李 紅，趙小梅，趙奎君，馬致潔

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院中藥劑科，北京 100050)

急性和慢性肝臟疾病是臨床上的常見病、多發(fā)病，嚴(yán)重危害著人類健康?，F(xiàn)有藥物受療效及不良反應(yīng)等因素的影響，臨床應(yīng)用受到一定程度的限制，因此，尋找高效低毒的肝損傷治療藥物一直是新藥研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一[1]。中藥復(fù)方861合劑是首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院(以下簡(jiǎn)稱“我院”)王寶恩教授根據(jù)中醫(yī)藥理論及多年臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)開發(fā)的中藥復(fù)方制劑(醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑，批準(zhǔn)文號(hào)：京藥制字Z20063091)，主要由黃芪、丹參等10味中藥組成，主要功能為活性化瘀、益氣健脾，具有保肝降酶、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能等功效，在臨床上被用于慢性肝纖維化和早期肝硬化的治療，效果顯著。10多年的臨床應(yīng)用結(jié)果亦表明，中藥復(fù)方861合劑能有效改善肝病患者的癥狀、體征及肝功能[2-3]。為了進(jìn)一步提供保肝降酶的臨床用藥依據(jù)，本實(shí)驗(yàn)分別采用四氯化碳(CCl4)和D-半乳糖胺(D-GalN)制備小鼠急性肝損傷模型[4]，觀察中藥復(fù)方861合劑對(duì)小鼠肝損傷的保護(hù)作用，并通過小鼠急性毒性模型，了解中藥復(fù)方861合劑的主要中毒癥狀及死亡情況，為中藥復(fù)方861合劑的進(jìn)一步深入研究和臨床用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器

BS-224型生化分析測(cè)定儀(北京生化儀器廠)；DG5030型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(華東電子管廠)。

1.2 藥品與試劑

中藥復(fù)方861合劑(自制，由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院藥劑科按照原處方工藝制備，水煎液經(jīng)濃縮制成每毫升含1 g生藥的提取液)[3]；聯(lián)苯雙酯(北京協(xié)和藥廠，批準(zhǔn)文號(hào)為國(guó)藥準(zhǔn)字H11020980)；CCl4和D-GalN(中國(guó)人民解放軍防化學(xué)院提供)；丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)測(cè)定試劑盒(北京北化康泰臨床試劑有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明種小鼠，體重18～20 g，雌雄各半，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心提供。動(dòng)物飼養(yǎng)條件：按照清潔動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)；合格證號(hào)：軍醫(yī)動(dòng)字第B98006。

1.4 方法

1.4.1 動(dòng)物分組、給藥及CCl4誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷：取健康小鼠60只，體重(18±2) g，隨機(jī)分為六組，即正常對(duì)照組、CCl4模型組(0.02 ml/kg)、陽性對(duì)照組(聯(lián)苯雙酯0.029 g/kg，聯(lián)苯雙酯是治療肝損傷引起氨基轉(zhuǎn)氨酶升高的常用藥物，其保肝降酶作用效果明顯，且毒性低副作用小，已有大量相關(guān)文獻(xiàn)選用其作為陽性藥[5-7])以及中藥復(fù)方861合劑低、中及高劑量組(1.5、3及6 g/kg)，每組10只。小鼠均每日灌胃給藥2次，對(duì)照組及模型組小鼠給予相同容積的蒸餾水，連續(xù)給藥7次后，除正常對(duì)照組外，各組小鼠腹腔注射0.1% CCl40.2 ml/10 g[8-9]。造模后40 h，于小鼠眶靜脈采血，常規(guī)離心分離血清，按試劑盒操作說明檢測(cè)ALT、AST水平，并迅速取肝組織，進(jìn)行蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色。

1.4.2 動(dòng)物分組、給藥及D-GalN誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷：取健康小鼠60只，體重(18±2) g，隨機(jī)分為六組，即正常對(duì)照組、D-GalN模型組(0.8 g/kg)、陽性對(duì)照組(聯(lián)苯雙酯 0.029 g/kg)以及中藥復(fù)方861合劑低、中及高劑量組(1.5、3及6 g/kg)，每組10只。小鼠每日灌胃給藥2次，對(duì)照組及模型組小鼠給予相同容積的蒸餾水，給藥7次后，除正常對(duì)照組外，各組小鼠腹腔注射D-GalN 0.2 ml/10 g[10]。造模后20 h，于小鼠眶靜脈采血，常規(guī)離心分離血清，按試劑盒操作說明檢測(cè)ALT、AST水平，并迅速取肝組織，進(jìn)行HE染色。

1.4.3 動(dòng)物分組、給藥及急性毒性實(shí)驗(yàn)：取健康小鼠40只，體重(18±2) g，雌雄各半，禁食12 h，按預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，一次性以最大給藥容量(1.0 ml/20 g)和最大給藥濃度(1.2 g/ml)灌胃給藥，劑量60 g/kg，記錄14 d內(nèi)小鼠各種中毒癥狀及死亡情況，對(duì)死亡動(dòng)物進(jìn)行尸檢，分別在給藥前、給藥后第1、3、7及14日稱量動(dòng)物體重[11-12]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 11.0軟件統(tǒng)計(jì)分析，組間均數(shù)差異采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01為差異有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 中藥復(fù)方861合劑對(duì)CCl4致肝損傷小鼠血清ALT、AST及組織病理的影響

各給藥組小鼠的血清ALT、AST水平均低于模型組；中藥復(fù)方861合劑低、中及高劑量組小鼠血清ALT、AST水平與模型組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明中藥復(fù)方861合劑對(duì)CCl4所致小鼠急性肝損傷具有明顯的治療作用，見表1。正常對(duì)照組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞排列緊密，無小葉和匯管區(qū)炎癥；模型組小鼠肝細(xì)胞可見明顯脂肪樣變，胞質(zhì)疏松，胞漿內(nèi)可見明顯氣球樣病變，有的肝細(xì)胞核變形，被擠壓偏向細(xì)胞周邊，肝細(xì)胞呈灶狀、橋狀壞死，匯管區(qū)膽管增厚，可見密集的淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞浸潤(rùn)；陽性對(duì)照組小鼠肝組織排列緊密，無明顯脂肪樣變，有少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；中藥復(fù)方861合劑低劑量組小鼠部分肝細(xì)胞壞死，有少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；中藥復(fù)方861合劑中劑量組小鼠肝小葉未見明顯脂肪樣病變，肝細(xì)胞呈條索狀分布，邊緣清晰；中藥復(fù)方861合劑高劑量組小鼠未見明顯脂肪樣變，匯管區(qū)可見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，見圖1。

表1 中藥復(fù)方861合劑對(duì)CCl4致急性肝損傷小鼠血清ALT、AST水平的影響Tab 1 Effects of herbal compound 861 on serum ALT and AST levels in mice with acute liver injury induced by

2.2 中藥復(fù)方861合劑對(duì)D-GalN致肝損傷小鼠血清ALT、AST及組織病理的影響

各給藥組小鼠的血清ALT、AST水平明顯低于模型組；中藥復(fù)方861合劑中、高劑量組與模型組小鼠血清ALT、AST水平與模型組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明中藥復(fù)方861合劑對(duì)D-GalN所致小鼠急性肝損傷具有一定的治療作用，見表2。正常對(duì)照組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞排列緊密，無小葉和匯管區(qū)炎癥；模型組小鼠肝細(xì)胞可見明顯紅細(xì)胞侵潤(rùn)，有的肝細(xì)胞核變形，被擠壓偏向細(xì)胞周邊，可見密集的淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞浸潤(rùn)；陽性對(duì)照組小鼠肝組織排列緊密，無明顯脂肪樣變，有少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；中藥復(fù)方861合劑低劑量組小鼠有少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；中藥復(fù)方861合劑中劑量組小鼠肝小葉未見明顯脂肪樣病變，邊緣清晰；中藥復(fù)方861合劑高劑量組小鼠肝細(xì)胞排列緊密，無小葉和匯管區(qū)炎癥，見圖2。

表2 中藥復(fù)方861合劑對(duì)D-GalN致小鼠急性肝損傷的影響Tab 2 Effect of herbal compound 861 on liver histomathology of acute liver injury in mice induced by D-GalN

A.正常對(duì)照組；B.CCl4模型組；C.陽性對(duì)照組(0.029 g/kg)；D.中藥復(fù)方861合劑低劑量組(1.5 g/kg)；E.中藥復(fù)方861合劑中劑量組(3 g/kg)；F.中藥復(fù)方861合劑高劑量組(6 g/kg)A. normal control group; B. CCl4 model group; C. positive control group(0.029 g/kg); D. low-dose group of herbal compound 861(1.5 g/kg); E. medium-dose group of herbal compound 861(3 g/kg); F. high-dose group of herbal compound 861(6 g/kg)圖1 中藥復(fù)方861合劑對(duì)CCl4致急性肝損傷小鼠肝組織病理的影響(HE染色×200)Fig 1 Effect of herbal compound 861 on liver histomathology of acute liver injury in mice induced by CCl4(HE staining ×200)

2.3 急性毒性小鼠死亡及體重變化情況

小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，小鼠無死亡，行為、活動(dòng)如常，在以后的觀察期內(nèi)體重增長(zhǎng)正常，未見明顯異常癥狀，見表3。

表3 小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)的死亡情況和體重變化情況Tab 3 Death and body weight changes in acute toxicity test of mice

3 討論

CCl4誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷模型是目前研究保肝藥物藥效及作用機(jī)制最經(jīng)典的模型，該模型指標(biāo)明確、重復(fù)性好，能準(zhǔn)確反映肝細(xì)胞功能、代謝及形態(tài)變化[13-14]。本實(shí)驗(yàn)采用CCl4誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷經(jīng)典模型研究中藥復(fù)方861合劑對(duì)肝臟的保護(hù)作用，結(jié)果顯示，經(jīng)CCl4處理后，與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠血清ALT和AST水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0. 01)；病理切片顯示，肝細(xì)胞受損嚴(yán)重，表明模型建立成功。相比CCl4模型組，中藥復(fù)方861合劑各劑量組小鼠的血清ALT和AST水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；病理切片顯示，肝組織炎癥病變程度明顯減輕，且呈一定的劑量依賴性，提示中藥復(fù)方861合劑對(duì)CCl4引起的急性肝損傷具有明顯的保護(hù)作用。

A.正常對(duì)照組；B.D-GalN模型組；C.陽性對(duì)照組(0.029 g/kg)；D.中藥復(fù)方861合劑低劑量組(1.5 g/kg)；E.中藥復(fù)方861合劑中劑量組(3 g/kg)；F.中藥復(fù)方861合劑高劑量組(6 g/kg)A. normal control group; B. D-GalN model group; C. positive control group(0.029 g/kg); D. low-dose group of herbal compound 861(1.5 g/kg); E. medium-dose group of herbal compound 861(3 g/kg); F. high-dose group of herbal compound 861(6 g/kg)圖2 中藥復(fù)方861合劑對(duì)D-GalN致急性肝損傷小鼠肝組織病理的影響(HE染色×200)Fig 2 Effect of herbal compound 861 on liver histomathology of acute liver injury in mice induced by D-GalN(HE staining ×200)

D-GalN是肝細(xì)胞磷酸尿嘧啶核苷干擾劑，可造成肝彌漫性壞死和炎癥[15]。D-GalN模型是目前公認(rèn)較成熟的研究肝炎發(fā)病機(jī)制以及驗(yàn)證藥物療效的動(dòng)物模型[16]；且GalN誘發(fā)的動(dòng)物肝組織損傷在形態(tài)學(xué)和功能學(xué)上與人類急性重癥肝炎相似[17]。因此，D-GalN急性肝損傷模型是研究抗病毒性肝炎藥物的理想模型[18]。本實(shí)驗(yàn)采用該模型確證中藥復(fù)方861合劑對(duì)急性肝損傷小鼠的保護(hù)作用，結(jié)果顯示，經(jīng)D-GalN處理后，與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠的血清ALT和AST水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；病理切片顯示，肝細(xì)胞受損嚴(yán)重，表明模型建立成功。相比CCl4模型組，中藥復(fù)方861合劑各劑量組小鼠的血清ALT和AST水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；病理切片顯示，肝組織炎癥病變程度明顯減輕，且呈一定的劑量依賴性，提示中藥復(fù)方861合劑對(duì)D-GalN引起的急性肝損傷具有明顯的保護(hù)作用，但其保肝作用可能還與其他環(huán)節(jié)相關(guān)，具體作用機(jī)制需進(jìn)一步深入研究。

本研究在考察中藥復(fù)方861合劑對(duì)小鼠急性肝損傷的前提下，以最大給藥容量和最大給藥濃度考察了其對(duì)小鼠的急性毒性。小鼠給藥劑量為60 g/kg(折合約400生藥g/kg)，約為臨床上人日劑量的100倍，觀察該劑量下小鼠14 d內(nèi)的中毒狀況，結(jié)果顯示，觀察期內(nèi)未見小鼠死亡，亦未表現(xiàn)出明顯中毒癥狀，且在觀察期后繼續(xù)觀察動(dòng)物的行為活動(dòng)及體重增長(zhǎng)狀況，均未見異?，F(xiàn)象，該結(jié)果明確了中藥復(fù)方861合劑的安全性，為臨床安全用藥提供了有力的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持[19-20]。