邵玲，吳小利，翟明賀，劉麗文（遼寧省人民醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)科，沈陽110016）

諾卡菌（Nocardia）廣泛存在于土壤、灰塵、腐爛的植被、動(dòng)物糞便沉積物以及水環(huán)境中［1］，并作為一種機(jī)會(huì)致病菌，可引起免疫功能受損患者的感染，尤其是呼吸道感染［2］。目前諾卡菌屬包括100多個(gè)菌種［3］，其中有接近30個(gè)菌種與人類感染有關(guān)，包括膿腫諾卡菌（N.abscessus）、非洲諾卡菌（N.africana）、星形諾卡菌（N.asteroides）、巴西諾卡菌（N.brasiliensis）等［2］。隨著分子鑒定技術(shù)的快速發(fā)展，很多少見或新命名的諾卡菌菌種逐漸被人們發(fā)現(xiàn)。老兵諾卡菌（N.veterana）就是其中之一，該菌于2001年從一位78歲患者的支氣管鏡灌洗液中分離并獲命名［4］。目前全球關(guān)于人類感染老兵諾卡菌的病例報(bào)道已有20多例，而我國僅臺(tái)灣地區(qū)有1例報(bào)道［5］。目前，諾卡菌的鑒定多采用16SrRNA、secA1、hsp65、gyrA和rpoB等基因?yàn)榛A(chǔ)的分子生物學(xué)方法［6］。近年來，隨著質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展以及諾卡菌參考數(shù)據(jù)庫的擴(kuò)增，基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）亦可用于老兵諾卡菌的鑒定。本文報(bào)道從1例診斷為橫紋肌溶解癥患者患肢膝蓋后側(cè)膿性滲出物中分離得到1株老兵諾卡菌，對(duì)該菌的微生物學(xué)特征、鑒定及藥物敏感性進(jìn)行分析，并結(jié)合文獻(xiàn)復(fù)習(xí)，為臨床實(shí)驗(yàn)室檢出該菌提供參考并加強(qiáng)臨床對(duì)于該菌感染的重視。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象及菌株來源 菌株分離自一位55歲男性橫紋肌溶解癥患者患肢膝蓋后側(cè)膿性滲出物，患者合并2型糖尿病并有類固醇激素使用史?；颊呷朐旱?天至第26天膝蓋后側(cè)持續(xù)有膿性滲出物，無臭味，白細(xì)胞計(jì)數(shù)處于持續(xù)升高狀態(tài)，最高可達(dá)17.58×109/L，分別在第2天及第10天取膿性滲出物進(jìn)行一般細(xì)菌培養(yǎng)，檢出老兵諾卡菌。質(zhì)控菌株大腸埃希菌ATCC 35218購自上海寶錄生物公司。

1.2 主要儀器及試劑 LEICA DM750光學(xué)顯微鏡（德國LEICA公司）；microflexTMLRF質(zhì)譜分析儀及CHCA基質(zhì)液（Bruker Daltonics公司）；血瓊脂培養(yǎng)基（中國彥程公司）；革蘭染色液（快速）、抗酸染色液（快速）（珠海貝索公司）；DL-96STAPH試劑盒（珠海迪爾公司）；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（天根公司）；EasyTaq PCR SuperMix聚合酶（北京全式金公司）；磁珠法DNA凝膠回收試劑盒（上海碩美公司）；引物合成由上海生工生物工程公司完成。

1.3 分離菌的培養(yǎng)與形態(tài)觀察 將分離菌株接種在血平板上35℃培養(yǎng)0～120 h，取培養(yǎng)24～120 h菌落制片后革蘭染色觀察；分別取培養(yǎng)48 h菌落制片后，參照快速抗酸染色試劑說明書并略改良進(jìn)行弱抗酸染色：石碳酸復(fù)紅染色10 min，2 mol/L H2SO4分別脫色2 s、10 s、15 s、30 s、45 s、60 s、75 s、90 s，亞甲藍(lán)染色2 min觀察鏡下形態(tài)。重復(fù)2次。

1.4 MALDI-TOF MS鑒定 挑取血平板上培養(yǎng)48 h單個(gè)菌落涂在靶板上，自然干燥后加入1μL 70%甲酸，待完全干燥后，加入1μL CHCA基質(zhì)液，待完全干燥后，置于質(zhì)譜儀上進(jìn)行鑒定并依據(jù)儀器說明書進(jìn)行結(jié)果判讀。

1.5 16SrRNA基因序列分析 收集單個(gè)菌落，按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行DNA提取。參照文獻(xiàn)［7］合成細(xì)菌16SrRNA引物，序列分別為：27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR反應(yīng)體系為30μL：2×EasyTaq PCR SuperMix 15μL，上、下游引物（10μmol/L）各1μL，DNA模板2μL，H2O 11μL。PCR反應(yīng)條件：94℃5 min；94℃30 s，57℃30 s，72℃90 s，25個(gè)循環(huán)；72℃7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)12 g/L瓊脂糖凝膠電泳并采用磁珠法DNA凝膠回收試劑盒對(duì)目的條帶進(jìn)行回收，采用Sanger法在ABI 3730XL設(shè)備上進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司完成。測(cè)序后將序列和GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對(duì)。并下載與待測(cè)菌相似度大于98.0%的菌種的各個(gè)基因序列，其中每個(gè)菌種選取相似度最高的1個(gè)菌株，用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.6 生化反應(yīng)及藥物敏感性分析 選取血平板培養(yǎng)48 h單個(gè)菌落，制備0.5麥?zhǔn)蠞岫葐挝痪鷳乙?，在DL-96STAPH生化反應(yīng)板孔中每孔加入菌懸液100μL，生化反應(yīng)包括D-氨基葡萄糖、脲酶、麥芽糖、β-半乳糖苷酶、七葉苷、棉子糖，VP、硝酸鹽；取50μL 0.5麥?zhǔn)蠞岫葐挝痪鷳乙杭尤隓L-96STAPH試劑盒中的M-H肉湯培養(yǎng)基中，充分混勻并分別取上述含菌液M-H肉湯培養(yǎng)基100μL加入含抗菌藥物試驗(yàn)孔，35℃孵育72 h，依據(jù)DL-96STAPH試劑盒說明書以及美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（CLSI）M62文件［8］進(jìn)行結(jié)果判讀。同時(shí)采用大腸埃希菌ATCC 35218作為質(zhì)控菌株。

1.7 文獻(xiàn)復(fù)習(xí) 使用PubMed、中國知網(wǎng)（CNKI）對(duì)老兵諾卡菌感染的相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行檢索，檢索范圍為2001年1月至2020年3月以前發(fā)表的文獻(xiàn)，英文關(guān)鍵詞為“Nocardia veterana”，中文關(guān)鍵詞為“老兵諾卡菌”，語言限制為英文和中文，對(duì)檢索的文獻(xiàn)進(jìn)行審查，排除人類感染以外的文獻(xiàn)以及對(duì)諾卡菌屬感染的匯總分析文獻(xiàn)。

2 結(jié)果

2.1 分離菌的培養(yǎng)特性、菌落形態(tài)及鏡下形態(tài) 分離菌株在血平板上35℃可緩慢生長(zhǎng)，24 h呈較小白色干燥顆粒狀菌落，48～72 h后形成干燥白色菌落，菌落有褶皺現(xiàn)象（圖1），且有泥土氣味。鏡下為革蘭陽性絲狀菌，培養(yǎng)24 h鏡下呈分枝狀（圖2A），48～96 h分枝逐漸斷裂（圖2B、2C、2D），120 h后分枝完全消失（圖2E）。弱抗酸染色呈弱抗酸性（圖2F）。

圖1 老兵諾卡菌在血平板上菌落形態(tài)（35℃培養(yǎng)24～72 h）

圖2 革蘭染色及弱抗酸染色鏡下形態(tài)

2.2 生化反應(yīng)及MALDI-TOF MS鑒定 MALDI-TOF MS鑒定為老兵諾卡菌（得分為2.245）。分離菌35℃培養(yǎng)48 h后，D-氨基葡萄糖、脲酶、麥芽糖、β-半乳糖苷酶、七葉苷陽性，棉子糖、VP、硝酸鹽陰性。

2.3 16S rRNA基因序列分析結(jié)果 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Sanger法測(cè)序長(zhǎng)度為1 385 bp，將測(cè)序序列和GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果顯示分離菌與數(shù)據(jù)庫中的Nocardia veterana（登錄號(hào)：NR_115156.1）序列相似性達(dá)100%。以Streptomyces gardneri strain NBRC 3385為外類群，通過MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)分離菌與N.veterana DSM4445在同一分支上，屬于同一菌種，老兵諾卡菌與克露茨克氏諾卡菌（N.kruczakiae）親緣關(guān)系較近。見圖3。

圖3 基于16SrRNA基因序列和運(yùn)用Neighbor-Joining的方法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 藥物敏感試驗(yàn) 分離菌對(duì)抗菌藥物的最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）分別為阿米卡星（0.25μg/mL）、慶大霉素（1μg/mL）、克拉霉素（0.25μg/mL）、利奈唑胺（≤2μg/mL）、復(fù)方磺胺甲噁唑（1/19μg/mL）、環(huán)丙沙星（8μg/mL）。其中，分離菌對(duì)環(huán)丙沙星耐藥，其余抗菌藥物均敏感。

2.5 文獻(xiàn)資料 共納入13篇文獻(xiàn)，英文為13篇，中文為0篇，病例數(shù)為16例［4-5，9-20］。16例感染病例中大部分來源于歐美地區(qū)（11/16），2例來自澳大利亞，3例來自亞洲地區(qū)（日本2例，中國臺(tái)灣地區(qū)1例）；感染部位多見于肺部（8/16），還可引起腦、腸道、尿道、腹膜及淋巴管感染甚至菌血癥，以及1例足分支菌病及1例眼部感染。鑒定方法大部分采用16SrRNA測(cè)序，有2例采用MALDI-TOF MS與16SrRNA測(cè)序相結(jié)合，經(jīng)過適當(dāng)治療，有11例效果良好。見表1。

表1 老兵諾卡菌感染文獻(xiàn)復(fù)習(xí)

續(xù)表

3 討論

本文對(duì)臨床分離老兵諾卡菌進(jìn)行24～120 h培養(yǎng)后的鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)該菌可以形成明顯分枝狀菌絲，分枝在48～96 h易斷裂，120 h后幾乎全部斷裂，與文獻(xiàn)中星形諾卡菌鏡下形態(tài)相似［21］。本文分離老兵諾卡菌具有弱抗酸特點(diǎn)。諾卡菌弱抗酸染色的結(jié)果與脫色時(shí)間有關(guān)［21］，本文采用脫色時(shí)間在2～60 s時(shí)，弱抗酸染色為陽性，＞60 s顯示為陰性，因此在對(duì)諾卡菌進(jìn)行弱抗酸染色時(shí)，要控制脫色時(shí)間，以免產(chǎn)生假陰性結(jié)果。有研究顯示，老兵諾卡菌七葉苷反應(yīng)為陽性，而非洲諾卡菌為陰性；非洲諾卡菌棉子糖反應(yīng)為陽性，老兵諾卡菌為陰性［11］，但是由于生化反應(yīng)特異性較弱，且諾卡菌種類繁多，僅通過生化反應(yīng)難以實(shí)現(xiàn)菌種鑒定。

本文采用的MALDI-TOF MS參考數(shù)據(jù)庫包括星形諾卡菌（N.asteroides）、非洲諾卡菌（N.africana）、巴西諾卡菌（N.brasiliensis）、老兵諾卡菌（N.veterana）等35種諾卡菌。MALDI-TOF MS蛋白質(zhì)處理方法有2種，分別是直接涂布法和蛋白質(zhì)提取法，蛋白質(zhì)提取法可提高鑒定的準(zhǔn)確性［22］。由于分離菌生長(zhǎng)較為緩慢，依據(jù)文獻(xiàn)［23］，本文采用幼齡菌進(jìn)行鑒定。目前基因測(cè)序已經(jīng)成為鑒定諾卡菌最準(zhǔn)確的方法，現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道老兵諾卡菌的鑒定大多采用16SrRNA測(cè)序。當(dāng)有些諾卡菌菌種間序列相似性較高時(shí)，可以增加其他管家基因如secA1、hsp65、gyrA和rpoB或構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹增加鑒定可信度。本文采用MALDI-TOF MS與16SrRNA測(cè)序的方法同時(shí)鑒定出分離菌為老兵諾卡菌，另外系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果顯示分離菌與N.veterana DSM4445在同一分支上，屬于同一菌種。

文獻(xiàn)復(fù)習(xí)發(fā)現(xiàn)，16例老兵諾卡菌感染的病例中除了肺部感染（8/16），還可引起腦、腸道、尿道、腹膜、淋巴管感染甚至菌血癥，以及足分支菌病及眼部感染等淺表感染，因此，老兵諾卡菌引起的感染范圍較為廣泛。而易感人群大多存在明確的免疫力受損因素，如使用免疫抑制劑治療、HIV感染以及患有系統(tǒng)性紅斑狼瘡等疾病，雖然有2例無明確的免疫抑制狀態(tài)，但仍伴隨有糖尿病或支氣管擴(kuò)張等基礎(chǔ)疾病。本文患者患有2型糖尿病且有類固醇使用史，亦存在易感因素。由于國際上對(duì)于老兵諾卡菌的治療尚無統(tǒng)一方案，文獻(xiàn)報(bào)道大部分采用復(fù)方磺胺甲噁唑成功治愈，其治療劑量從160 mg/800 mg～320 mg/1 600 mg不等，治療期限為3個(gè)月至1年，需要根據(jù)患者的癥狀及免疫狀態(tài)而定。而復(fù)方磺胺甲噁唑與阿米卡星、碳青霉烯或頭孢曲松的組合常用于嚴(yán)重或全身感染［24］。本例患者分離菌對(duì)復(fù)方磺胺甲噁唑敏感，治療中聯(lián)合應(yīng)用了復(fù)方磺胺甲噁唑和頭孢他啶，但由于患者基礎(chǔ)疾病較重，最終死亡，未能對(duì)其藥效進(jìn)行評(píng)估。利奈唑胺是一種新型唑烷酮類抗生素，2003年Moylett等［25］首次報(bào)道了6例用利奈唑胺治療成功的諾卡菌感染患者。因此，對(duì)于老兵諾卡菌感染的患者，可選用復(fù)方磺胺甲噁唑，對(duì)于磺胺類藥物不耐受者，可選擇利奈唑胺進(jìn)行治療。

綜上，本文對(duì)老兵諾卡菌的形態(tài)、鑒定及藥敏試驗(yàn)進(jìn)行描述，為臨床實(shí)驗(yàn)室對(duì)該菌的識(shí)別提供可視化參考；同時(shí)總結(jié)了國內(nèi)外相關(guān)報(bào)道及治療經(jīng)驗(yàn)，為臨床治療提供用藥參考。