張靜宜,夏 蕾,張曉月,譚本旭,楊鎮(zhèn)洲

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院腫瘤中心,重慶 400010;*通訊作者,E-mail:yangzz@cqmu.edu.cn)

肺癌是呼吸系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤,其發(fā)病率在我國呈現(xiàn)逐年增加的趨勢[1,2]。肺癌預(yù)后往往較差,嚴(yán)重威脅人類生命健康[3,4]。肺癌細(xì)胞的無限增殖是肺癌發(fā)生和發(fā)展的重要原因[5]。微小RNA(microRNA,miRNA)是一類機體內(nèi)源性的小分子非編碼RNA,長約22個核苷酸,具有組織特異性[6]。miRNA廣泛參與基因轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)節(jié),在細(xì)胞增殖、分化、凋亡、衰老等生理過程中扮演重要角色[7]。近年來的研究發(fā)現(xiàn),miRNA在肺癌組織中高表達(dá)或低表達(dá),發(fā)揮著癌基因或抑癌基因的作用,對肺癌的發(fā)生和發(fā)展起到關(guān)鍵作用[8]。miR-6833-3p由21個核苷酸組成,可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖[9]。miR-6833-3p在肺癌中的作用尚不明確。本研究旨在檢測miR-6833-3p在肺癌細(xì)胞中的表達(dá),探究miR-6833-3p對肺癌細(xì)胞周期和增殖的影響及機制,為肺癌的診斷和治療提供新的研究方向。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系和主要試劑

肺癌細(xì)胞(HCC827、A549、H1650、H1299)和永生化正常肺泡上皮細(xì)胞(HPAEpiC)購于上海信然生物技術(shù)有限公司;胎牛血清購于美國Gibco公司;RPMI-1640培養(yǎng)基和DMEM培養(yǎng)基購于美國Hyclone公司;四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)試劑盒購于美國Sigma公司;攜帶miR-6833-3p的慢病毒、陰性對照慢病毒、miR-6833-3p模擬物、miR-NC、野生型與突變型LPIN1 3′非翻譯區(qū)熒光素酶報告基因質(zhì)粒(LPIN1-WT和LPIN1-MUT)購于廣州銳博生物技術(shù)有限公司;細(xì)胞周期試劑盒購于武漢博士德生物科技有限公司;雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炘噭┖匈徲诿绹鳳romega公司;Lipofectamine?3000購于美國Life Technologies公司;實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)試劑盒購于日本TaKaRa公司;一抗CDK2、CDK4、Cyclin D1、GAPDH購于美國Abcam公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和感染

HCC827、H1650、H1299肺癌細(xì)胞的培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基,A549、HPAEpiC細(xì)胞的培養(yǎng)基為10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2、飽和濕度。采用實時定量PCR(qPCR)檢測miR-6833-3p在肺癌細(xì)胞(HCC827、A549、H1650、H1299)和永生化正常肺泡上皮細(xì)胞(HPAEpiC)中的表達(dá)水平。

將H1299細(xì)胞鋪于6孔板,待細(xì)胞在6孔板中的匯合度為30%時,根據(jù)慢病毒感染說明書,分別感染攜帶miR-6833-3p的慢病毒和陰性對照慢病毒,命名為miR-6833-3p組和對照組。培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后換為10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基。

1.3 qPCR檢測miR-6833-3p和LPIN1 mRNA的表達(dá)

按照Trizol法提取細(xì)胞中總RNA,根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)qPCR試劑盒說明書進(jìn)行擴增,qPCR結(jié)果以2-ΔΔCt方法得到。分別以U6和GAPDH作內(nèi)參,比較miR-6833-3p和LPIN1的表達(dá)。GAPDH上游引物序列:5′-GGAG CGAGATCCCTCCAAAAT-3′,下游引物:5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′;miR-6833-3p上游引物:5′-TTTCTCTCTCCACTTCCTCAGGTCGT-3′,下游引物:5′-TGAGGTGCTGTGCGTGAC-3′;U6上游引物:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,下游引物:5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′;LPIN1上游引物:5′-CCAGCCCAATGGAAACCTCC-3′,下游引物:5′-AGGTGCATAGGGATAACTTCCTG-3′。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測H1299細(xì)胞周期

收集對數(shù)生長期的兩組H1299細(xì)胞,采用70%乙醇固定,在冰箱內(nèi)過夜。采用PBS溶液洗3次,加入PI染液進(jìn)行染色,在37 ℃下避光孵育20 min,采用流式細(xì)胞儀分析每組H1299細(xì)胞周期分布比例。

1.5 四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法檢測感染H1299細(xì)胞的增殖能力

收集對數(shù)生長期的兩組H1299細(xì)胞,分別在接種后第1,2,3,4,5天,每孔加入30 μl MTT試劑,培養(yǎng)箱內(nèi)靜置3 h,棄上清,每孔加入160 μl二甲基亞砜,振蕩20 min,將96孔板置于酶標(biāo)儀,設(shè)定波長490 nm,檢測每孔的吸光度(A)值。

1.6 生物信息學(xué)軟件預(yù)測和雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-6833-3p的潛在靶基因

利用生物信息學(xué)預(yù)測軟件RegRNA2.0和PICTAR2預(yù)測miR-6833-3p的潛在靶基因可能是LPIN1。將LPIN1-WT、LPIN1-MUT與miR-6833-3p模擬物或miR-NC共轉(zhuǎn)染H1299細(xì)胞,24 h后棄去培養(yǎng)基,根據(jù)雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炘噭┖姓f明書檢測各組H1299細(xì)胞螢火蟲熒光素酶活性和海腎熒光素酶活性,相對熒光素酶活性=螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性。

1.7 Western blot檢測靶基因蛋白的表達(dá)

收集對數(shù)生長期的兩組H1299細(xì)胞,提取總蛋白并測定其濃度,等量上樣進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠中電泳,采用濕轉(zhuǎn)法將電泳分離的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜,采用5%脫脂牛奶封閉2 h。分別加入一抗CDK2(稀釋比為1 ∶2 000)、LPIN1(稀釋比為1 ∶1 000)、CDK4(稀釋比為1 ∶1 000)、Cyclin D1(稀釋比為1 ∶500)、GAPDH一抗(稀釋比均為1 ∶2 000)后4 ℃孵育。加入二抗(稀釋比為1 ∶10 000)室溫孵育2 h。加入ECL顯影液在暗室發(fā)光、顯影。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 肺癌細(xì)胞系中miR-6833-3p的表達(dá)

qPCR結(jié)果顯示,miR-6833-3p在肺癌細(xì)胞(HCC827、A549、H1650、H1299)和永生化正常肺泡上皮細(xì)胞(HPAEpiC)中的表達(dá)分別為0.72±0.06,0.38±0.04,0.65±0.04,0.18±0.03和1.01±0.09(見圖1)。與HPAEpiC細(xì)胞相比,miR-6833-3p在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)均明顯下調(diào)(P<0.05),H1299細(xì)胞中的表達(dá)最低(P<0.01)。

2.2 H1299細(xì)胞感染miR-6833-3p病毒的效率

qPCR結(jié)果顯示,對照組和miR-6833-3p組細(xì)胞中miR-6833-3p的相對表達(dá)分別為1.07±0.37和12.48±1.70,miR-6833-3p組miR-6833-3p的相對表達(dá)是對照組的11.66倍,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=6.64,P<0.01)。

與HPAEpiC比較,*P<0.05,**P<0.01圖1 肺癌細(xì)胞和永生化正常肺泡上皮細(xì)胞中miR-6833-3p的相對表達(dá)Figure 1 Relative expression of miR-6833-3p in lung cancer cells and immortalized normal alveolar epithelial cells

2.3 miR-6833-3p對H1299細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,與對照組相比,miR-6833-3p組中G0/G1期細(xì)胞比例明顯增加(P<0.01),S期和G2/M期細(xì)胞比例明顯減少(P<0.01,見圖2),miR-6833-3p可抑制肺癌H1299細(xì)胞周期的進(jìn)展。

圖2 miR-6833-3p對H1299細(xì)胞周期的影響Figure 2 Effect of miR-6833-3p on the cell cycle of H1299

2.4 miR-6833-3p對H1299細(xì)胞增殖能力的影響

MTT法結(jié)果顯示,miR-6833-3p組H1299細(xì)胞在第3,4,5天的A值明顯低于對照組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.58,P<0.05;t=3.94,P<0.05;t=5.14,P<0.01,見圖3),提示miR-6833-3p可抑制肺癌H1299細(xì)胞的增殖能力。

2.5 生物信息學(xué)軟件預(yù)測結(jié)果

利用生物信息學(xué)預(yù)測軟件RegRNA2.0和PICTAR2預(yù)測,miR-6833-3p的潛在靶基因可能是LPIN1,LPIN1 3′ UTR-WT核心序列為“AGAGAGAA”,LPIN1 3′ UTR-MUT突變序列為“UCUCUCUU”(見圖4)。

2.6 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-6833-3p靶向結(jié)合LPIN1

miR-NC與LPIN1-WT質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組相對熒光素酶活性為1.01±0.09,miR-6833-3p與LPIN1-WT共轉(zhuǎn)染相對熒光素酶活性為0.36±0.08,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.95,P<0.01,見圖5),表明miR-6833-3p可直接靶向結(jié)合LPIN1基因。

與對照組比較,*P<0.05,**P<0.01圖3 miR-6833-3p對H1299細(xì)胞增殖能力的影響Figure 3 Effect of miR-6833-3p on the proliferation of H1299 cells

與miR-NC+LPIN1-WT組相比,**P<0.01圖5 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-6833-3p靶向結(jié)合LPIN1Figure 5 Verification of the binding of miR-6833-3p to LPIN1 by dual luciferase reporter assay

2.7 H1299細(xì)胞感染miR-6833-3p慢病毒對LPIN1 mRNA表達(dá)的影響

qPCR結(jié)果顯示,感染miR-6833-3p慢病毒后的miR-6833-3p組H1299細(xì)胞中LPIN1 mRNA的相對表達(dá)量明顯低于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(0.18±0.04vs1.02±0.10,t=8.04,P<0.01),表明miR-6833-3p可有效抑制LPIN1 mRNA的相對表達(dá)。

2.8 LPIN1蛋白和細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)水平

Western blot結(jié)果表明，與對照組比較，miR-6833-3p組H1299細(xì)胞中LPIN1蛋白表達(dá)明顯降低(4.76±0.32vs2.08±0.17，P<0.01)，細(xì)胞周期蛋白CDK2表達(dá)明顯降低(7.90±0.47vs1.25±0.22，P<0.01)，CDK4表達(dá)明顯降低(2.12±0.23vs0.66±0.12，P<0.01)，Cyclin D1表達(dá)明顯降低(3.79±0.38vs1.34±0.12，P<0.01,見圖6)。

圖6 miR-6833-3p對LPIN1蛋白及細(xì)胞周期蛋白表達(dá)的影響Figure 6 Effect of miR-6833-3p on the expression of LPIN1 protein and cell cycle-related proteins

3 討論

微小RNA(miRNA)通過在轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶基因的表達(dá),調(diào)控細(xì)胞各種分子信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)[10]。目前,國內(nèi)外對肺癌的miRNA研究不斷深入,越來越多的miRNA在肺癌中被發(fā)現(xiàn)[11]。一類miRNA如miR-605-5p[12]、miR-196b-5p[5]在肺癌組織和細(xì)胞中高表達(dá),發(fā)揮促癌功能;另一類miRNA如miR-548b-3p[13]、miR-200a-3p[14]在肺癌組織和細(xì)胞中低表達(dá),發(fā)揮抑癌功能。有研究報道,miR-6833-3p在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)明顯下調(diào),可能通過調(diào)節(jié)SMC4基因表達(dá)抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖,發(fā)揮明顯的抑癌作用[9]。miR-6833-3p在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)、作用及機制尚不清楚。本研究顯示,miR-6833-3p在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)顯著少于永生化正常肺泡上皮細(xì)胞,miR-6833-3p可能與肺癌的形成密切相關(guān)。本研究采用流式細(xì)胞術(shù)檢測肺癌H1299細(xì)胞周期,上調(diào)miR-6833-3p明顯抑制H1299細(xì)胞周期進(jìn)展。MTT法進(jìn)一步顯示,miR-6833-3p過表達(dá)的H1299細(xì)胞增殖能力明顯降低。miR-6833-3p可通過抑制H1299細(xì)胞周期進(jìn)展,降低肺癌H1299細(xì)胞的增殖能力,miR-6833-3p在肺癌細(xì)胞中發(fā)揮抑癌功能。

miRNA通過與靶基因mRNA的種子序列以不完全互補的方式結(jié)合,介導(dǎo)mRNA的降解,抑制靶基因的蛋白翻譯[15]。本研究利用生物信息學(xué)預(yù)測軟件RegRNA2.0和PICTAR2預(yù)測發(fā)現(xiàn),miR-6833-3p的潛在靶基因是脂蛋白1(lipin 1,LPIN1)。LPIN1基因位于人染色體2p25.1,由2 672個堿基組成[16]。LPIN1蛋白長度為890個氨基酸,是磷脂酸磷酸水解酶家族成員之一,負(fù)責(zé)調(diào)控脂質(zhì)的合成[17]。LPIN1蛋白是一種促癌因子,在乳腺癌、卵巢癌、肝癌等多種實體腫瘤組織中高表達(dá),可明顯促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖,與腫瘤患者的不良預(yù)后相關(guān)[18,19]。本研究通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實,miR-6833-3p可直接與LPIN1 mRNA的3′ UTR區(qū)域互補結(jié)合。qPCR和Western blot顯示,過表達(dá)miR-6833-3p可在mRNA和蛋白水平上負(fù)向調(diào)節(jié)LPIN1基因的表達(dá),驗證了miR-6833-3p對LPIN1具有靶向調(diào)控作用。LPIN1蛋白表達(dá)降低后,細(xì)胞周期蛋白CDK2、CDK4、Cyclin D1表達(dá)明顯降低,表明肺癌細(xì)胞周期進(jìn)展被抑制,肺癌細(xì)胞的增殖能力降低。miR-6833-3p在肺癌組織中的表達(dá)情況尚不明確,是我們下一步的研究方向。

綜上所述,miR-6833-3p在肺癌細(xì)胞中異常表達(dá),其通過靶向調(diào)控癌基因LPIN1的表達(dá),抑制肺癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。miR-6833-3p在肺癌細(xì)胞中發(fā)揮抑癌基因功能,其具有成為肺癌診斷和治療新靶點的潛力。