謝錦霞 ，劉晶晶

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤，早期癥狀不明顯，晚期出現陰道出血等癥狀[1]。近些年，宮頸細胞學篩查的普遍應用使宮頸癌的發(fā)病率和死亡率已有明顯下降，但癌細胞生物學特性多種多樣，導致宮頸癌易發(fā)生轉移，并對治療產生不同的反應。因此進一步了解宮頸癌的發(fā)展機制能為早期診斷和晚期預后提供新的分子理論基礎。長鏈非編碼RNA(long noncoding，lncRNA)是一類非編碼RNA，含有200個核苷酸，翻譯潛力有限[2-3]，研究發(fā)現lncRNAs參與細胞內外的多種活動，包括基因轉錄、mRNA剪接和腫瘤發(fā)生等[4-6]。HNF1A AS1是一種新鑒定的lncRNA，自鑒定以來，HNF1A AS1已被證明在人類腫瘤發(fā)生中起關鍵作用，如在口腔鱗癌和膠質瘤細胞中，HNF1A AS1表達上調，促進癌細胞的存活和轉移，提示HNF1A AS1可能作為癌基因促進癌癥發(fā)展[7-8]。然而，HNF1A AS1是否對宮頸癌細胞具有強大的促癌作用還沒有深入的研究。本研究擬探究HNF1A AS1在宮頸癌發(fā)展過程中的作用及機制，為治療宮頸癌患者提供新的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料

人宮頸癌細胞C33A和人宮頸上皮永生化細胞株H8細胞來自上海生物細胞研究所；DMEM(Dulbecco's-modified Eagle's medium)培養(yǎng)基和胎牛血清來自美國Gibco公司；CCK-8試劑盒、點突變試劑盒和雙熒光素酶活性檢測試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)、LipofectamineTM2000購于美國Invitrogen公司；鈣粘附蛋白E(epithelial-cadherin，E-cadherin)、鈣粘附蛋白N(N-cadherin)、B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、Bcl-2相關蛋白X(Bcl-2-Associated X，Bax)和GAPDH多克隆抗體購于上海圣克魯斯生物科技有限公司；模擬物對照(mimics NC)、miR-320d 模擬物(miR-320d mimics)、抑制劑對照(inhibitor NC)、miR-320d抑制劑(miR-320d inhibitor)、干擾對照(siRNA NC)、HNF1A-AS1干擾(HNF1A-AS1 siRNA)、SOX4干擾(SOX4 siRNA)質粒由廣州銳博生物科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)C33A細胞和H8細胞，于37℃、5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。

1.2.2 細胞轉染 取生長狀態(tài)良好的細胞，當細胞長滿后，按1×105個/孔的密度鋪于12孔板中，待細胞匯合至75%～80%時，將各組重組質粒、LipofectamineTM2000分別稀釋于無FBS培養(yǎng)基中，轉染組分為：A:mimics NC組、miR-320d mimics組、inhibitor NC組、miR-320d inhibitor組;B:siRNA NC組、HNF1A-AS1 siRNA組、SOX4 siRNA組；C：siRNA NC+inhibitor NC組、HNF1A-AS1 siRNA+inhibitor NC組、miR-320d inhibitor+siRNA NC組、HNF1A-AS1 siRNA+miR-320d inhibitor組；D:HNF1A-AS1 wt +miR-320d組、HNF1A-AS1 wt +mimics control組、HNF1A-AS1 mut+miR-34a組、HNF1A-AS1 mut+mimics control組；E:SOX4 wt +miR-320d組、SOX4 wt +mimics control組、SOX4 mut+miR-34a組、SOX4 mut+mimics control組。于室溫孵育5 min，將稀釋后的重組質粒和脂質體混勻，室溫孵育15 min，將混合物小心滴加到細胞中，轉染48 h后收集各組細胞RNA樣和蛋白樣進行生物學功能實驗。

1.2.3 細胞增殖測定 取生長狀態(tài)良好的細胞，當細胞密度達95%時，PBS清洗3次，用2.5 g/mL胰酶消化細胞，按1×105個/mL的密度鋪于96孔板中，觀察細胞匯合達70%～80%時，使用LipofectamineTM2000轉染質粒，每組重復6個，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后棄上清，PBS清洗2次，每孔加入10 μL CCK-8工作液，繼續(xù)培養(yǎng)5 h，在酶標儀上讀取各孔在450 nm處的吸光值。

1.2.4 雙熒光素酶報告基因活性檢測 采用miRanda和TargetScan生物信息學軟件預測HNF1A-AS1和miR-320d潛在靶基因，PCR擴增HNF1A-AS1 3' UTR片段和SOX4 3' UTR片段，構建HNF1A-AS1野生型(HNF1A-AS1 wt)和SOX4野生型(SOX4 wt)載體。再通過點突變試劑盒構建HNF1A-AS1和SOX4突變重組質粒。按照LipofectamineTM2000轉染說明書轉染各組重組質粒，采用雙熒光素酶活性檢測試劑盒檢測C33A細胞的熒光素酶活性。

1.2.5 流式細胞儀檢測宮頸癌細胞的凋亡率 將各組重組質粒使用LipofectamineTM2000轉染至C33A細胞，胰酶消化后，用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基進行中和，1 000 r/min離心10 min后棄上清，PBS清洗3次，沉淀置于70%的乙醇中，4°C固定過夜，用流式細胞儀檢測各組細胞的細胞凋亡水平，收集數據進行顯著性分析。

1.2.6 實時熒光定量PCR 收取轉染重組質粒的細胞RNA樣，使用Trizol試劑在無RNA酶條件下從細胞中抽提總RNA，使用Takara反轉錄試劑盒反轉成cDNA，按照42℃，2 min；37℃ 15 min，85 ℃ 5 s的程序進行反應，逆轉錄得到的cDNA為模板，進行RT-qPCR，反應程序為95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，40個循環(huán)。使用2-△△Ct法分析實驗結果，并以U 6表達作為內參照。實驗所用的引物見表1。

表1 引物序列

1.2.7 Western blot 收取轉染重組質粒的細胞蛋白樣，使用RIPA充分裂解細胞，收集蛋白上清液，使用BCA試劑盒測定上清蛋白質濃度，取適量樣品進行點樣，并按照 80 V 35 min、115 V 2 h 的程序進行SDS-PAGE凝膠電泳。結束后采用濕轉將蛋白濕轉到PVDF膜上。轉膜完成后，將PVDF 膜置于封閉液(50 g/L脫脂奶粉配制)中，在室溫搖床封閉 2 h，封閉后的PVDF膜與一抗中在4℃過夜孵育，TBST清洗5次，每次5 min，一抗孵育結束后，將膜放在特異性二抗中，室溫搖床孵育1.5 h，TBST清洗3次，每次10 min，清洗干凈后進行目的蛋白曝光。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 16.0軟件處理數據，至少取3次獨立實驗結果。組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 miR-320d抑制C33A細胞增殖和EMT，促進C33A細胞的凋亡

由圖1A可知，C33A細胞中miR-320d的表達量低于H8細胞(t=8.139，P=0.0148)。由圖1B可知，和mimics NC組相比，miR-320d mimics組的miR-320d表達量明顯升高(t=20.79，P=0.0023)。由圖1C MTT實驗結果可知，miR-320d mimics組的細胞增殖能力低于mimics NC組(t=6.081，P=0.0260)。由圖1D、1E可知，miR-320d mimics組的細胞凋亡率明顯高于mimics NC組(t=15.52，P=0.0041)。由圖1F～1I可知，和mimics NC組相比，miR-320d mimics組的Bax、E-cadherin蛋白表達量明顯上升(t=12.67，P=0.0062)，Bcl-2和N-cadherin蛋白表達量下降(t=6.281，P=0.0237)，以上結果表明miR-320d能夠抑制C33A細胞的增殖和EMT，促進C33A細胞的凋亡。

A：RT-qPCR檢測miR-320d在C33A和H8細胞中的表達量；B：RT-qPCR檢測miR-320d的相對表達量；C：MTT檢測miR-320d對C33A細胞增殖的影響；D：流式細胞儀檢測miR-320d對C33A細胞凋亡的影響；E：C33A細胞凋亡率；F：Western blot檢測Bcl-2、Bax的蛋白表達量；G：Bcl-2、Bax蛋白相對表達量；H：Western blot檢測E-cadherin、N-cadherin的蛋白表達量；I：E-cadherin、N-cadherin蛋白的相對表達量(*P<0.05;**P<0.01;n=3)(注：“n”是代表每個實驗重復3次，下同)

2.2 HNF1A-AS1通過調控miR-320d表達促進C33A細胞增殖和EMT，抑制細胞凋亡

miRanda預測HNF1A-AS1和miR-320d之間的結合位點見圖2A。圖2B結果可知，當質粒攜帶HNF1A-AS1 3' UTR wt時，miR-320d的熒光素酶活性顯著降低(t=19.70，P=0.0026)；當質粒攜帶HNF1A-AS1 3' UTR mut時，miR-320d的熒光素酶活性無變化(P>0.05)。由圖2C可知，C33A細胞中HNF1A-AS1的表達量明顯高于H 8細胞(t=18.31，P=0.0030)；由圖2D～2E可知，與siRNA NC相比，HNF1A-AS1 siRNA組HNF1A-AS1的基因表達量下降(t=6.893，P=0.0204)，而miR-320d的基因表達量上升(t=8.839，P=0.0126)，說明HNF1A-AS1和miR-320d之間存在負調控關系。由圖2F～2J可知，和siRNA NC+inhibitor NC組相比，HNF1A-AS1 siRNA+inhibitor NC組細胞增殖能力下降(t=5.367，P=0.0330)，Bax、E-cadherin蛋白表達量明顯上升(t=24.31，P=0.0017 )，Bcl-2和N-cadherin蛋白表達量明顯下降(t=25.64，P=0.0015)，miR-320d inhibitor+siRNA NC組細胞增殖能力上升(t=5.518，P=0.0030)，Bax、E-cadherin蛋白表達量明顯下降(t=25.25，P=0.0016 )，Bcl-2和N-cadherin蛋白表達量明顯上升(t=25.25，P=0.0013)；與miR-320d inhibitor+siRNA NC組相比，HNF1A-AS1 siRNA+miR-320d inhibitor組細胞增殖能力下降(t=7.279，P=0.0184)，Bax、E-cadherin蛋白表達量明顯上升(t=18.11，P=0.0030)，Bcl-2和N-cadherin蛋白表達量明顯下降(t=23.71，P=0.0018)。以上結果說明HNF1A-AS1通過調控miR-320d表達促進C33A細胞增殖和EMT，抑制細胞凋亡。

A：miRanda預測NF1A-AS1和miR-320d之間的結合位點；B:熒光素酶表達量的測定；C：RT-qPCR檢測HNF1A-AS1在C33A和H8細胞中的表達量；D:RT-qPCR檢測HNF1A-AS1的表達量；E：RT-qPCR檢測miR-320d的表達量；F：MTT檢測 HNF1A-AS1通過miR-320d對C33A細胞增殖的影響；G：Western blot檢測Bcl-2、Bax的蛋白表達量；H：Bcl-2、Bax蛋白相對表達量；I：Western blot檢測E-cadherin、N-cadherin蛋白的表達量；J：E-cadherin、N-cadherin蛋白的相對表達量(*P<0.05;**P<0.01;n=3)

2.3 SOX4是miR-320d在C33A細胞中的下游靶點

預測miR-320d和SOX4之間的結合位點見圖3A，由圖3B結果可知，當質粒攜帶SOX4 3' UTR wt時，miR-320d的熒光素酶活性顯著降低(t=12.62，P=0.0062)，當質粒攜帶SOX4 3' UTR mut時，miR-320d的熒光素酶活性無變化(t=3.280，P=0.0817 )。以上結果表明SOX4是miR-320d在C33A細胞中的下游靶點。

A：TargetScan預測 miR-320d和SOX4之間的結合位點；B:熒光素酶表達量的測定；(*P<0.05;**P<0.01;n=3)

2.4 SOX4促進C33A細胞增殖和EMT，抑制C33A細胞的凋亡

由圖4A可知，C33A細胞中SOX4的表達量明顯高于H8細胞(t=20.87，P=0.0023)。如圖4B顯示，和siRNA NC組相比，SOX4 siRNA的表達量明顯降低(t=18.48，P=0.0029)。由圖4C～4I結果可知，SOX4 siRNA組細胞的增殖能力低于siRNA NC組(t=8.728，P=0.0129)，凋亡率明顯高于siRNA NC組(t=13.10，P=0.0058)，Bax、E-cadherin蛋白表達量明顯上升(t=48.78，P=0.0004)，Bcl-2、N-cadherin蛋白表達量下降(t=7.778，P=0.0161)，表明SOX4能夠促進C33A細胞的增殖和EMT，抑制C33A細胞的凋亡。

A：RT-qPCR檢測SOX4在C33A和H8細胞中的表達量；B：RT-qPCR檢測敲低SOX4后細胞中的SOX4的表達量；C：MTT檢測SOX4對C33A細胞增殖的影響；D：流式細胞儀檢測SOX4對C33A細胞凋亡的影響；E：C33A細胞凋亡率；F：Western blot檢測Bcl-2、Bax的蛋白表達量；G：Bcl-2、Bax蛋白相對表達量；H：Western blot檢測E-cadherin、N-cadherin的蛋白表達量；I：E-cadherin、N-cadherin蛋白的相對表達量(*P<0.05;**P<0.01;n=3)

2.5 HNF1A-AS1通過miR-320d調控SOX4的表達

由圖5A可知，和siRNA NC組相比，HNF1A-AS1 siRNA組的SOX4表達量降低(t=4.664，P=0.0430 )；和inhibitor NC組相比，miR-320d inhibitor組的SOX4表達量明顯升高(t=13.56，P=0.0054 )；由圖5B～5C可知，和siRNA NC+inhibitor NC組相比，HNF1A-AS1 siRNA+inhibitor NC組SOX4蛋白表達量降低(t=8.728，P=0.0129 )，miR-320d inhibitor+siRNA NC組SOX4蛋白表達量明顯上升(t=15.41，P=0.0042 )；和miR-320d inhibitor+siRNA NC組相比，HNF1A-AS1 siRNA+miR-320d inhibitor組SOX4蛋白表達量降低(t=5.692，P=0.0295 )。以上結果說明HNF1A-AS1通過miR-320d調控SOX4的表達。

A：RT-qPCR檢測SOX4的表達量；B：Western blot檢測HNF1A-AS1通過miR-320d調控SOX4的表達；C：SOX4蛋白的相對表達量(*P<0.05;**P<0.01;n=3)

3 討論

最近越來越多的研究發(fā)現，在癌癥的發(fā)生發(fā)展過程中，miRNA的異常表達可能作為癌基因或抑癌基因發(fā)揮重要的作用。大量研究報道了在宮頸癌中異常表達的miRNA，如在宮頸癌缺氧條件下，microRNA-519d-3p通過靶向HIF-2抑制細胞增殖和促進細胞凋亡[9]。miR-152在宮頸癌中具有抑癌功能，miR-152/KLF 5軸可能為宮頸癌治療提供新的治療靶點[10]。此外，miRNA-489能夠作為宮頸癌診斷和治療的生物標志物[11]。miR-320d作為miR-320家族的重要成員，已有研究報道m(xù)iR-320d在膠質瘤、乳腺癌、結直腸腺瘤和B細胞淋巴瘤中的作用[12-13]。而在本研究中，我們探討了miR-320d在宮頸癌中的臨床意義，并研究了其在宮頸癌細胞增殖、凋亡和EMT中的作用。結果表明，miR-320d在宮頸癌細胞中的表達明顯低于正常細胞，過表達miR-320d能夠抑制宮頸癌細胞的增殖、EMT和促進細胞凋亡。因此，miR-320d可能在宮頸癌中發(fā)揮抑癌作用。

大量研究表明，lncRNA能夠作為宮頸癌的診斷和預后標志物參與癌癥的發(fā)生發(fā)展。例如，LncRNA MALAT-1在宮頸癌中過表達，促進癌細胞的增殖、侵襲和遷移[14]。長鏈非編碼RNA TUG1的上調促進了宮頸癌細胞的增殖和遷移[15]。HNF1A-AS1作為很重要的lncRNA首次在人原發(fā)性食管腺癌中發(fā)現異常表達[16]。另外發(fā)現HNF1A-AS1在肺腺癌、肝細胞癌和骨肉瘤中也表達上調，能夠作為癌基因發(fā)揮作用[17-18]。本研究首先通過生物信息學分析發(fā)現miR-320d在HNF1A-AS1 3 UTR中的靶位點。此外，和正常細胞相比，宮頸癌細胞中HNF1A-AS1表達上調，敲低HNF1A-AS1增加了miR-320d的表達，抑制了宮頸癌細胞增殖的EMT，促進了癌細胞的凋亡。表明HNF1A-AS1通過下調miR-320d在宮頸癌進展中的表達，起到致癌基因的作用。SOX4是SOX家族中的一員，在調控癌癥發(fā)展方面起著重要作用。研究發(fā)現SOX4在各種癌癥中都有上調，如miR-129-2通過下調SOX4的表達來抑制食管癌細胞的增殖和遷移；miR-132通過靶向SOX4抑制肺癌細胞遷移和侵襲[19]；SOX4能夠誘導上皮-間質轉化，促進乳腺癌進展[20]。據報道，SOX4的表達在轉錄后受到miR-187、miR-204和miR-363等miRNA的調控，而在本研究中，SOX4被預測為miR-320d的下游靶點。SOX4在宮頸癌細胞中表達上調，敲低SOX4能夠抑制宮頸癌細胞的增殖和EMT，促進癌細胞的凋亡。此外，本研究結果表明，宮頸癌細胞中SOX4的水平與HNF1A-AS1呈正相關，與miR-320d呈負相關，HNF1A-AS1能夠通過miR-320d調控SOX4的表達。

綜上所述，lncRNA HNF1A-AS1在宮頸癌中起促癌作用，并通過miR-320d/SOX4軸促進宮頸癌的發(fā)展。本實驗數據也表明，HNF1A-AS1/miR-320d/SOX4軸可能是宮頸癌的一個有希望的治療靶點。