錘狀基質(zhì)細(xì)胞中顯著下調(diào)，并通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶13（MMP-13）的表達(dá)影響破骨細(xì)胞的分化和骨吸收［38］。最近的一項(xiàng)研究還表明，miRNA-106b 通過靶向骨巨細(xì)胞瘤中的RANKL 來抑制破骨細(xì)胞生成和骨溶解［21］。miRNA 可能會調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的產(chǎn)生和功能［39］。而miR-16-5p 抑制了BMM 中的破骨細(xì)胞生成［40］。本研究表明，miR-30 參與了骨巨細(xì)胞瘤基質(zhì)細(xì)胞的分化，因此是調(diào)控骨巨細(xì)胞瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素。這為miR-30作為靶點(diǎn)提供了深入的證據(jù)。骨巨細(xì)胞瘤發(fā)生發(fā)展過程中，除了miR-30 外，肯定還有其他miRNA的參與，且除了RunX2 的下游基因外，其他基因的參與也需要進(jìn)一步明確。所以本研究也有一定的局限性，大范圍多樣本的高通量測序研究可進(jìn)一步揭示非編碼及微小RNA 在骨巨細(xì)胞瘤中的作用；其下游底物也需要進(jìn)一步明確，比如是否通過RunX2 發(fā)揮作用；而動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也需要進(jìn)一步驗(yàn)證MALAT1∕miR-30 通路是否可調(diào)節(jié)骨巨細(xì)胞瘤的肺轉(zhuǎn)移。

總之，本研究表明LncRNA MALAT1 及miR-30在骨巨細(xì)胞瘤中表達(dá)水平有異常，MALAT1 可直接海綿吸附抑制miR-30 從而調(diào)節(jié)骨巨細(xì)胞瘤基質(zhì)細(xì)胞的生長、遷移和侵襲。