陳雙雙，齊香玉，馮 景，陳慧杰，王華娣,2,秦紫藝,3，鄧衍明,2,3

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 休閑農(nóng)業(yè)研究所，江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點實驗室，江蘇 南京 210014；2.江蘇大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，江蘇 南京 210014)

繡球(Hydrangea macrophylla)又名八仙花、紫陽花等，為虎耳草科繡球?qū)僦参?。其花序密集且生于花枝頂部，花色豐富，觀賞價值極高，廣泛應(yīng)用于園林綠化、庭院美化、盆栽等領(lǐng)域；此外，繡球?qū)ν寥浪釅A度非常敏感，可作為測定土壤酸堿度的指示植物，具有很好的生態(tài)價值[1-2]。繡球還有較強的鋁耐受和積累能力，部分繡球品種花色可通過調(diào)節(jié)土壤酸堿度和Al3+含量使萼片呈現(xiàn)藍色[3-4]。大量研究表明，Al3+在繡球花色由紅變藍過程中起著重要作用；在萼片中，Al3+的積累主要通過鋁離子轉(zhuǎn)運蛋白來實現(xiàn)，如質(zhì)膜鋁轉(zhuǎn)運基因(Plasmamembrane Al transporter，PALT)、液泡膜鋁轉(zhuǎn)運基因(Vacuolar Al transporter，VALT)等[5-8]。因此，了解關(guān)鍵基因的表達方式將有助于闡明繡球花色變化過程中所涉及的分子機制。

實時熒光定量PCR(qRT-PCR)是檢測和定量基因轉(zhuǎn)錄水平表達模式的重要技術(shù)之一，具有高度的敏感性、特異性、可重復(fù)性和準確性；該技術(shù)還是當前檢測低拷貝數(shù)目的基因轉(zhuǎn)錄水平的唯一方法[9-10]。RNA穩(wěn)定性、質(zhì)量、反轉(zhuǎn)錄效率、PCR擴增效率以及樣本之間的差異，都會導(dǎo)致基因表達結(jié)果分析的差異[9,11]。因此，表達穩(wěn)定的內(nèi)參基因?qū)τ谀康幕虮磉_水平的標準化分析至關(guān)重要。最常用的內(nèi)參基因包括α-肌動蛋白基因(α-actin gene，ACT)、3-磷酸甘油醛脫氫酶基因(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene，GAPDH)、18S核糖體RNA基因(18S ribosomal RNA gene，18S)、多聚泛素基因(Polyubiquitin gene，UBQ)、泛素結(jié)合酶基因(Ubiquitin conjugating enzyme gene，UBC)、環(huán)葉素基因(Cyclophylin gene，CYC)、延伸因子基因(Elongation factor-1α gene，EF-1α)、維管蛋白基因(Tubulin gene，TUB)等。關(guān)于繡球鋁轉(zhuǎn)運蛋白基因(PALT、VALT、NRAT等)表達分析中，已有研究使用18S作為qRT-PCR的內(nèi)參基因[6-8,12-13]，但對于18S以及其他常用的內(nèi)參基因如ACT、EF-1α、TUB等在繡球中穩(wěn)定性的表達分析尚未見報道。為了獲得準確的基因表達數(shù)據(jù)，有必要為繡球選擇合適的內(nèi)參基因并驗證其在特定試驗條件下的穩(wěn)定性。

本研究根據(jù)繡球轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選出10個候選內(nèi)參基因[14]，分別是ACT7、β-TUB、EF-1α、18S、UBC23、DnaJ(伴侶蛋白基因)、VPS33(液泡蛋白分選相關(guān)蛋白基因)、TMN12(跨膜超家族成員基因)、UPL7(E3泛素蛋白連接酶基因)、UBP15(泛素羧基末端水解酶基因)，利用geNorm[15]、NormFinder[16]、BestKeeper[17]、ΔCt[18]以及RefFinder[19]5種計算方法來分析他們在不同組織及Al2(SO4)3處理下的表達穩(wěn)定性。同時，以繡球鋁轉(zhuǎn)運蛋白基因HmVALT作為目的基因進行表達模式標準化分析，以進一步驗證內(nèi)參基因的可靠性。本研究為進一步探索繡球基因表達分析提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料大花繡球Bailer(商品名：Endless SummerTM，中文名譯為無盡夏，Al2(SO4)3處理后花色可由紅色變?yōu)樗{色，為鋁敏感品種)和Ruby(中文名譯為紅寶石，Al2(SO4)3處理后保持紅色不變，為不敏感品種)種植于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院繡球種質(zhì)資源圃內(nèi)。選取長勢健壯、無病蟲害的植株進行處理，對照組：澆灌不添加Al2(SO4)3的Hoagland營養(yǎng)液(pH 值6.0)，Al2(SO4)3處理組：澆灌添加20 mmol/L Al2(SO4)3的Hoagland營養(yǎng)液(pH值 3.0)，每7 d澆灌1次，每個處理15盆，每個處理設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)。Bailer花色變化后(約21 d)，分別取2個品種對照組與處理組的根、葉、萼片(繡球的觀賞器官主要是萼片)于液氮中速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 總RNA提取與cDNA合成

取樣品約1 g于液氮中研磨成粉末，采用RN38 EASYspin plus Plant RNA kit (艾德萊)進行總RNA提取，具體操作方法參考說明書進行。利用Nanadrop-1000和1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA濃度、純度和完整性。cDNA 第一鏈合成采用PrimeScriptTMRT Master Mix(TaKaRa)反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行，反應(yīng)體系及反應(yīng)條件參考說明書。反應(yīng)產(chǎn)物cDNA保存于-20 ℃。

1.3 候選內(nèi)參基因選擇與引物設(shè)計

根據(jù)文獻結(jié)合繡球轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選出10個表達量穩(wěn)定的候選內(nèi)參基因，包括5個傳統(tǒng)內(nèi)參基因(ACT7、β-TUB、EF-1α、18S、UBC23)及5個新內(nèi)參基因(DnaJ、VPS33、TMN12、UPL7、UBP15)，同時，選取液泡膜鋁轉(zhuǎn)運蛋白基因(HmVALT)作為鑒定篩選內(nèi)參基因可靠性的目標基因(表1)。利用在線引物設(shè)計程序Primer 3 plus(http://primer3plus.com/primer3web/primer3web_input.htm)設(shè)計qPCR引物。參數(shù)設(shè)置如下：Tm值為58～62 ℃，GC含量為45%～60%，產(chǎn)物長度為150～250 bp。引物由南京思普金生物科技有限公司合成(表1)。

表1 繡球候選內(nèi)參基因相關(guān)信息Tab.1 The primers information of the candidate reference genes and target genes in Hydrangea macrophylla

1.4 qRT-PCR

qRT-PCR反應(yīng)在Real time PCR System 7500上進行。反應(yīng)體系20 μL：cDNA模板2.0 μL，TB Green Premix Ex Taq(Tli RNaseH Plus)(2×)10 μL，引物(10 μmol/L)各0.4 μL，ROX Reference Dye(50×)0.4 μL，ddH2O 6.8 μL。實時熒光定量PCR反應(yīng)程序如下：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火34 s，40個循環(huán)；40個PCR循環(huán)后，通過熔解曲線分析(60～95 ℃)驗證擴增產(chǎn)物的特異性。

1.5 候選內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性分析

將各樣品cDNA混合模板依次稀釋5個梯度，每個梯度稀釋5倍(50，5-1，5-2，5-3，5-4)進行qRT-PCR。根據(jù)qRT-PCR結(jié)果，用Ct值繪制標準曲線并利用公式E=(5-1/slope-1)×100%計算擴增效率。

候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性采用geNorm、NormFinder、BestKeeper和ΔCt 4種程序進行分析評價。其中，最優(yōu)內(nèi)參基因數(shù)量采用geNorm軟件對變異系數(shù)進行分析完成。最后，用在線程序RefFinder(https://localhost/RefFinder-master/index.php)綜合分析候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 候選內(nèi)參基因引物擴增效率分析

采用標準曲線法對各引物擴增效率進行分析，引物的擴增效率為90.9%(TMN12)～102.2%(ACT7)，相關(guān)系數(shù)(Correlation coefficient，R2)變化為0.990 7(18S)～0.999 9(UPL7)(表1)。由此可見，所用引物均具有良好的特異性與擴增效率，可用于后續(xù)分析。

2.2 候選內(nèi)參基因表達豐度分析

將10個候選內(nèi)參基因在不同品種對照組和處理組不同組織的全部Ct值進行匯總，分析它們在轉(zhuǎn)錄水平上的表達豐度的穩(wěn)定性。10個候選內(nèi)參基因的Ct值分布為16～39，其中，18S(16～21)和ACT7(17～23)的表達豐度最高，但存在變異；β-TUB(18～23)的表達豐度也較高，其次是UPL7(21～24)和TMN12(20～26)(圖1)。從Ct值推測，β-TUB和UPL7可作為候選內(nèi)參基因。

2.3 候選內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性分析

2.3.1 geNorm分析 geNorm程序通過計算每個候選內(nèi)參基因在不同樣品中的表達穩(wěn)定性M值來確定其穩(wěn)定性，M值越小表明基因的穩(wěn)定性越高，反之則越低。geNorm程序通常會將穩(wěn)定性M值低于1.5的候選基因作為內(nèi)參基因。geNorm分析結(jié)果顯示，在所有樣本、不同組織、Bailer、Ruby中10個內(nèi)參基因的M值均小于1.5，表明這些候選內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性較好(圖2)。其中，在繡球不同組織中表達最穩(wěn)定的候選內(nèi)參基因是UPL7和β-TUB；在Al2(SO4)3處理條件下，Ruby中表達最穩(wěn)定的候選內(nèi)參基因同樣是UPL7和β-TUB；而在Al2(SO4)3處理條件下，Bailer中表達最穩(wěn)定的候選內(nèi)參基因為UPL7和ACT7；當綜合考慮所有樣本時，候選內(nèi)參基因UPL7和β-TUB的M值最小，表達穩(wěn)定性最好，而EF-1α穩(wěn)定性最差。

geNorm程序還可通過計算候選內(nèi)參基因的變異系數(shù)(Pairwise variation，Vn/Vn+1)來確定最適的內(nèi)參基因個數(shù)。通常，以0.15作為臨界值來確定參考基因的最佳數(shù)量。geNorm分析結(jié)果顯示，Al2(SO4)3處理條件下，Bailer和Ruby變異系數(shù)V2/V3(0.106，0.113)小于0.15，表明選擇2個內(nèi)參基因即可滿足要求；在繡球不同組織中，變異系數(shù)V2/V3(0.161)高于臨界值0.15，而V3/V4(0.143)小于0.15，表明需要3個內(nèi)參基因(UPL7、β-TUB和VPS33)；而在本研究中考慮所有樣本時，變異系數(shù)V2/V3為0.131，低于0.15(圖3)。因此，可選用2個內(nèi)參基因用于Al2(SO4)3處理條件下繡球?qū)崟r熒光定量PCR標準化分析。

2.3.2 NormFinder分析 NormFinder程序算法與geNorm類似，通過計算內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性M值來評價基因的表達穩(wěn)定性，M值越小則表達穩(wěn)定性越高。NormFinder分析結(jié)果顯示，在Al2(SO4)3處理條件下，Bailer中UPL7(0.154)和β-TUB(0.242)表達最穩(wěn)定，EF-1α(1.536)表達最不穩(wěn)定；Ruby中UBP15(0.154)和β-TUB(0.424)表達最穩(wěn)定，而EF-1α(1.918)表達最不穩(wěn)定；在不同組織中，UBP15(0.274)和β-TUB(0.455)表達最穩(wěn)定，EF-1α(1.977)表達最不穩(wěn)定；在綜合考慮所有樣本時，同樣是UBP15(0.230)和β-TUB(0.343)表達最穩(wěn)定，EF-1α(1.799)表達最不穩(wěn)定(表2)。

表2 NormFinder 表達穩(wěn)定性分析Tab.2 Stability analysis of expression genes assayed by NormFinder

2.3.3 BestKeeper分析 BestKeeper程序是通過比較候選內(nèi)參基因的Ct值所產(chǎn)生的標準偏差(Standard deviation，s)和變異系數(shù)(Coefficient of variation，CV)來評價基因表達穩(wěn)定性，s和CV值越小則穩(wěn)定性越好，反之則穩(wěn)定性越差。BestKeeper程序分析結(jié)果見表3，在Al2(SO4)3處理條件下，Bailer中DnaJ(s=0.36)、18S(s=0.62)、β-TUB(s=0.80)、VPS33(s=0.84)、UPL7(s=0.89)和UBC23(s=0.99)的s值小于1，Ruby中DnaJ(s=0.54)、VPS33(s=0.71)、UBC23(s=0.73)、UPL7(s=0.79)和β-TUB(s=0.91)的s值小于1，說明這些候選內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性較好；在不同組織中，比較穩(wěn)定的候選內(nèi)參基因為DnaJ(s=0.55)、UPL7(s=0.84)、β-TUB(s=0.87)和VPS33(s=0.87)；在所有樣本中，DnaJ(s=0.46)、VPS33(s=0.84)、β-TUB(s=0.87)和UPL7(s=0.88)表達穩(wěn)定性最高，EF-1α(s=2.45)穩(wěn)定性最差(表3)。

表3 BestKeeper 表達穩(wěn)定性分析Tab.3 Expression stability was calculated by BestKeeper

2.3.4 ΔCt分析 ΔCt分析是通過比較候選內(nèi)參基因之間的ΔCt值來評價基因穩(wěn)定性的方法。結(jié)果顯示，在Al2(SO4)3處理條件下，Bailer中UPL7和β-TUB表達最穩(wěn)定，Ruby中UBP15和β-TUB表達最穩(wěn)定；在不同組織中，β-TUB和UBP15的表達穩(wěn)定性最好；在所有樣本中，同樣是β-TUB和UBP15的表達穩(wěn)定性最好，穩(wěn)定性最差的是EF-1α(表4)。

表4 ΔCt表達穩(wěn)定性分析Tab.4 Expression stability was analyzed by ΔCt

2.3.5 RefFinder分析 geNorm、NormFinder、BestKeeper和ΔCt 4種程序根據(jù)候選內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性進行排名，結(jié)果存在差異。因此，利用RefFinder方法來建立候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性的綜合排名。結(jié)果顯示，在所有樣本中，候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性由高到低依次為：β-TUB>UPL7>UBP15>VPS33>18S>DnaJ>TMN12>UBC23>ACT7>EF-1α(表5、圖4)；在不同組織器官中，候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性由高到低依次為：β-TUB>UBP15>UPL7>VPS33>18S>DnaJ>TMN12>UBC23>ACT7>EF-1α(表6、圖4)；在Al2(SO4)3處理條件下，Bailer中候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性由高到低依次為：UPL7>β-TUB>ACT7>18S>VPS33>DnaJ>UBP15>TMN12>UBC23>EF-1α(表7、圖4)，Ruby中候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性由高到低依次為：β-TUB>UBP15>UPL7>VPS33>DnaJ>UBC23>18S>TMN12>ACT7>EF-1α表達最穩(wěn)定(表8、圖4)。

表5 RefFinder 表達穩(wěn)定性分析-所有樣本Tab.5 Stability analysis was calculated by RefFinder-all samples

表6 RefFinder 表達穩(wěn)定性分析-不同組織Tab.6 Stability analysis was calculated by RefFinder-tissues

表7 RefFinder 表達穩(wěn)定性分析-BailerTab.7 Stability analysis was calculated by RefFinder-Bailer

2.4 繡球鋁轉(zhuǎn)運蛋白基因表達分析

為了進一步驗證所篩選出來的候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，以穩(wěn)定性最好的UPL7、β-TUB以及UPL7+β-TUB分別作為內(nèi)參基因，同時以穩(wěn)定性最差的EF-1α作為對照，分析繡球鋁轉(zhuǎn)運蛋白基因HmVALT的表達模式。結(jié)果如圖5所示，以UPL7、β-TUB以及UPL7+β-TUB分別作為內(nèi)參基因，目的基因HmVALT

表8 RefFinder 表達穩(wěn)定性分析-RubyTab.8 Stability analysis was calculated by RefFinder-Ruby

在Bailer處理組根和萼片中表達量最高，且趨勢一致；而在Ruby中，HmVALT在處理組根中表達量最高，表達模式一致。但EF-1α做內(nèi)參基因時HmVALT的表達模式卻有別于二者，而且表達豐度較低。因此UPL7、β-TUB可作為繡球內(nèi)參基因進行功能基因的表達研究。

3 討論與結(jié)論

qRT-PCR因其高靈敏度、特異性強、準確性高和定量范圍廣而廣泛應(yīng)用在基因表達水平分析及基因調(diào)控模式研究中[11]。為了在qRT-PCR分析中獲得可靠、準確的定量結(jié)果，選擇和驗證合適的內(nèi)參基因進行qRT-PCR數(shù)據(jù)分析至關(guān)重要。理想的內(nèi)參基因在不同的發(fā)育階段、不同組織器官以及不同的脅迫條件下都可以穩(wěn)定表達即產(chǎn)生穩(wěn)定的Ct值。本研究通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及文獻參考篩選出10個候選內(nèi)參基因，包括5個傳統(tǒng)內(nèi)參基因(ACT7、β-TUB、EF-1α、18S、UBC23)及5個新內(nèi)參基因(DnaJ、VPS33、TMN12、UPL7、UBP15)，分析其在不同組織、鋁處理條件下實時定量PCR的表達穩(wěn)定性。

通過geNorm、NormFinder、BestKeeper和ΔCt 4種算法，這10個候選內(nèi)參基因在表達穩(wěn)定性方面表現(xiàn)各異，4種算法生產(chǎn)的排名順序也不完全相同。本研究中，DanJ在BestKeeper算法中排序最好，即表達穩(wěn)定性最好，而在geNorm、NormFinder、和ΔCt 3種算法中排序較差；β-TUB、UPL7和UBP15在BestKeeper算法中排序中等，而在其他3種算法中排序較好，表達穩(wěn)定性好。這些結(jié)果與太陽花、劍麻、朱頂紅等的內(nèi)參基因篩選研究結(jié)果類似，這種排序的不同可能是由不同算法的統(tǒng)計計算原理不同所導(dǎo)致[20-22]。RefFinder是一種綜合統(tǒng)計程序，是綜合分析不同軟件得到的結(jié)果進行排名，已被廣泛用于內(nèi)參基因篩選的研究中[20,23-24]?；赗efFinder的綜合分析排名，β-TUB、UPL7和UBP15被認為是繡球中表達穩(wěn)定的內(nèi)參基因。因此，RefFinder綜合分析不同程序獲得的結(jié)果可能會使本研究中候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性排序的準確性更高，這表明應(yīng)選用多個不同的算法對參考基因進行穩(wěn)定性評估。

越來越多的研究表明，常用的內(nèi)參基因在不同的試驗條件、不同組織中穩(wěn)定性的表現(xiàn)不同。如劍麻中，內(nèi)參基因β-TUB4、PP2A-1(Protein phosphates 2 gene，蛋白磷酸基因)和RPⅡ(RNA polymeraseⅡ gene，RNA聚合酶基因)在干旱處理條件下是最穩(wěn)定的，β-TUB4、ARF2(ADP-Ribosylation factor 2 gene，ADP-核糖基化因子2基因)和GAPDH(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene，甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因)在復(fù)水條件下穩(wěn)定性較好，CYC-A、GAPDH和CUL-1(Cullin gene，泛素化連接酶基因)熱處理后穩(wěn)定性較好，CUL-1、WIN-1和ACT11是冷處理條件下穩(wěn)定性較好的內(nèi)參基因，而鹽處理條件下穩(wěn)定性較好的內(nèi)參基因是β-TUB4、RPⅡ和ARF2[21]；大白菜-結(jié)球甘藍易位系經(jīng)生長素IAA處理后，穩(wěn)定性最好的內(nèi)參基因是BcTIP41(Tonop last intrinsic proteins，液泡膜內(nèi)在蛋白基因)和ACTIN，而生長素抑制劑TIBA處理后，UKN1(Hypothetical，假設(shè)蛋白基因)和BcTIP41的穩(wěn)定性較好，UKN1和TUB4在營養(yǎng)生長階段表達最為穩(wěn)定，DnaJ(DnaJ-Like，鋅指蛋白基因)、ACTIN和PP2A是花發(fā)育階段表達較穩(wěn)定的內(nèi)參基因[25]；GAPDH2是朱頂紅不同組織器官中表達穩(wěn)定性較好的內(nèi)參基因[22]。在本研究中，β-TUB、UPL7和UBP15是在不同組織中表達較穩(wěn)定的內(nèi)參基因，而鋁處理條件下，Bailer和Ruby中表達穩(wěn)定性較好的基因分別是UPL7、β-TUB、ACT7和β-TUB、UBP15、UPL7。在非模式植物中，與傳統(tǒng)的內(nèi)參基因相比，一些新基因可能表達出較好的穩(wěn)定性。本研究中，UPL7在繡球中表達相對穩(wěn)定，其次是UBP15。UPL7可通過調(diào)控調(diào)節(jié)蛋白的泛素化過程參與細胞內(nèi)的多種生理過程，參與植物體內(nèi)重要的蛋白降解途徑。在柑橘中，UPL是研究病毒侵染的內(nèi)參基因[26]；海濱雀稗中，UPL、PP2A和EF-1α組合在干旱處理(PEG)的葉片中穩(wěn)定表達，是最適的內(nèi)參基因組合[27]。UBP15屬于泛素特異性加工家族，參與蛋白質(zhì)的降解調(diào)節(jié)。楊樹不定根再生階段，UBP被認為是最佳的內(nèi)參基因[28]；UBP22在受到或未被白線蟲感染的馬鈴薯植株根中均能穩(wěn)定表達[29]。因此，不同物種、不同試驗條件、不同組織中內(nèi)參基因的穩(wěn)定性存在一定差異，在進行目的基因表達分析之前，需對候選內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性進行評價和驗證。

當在特定的試驗條件下，選擇2個或者多個內(nèi)參基因進行目的基因表達量分析時，結(jié)果更加可靠、準確[24-25,30]。geNorm程序可以用于確定穩(wěn)定內(nèi)參基因最佳數(shù)量，以進行準確的基因表達分析。通常，以0.15(Vn/Vn+1)作為臨界值用于計算內(nèi)參基因的最佳組合。本研究中，Al2(SO4)3處理條件下，Bailer和Ruby以及所有樣本的變異系數(shù)(V2/V3)分別為0.106，0.113，0.131均小于0.15，表明在鋁處理條件下，選用2個內(nèi)參基因足以分析目的基因的表達量；而在不同組織的分析中，變異系數(shù)V2/V3為0.161，大于0.15，V3/V4為0.143，可能需要3個內(nèi)參基因才能滿足需求，而導(dǎo)致這種變異的原因可能是材料來源的不同。根據(jù)已有文獻報道，2個穩(wěn)定的內(nèi)參基因足以滿足目的基因表達研究的需求[21-22,25,30]。結(jié)合qRT-PCR Ct值分析，UBP15Ct值相對較高，因此，鋁處理條件下繡球較合適的內(nèi)參基因為β-TUB和UPL7。

通過研究Al2(SO4)3處理條件下鋁轉(zhuǎn)運蛋白HmVALT作為靶基因的表達譜，進一步驗證了鑒定出的最穩(wěn)定(β-TUB和UPL7)和最不穩(wěn)定(EF-1α)的內(nèi)參基因的可靠性。使用最穩(wěn)定的基因做內(nèi)參基因時，目的基因HmVALT的表達豐度較高且表達模式一致，而不穩(wěn)定的EF-1α作內(nèi)參基因時，HmVALT的表達模式出現(xiàn)變化且HmVALT的表達豐度相對降低。這些結(jié)果說明，選擇合適內(nèi)參基因?qū)τ诜治瞿康幕虮磉_變化至關(guān)重要。

本研究基于qRT-PCR對繡球鋁處理條件下的內(nèi)參基因進行了篩選，確定β-TUB和UPL7為最適的內(nèi)參基因。研究結(jié)果為后續(xù)開展繡球功能基因表達分析奠定了理論基礎(chǔ)。