孫永嶺，孫穎慧，王 辰，李 嬌，齊周潔，趙 宇，李亞寧

（德州學(xué)院，山東德州 253023）

六點天蛾屬MarumbaMoore，1882隸屬于鱗翅目天蛾科，親緣關(guān)系與舟蛾科較近，體型較大，翅展在75～120 mm.幼蟲多以林木、果樹葉片為食，也有種類危害農(nóng)作物及蔬菜、牧草，常造成爆發(fā)性災(zāi)害，對我國農(nóng)林業(yè)造成嚴重威脅［1］.六點天蛾屬目前世界記錄有18種（不包含其亞種，且一種未命名），已發(fā)表的基因記錄約有193 條，約形成28 個集群，其中來自15 個國家的標本存放在15個機構(gòu)中，但是尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)中國種類的基因記述.

DNA條形碼（DNA Barcoding）最初由加拿大圭爾夫大學(xué)（University of Guelph）的動物學(xué)家Hebert 等［2］于2003 年提出，以DNA 序列為基礎(chǔ)建立物種識別體系，利用DNA 序列的差異進行種級階元的分類，并與林奈命名系統(tǒng)一一對應(yīng)，引起國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，為物種分類鑒定提供了新的研究方法和手段［3］.隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，尤其是PCR 技術(shù)的日趨完善，越來越多的分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用于物種的鑒定和分類［4］.利用DNA 條形碼技術(shù)進行物種分類，相比于傳統(tǒng)的物種鑒定和分類方法有著快速、準確、可自動化的優(yōu)點.

COI 基因即線粒體細胞色素C 氧化酶亞基I（mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I，COI）是昆蟲線粒體基因組中一段約645個堿基長度的片段［5］，具有高度保守序列且具有足夠變異位點的特征，故成為昆蟲分類和種群研究進化指標的重要檢測部分.COI基因作為DNA 條形碼的優(yōu)勢不僅在于近緣種之間序列位點信息具有足夠差異性，還在于其能夠被通用引物廣泛擴增［6］.

本研究旨在通過DNA 條形碼技術(shù)對六點天蛾屬進行鑒別并與傳統(tǒng)分類學(xué)方法進行比較分析，以期找到更加快捷方便的物種鑒定方法.

1 材料與方法

1.1 材料

虛擬實驗中六點天蛾屬種及其亞種共31 個樣本COI 片段序列來自BOLD 數(shù)據(jù)庫（Barcoding of life data），序列編號見表1.實體實驗中六點天蛾屬于2017 年8 月11 日于山東青島嶗山北九水300 m采得的梨六點天蛾（Marumba gaschkewitschi complacensWalker）樣本，常溫保存、常規(guī)方法干制而成.

表1 六點天蛾屬Marumba種及其亞種COI片段序列

1.2 方法

1.2.1虛擬實驗

將BOLD 數(shù)據(jù)庫中六點天蛾屬中17 種及14 亞種的基因序列進行下載，利用MEGA7.0 軟件對其構(gòu)建NJ樹（The NJ tree），計算其遺傳距離［7］，分析其種間差異和NJ樹解析度的準確性［8］.

1.2.2實體實驗

1.2.2.1總基因組的提取

取樣品足，剪碎，取少量，提取總DNA.加入15μL緩沖液GA到0.2 mL離心管中，放入樣品.加入10μL蛋白酶K溶液，渦旋混勻10 s.56℃孵育3 h，可過夜，使樣本充分降解消化.加入25μL緩沖液GA，混勻.再加入50μL 緩沖液GB 和1μLCarrier RNA 儲存液，濃度為1μg/μL，渦旋混勻10s.加入50 μL的無水乙醇（96%-100%），如果室溫超過25℃，要先將乙醇置冰上預(yù)冷［9］.輕輕顛倒混勻樣品，室溫放置5 min，簡短離心以去除管蓋內(nèi)壁的液滴.取上一步所得溶液添加到一個吸附柱CR2 中（吸附柱放入收集管中），12 000 rpm（～13 400×g）離心30 s，棄廢液，將吸附柱CR2 放回收集管中.向吸附柱CR2中加入500 μL緩沖液GD，12 000 rpm（～13 400×g）離心30 s，棄廢液.向吸附柱CR2中加入600 μL漂洗液PW，12 000 rpm（～13 400×g）離心30 s，棄廢液，將吸附柱CR2放回收集管中.重復(fù)操作.12 000 rpm（～13 400×g）離心2 min，倒掉廢液，將吸附柱CR2 置于室溫放置3 min左右.將吸附柱CR2轉(zhuǎn)入一個干凈的離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加20～50μL洗脫緩沖液TB，室溫放置2～5 min，12 000 rpm（～13 400×g）離心2 min，將溶液收集到離心管中.

1.2.2.2PCR擴增

COI 基因擴增引物為針對鱗翅目設(shè)計的引物，引物序列為（LEPF1：ATTCAACCAATCATAAAGATATTGG；LEPR1：TAAACTTCTGGATGTCCAAAAAATCA），引物由北京擎科新業(yè)技術(shù)有限公司合成可特異地擴增鱗翅目部分線粒體DNA 的COI 基因片段.PCR 反應(yīng)體系總體積為50μL，其中含有25μL 的2×Es Taq MasterMix（Dye），2μL 的Forward Primer 10μM，2μL 的Reverse Primer 10μM，小于0.5μg 的Template DNA，加入使總體積達到50μL 的ddH2O.擴增COI 基因的反應(yīng)順序為：循環(huán)前94℃預(yù)變性2 min，94℃變性30 s，55-65℃退火30 s，72℃延伸30 s，進行25～35個循環(huán)，最后72℃終延伸2 min.

1.2.2.3產(chǎn)物純化及測序

PCR 產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進行回收，直接作為測序的模板，測序由諾禾致源生物信息科技有限公司完成.

2 實驗數(shù)據(jù)的處理

采用MEGA 7.0對序列進行分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹.首先對序列進行多重比對，然后用ML法（最大似然法）［10］構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，選擇Bootstrap 100次檢驗各支的置信度.以17種六點天蛾為一組，以31 種及其亞種六點天蛾為一組，分析序列并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹.另外還要利用MEGA 7.0，計算不同物種間的遺傳距離.

3 結(jié)果

4 結(jié)論與討論

我們以Notodonta pacifical與N.manitou為外群，構(gòu)建17種六點天蛾的NJ進化樹.由圖1可得知17 種六點天蛾中遺傳距離最小的是M.timora與M.juvencus，為0.032，最大為M.gaschkewitschii與M.fenzelii，是0.114.由圖2 可以看出M.dyras，M.timora，M.juvencus，M.amboinicus，M.cristata的親緣關(guān)系相近，聚集在一起，構(gòu)成姐妹群體［11］；M.indicus，M.tigrina，M.quercus三者的親緣關(guān)系相近，聚集在一起，構(gòu)成另一個姐妹群體；M.saishiuanna，M.nympha兩者的親緣關(guān)系相近；M.fenzelii和M.jankowskii的親緣關(guān)系相近，同樣聚集在一起成為一個姐妹群體；M.spectabilis，M.gaschkewitschii，M.mackii三者的親緣關(guān)系相近，聚集在一起，也構(gòu)成一個姐妹群體.再由圖1可以得出M.dyras，M.timora，M.juvencus，M.amboinicus，M.saishiuanna五者之間遺傳距離最小的是M.timora與M.juvencus，為0.032；M.indicus，M.tigrina，M.quercus三者之間遺傳距離最小的是M.indicus與M.tigrina，為0.056；M.saishiuanna，M.nympha兩者的遺傳距離為0.073；M.fenzelii，M.jankowskii兩者的遺傳距離為0.051；M.spectabilis，M.gaschkewitschii，M.mackii三者之間遺傳距離最小的是M.mackii與M.Spectabilis，為0.070.

圖1 17種六點天蛾屬種間遺傳距離

圖2 基于COI基因序列17種六點天蛾NJ進化樹（以Notodonta pacifical與N.manitou為外群）

圖2中加粗部分為置信度超過90的數(shù)據(jù)，在統(tǒng)計學(xué)中，置信度超過90的數(shù)據(jù)可信度較高，所以由圖2 得出的“M.gaschkewitschii，M.mackii，M.spectabilis三者的親緣關(guān)系相近”與“M.fenzelii，M.jankowskii兩者的親緣關(guān)系相近”的結(jié)論準確性較高，而其他結(jié)論需待進一步實驗確定.

從圖3NJ進化樹上分析，I號5種（M.cristata cristata，M.cristata titan，M.cristata bukaiana，M.cristata borneensis，M.cristata centrosinica）、II 號3 種（M.amboinicus luzoni，M.amboinicus celebensis，M.amboinicus amboinicus）、III 號5 種（M.gaschkewitschi carstanjeni，M.gaschkewitschi gressitti，M.gaschkewitschi echephron，M.gaschkewitschi irata，M.gaschkewitschi complacens），IV 號2 種（M.saishiuana，M.saishiuana formosana）均位于一個分支，有較近的親緣關(guān)系，這與傳統(tǒng)分類學(xué)上的命名相符.且I 號5 種、III 號5 種和IV 號2 種總分支的置信度較高，所以準確性較高.M.spectabilis spectabilis與M.spectabilis malayana之間，M.dyras dyras與M.dyras javanica之間，從命名關(guān)系上看應(yīng)該有較近的親緣關(guān)系，但與NJ 樹不符.M.gaschkewitschii gaschkewitschii與I 號從傳統(tǒng)命名關(guān)系上看也應(yīng)有較近的親緣關(guān)系但與數(shù)據(jù)結(jié)果不符.造成以上問題原因可能為基因序列太短，存在誤差.同時，同一物種之間存在多種多態(tài)性，如單核苷酸多態(tài)性（SNP），也容易造成誤差.以上問題需待進一步實驗研究與討論確定原因.

圖3 基于COI基因序列31種（亞種）六點天蛾NJ進化樹（以Notodonta pacifical與N.manitou為外群）

對比圖2 和圖3 可以看出，圖2 中“M.gaschkewitschii，M.mackii，M.spectabilis三者的親緣關(guān)系相近”與“M.fenzelii，M.jankowskii兩者的親緣關(guān)系相近”的結(jié)論，在圖3 中有同樣的體現(xiàn)，證明了其準確性.