吳凡 李林法 程國平 戴五敏 易賀慶

甲狀腺癌是常見的內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤[1]，其中分化型甲狀腺癌（differentiated thyroid cancer，DTC）占90%以上[2]，包括乳頭狀甲狀腺癌（papillary thyroid cancer，PTC）及濾泡狀甲狀腺癌（follicle thyroid cancer，F(xiàn)TC）。131I治療可以降低DTC患者術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)、延長患者生存時(shí)間，是DTC術(shù)后治療的重要手段之一。甲狀腺癌組織能較好攝碘是131I治療有效的前提，但有部分患者病灶失去攝碘能力而對(duì)131I治療抵抗，導(dǎo)致治療效果不理想[3]。神經(jīng)內(nèi)分泌分化（neuroendocrine differentiation，NED）存在于各種惡性腫瘤中，如前列腺癌、乳腺癌、胃癌等，在各種腺癌中的檢出率為16%～75%。發(fā)生NED的腫瘤細(xì)胞可在轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控下通過自分泌、旁分泌等途徑刺激周圍腫瘤細(xì)胞生長及增殖，降低凋亡能力，導(dǎo)致預(yù)后不良，但關(guān)于其在DTC的131I治療過程是否發(fā)揮作用的相關(guān)報(bào)道較少。因此，筆者通過免疫組化法分析NED標(biāo)志性蛋白嗜鉻粒蛋白A（chromograninA，CgA）、神經(jīng)細(xì)胞黏附分子1（neural cell adhesion molecule 1，CD56）、突觸蛋白（synaptophysin，Syn）和碘代謝關(guān)鍵基因促甲狀腺激素受體（thyroid stimulating hormone receptor，TSHR）、鈉碘同向轉(zhuǎn)運(yùn)體（sodium iodide symporter，NIS）在DTC組織中的表達(dá)情況，探討DTC的NED與131I治療療效的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 收集中國科學(xué)院大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院（浙江省腫瘤醫(yī)院）生物樣本庫中46例1991年3月至2017年5月接受手術(shù)治療的肺轉(zhuǎn)移DTC患者的病變甲狀腺組織石蠟標(biāo)本，確診時(shí)年齡范圍為23～83歲，中位年齡為45歲，其中PTC 39例，F(xiàn)TC 7例，女27例（58.6%），＜55歲34例（73.9%）。根據(jù)病歷記錄人口學(xué)數(shù)據(jù)、病理特征（包括單雙側(cè)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等）和臨床結(jié)果及第8屆美國癌癥聯(lián)合委員會(huì)（AJCC）建議評(píng)估DTC患者的TNM分期。

1.2131I治療及療效判定131I治療主要通過131I釋放β射線破壞殘余甲狀腺癌組織以降低甲狀腺癌轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)的概率。病灶是否攝碘由2位核醫(yī)學(xué)科副主任醫(yī)師根據(jù)碘掃圖像作出評(píng)價(jià)，病灶攝碘率=攝碘患者例數(shù)/總例數(shù)。131I治療后6個(gè)月測(cè)定甲狀腺激素抑制狀態(tài)下的血清球蛋白水平，治療后6～12個(gè)月進(jìn)行胸部CT檢查[4]，由2位影像科副主任醫(yī)師作出診斷。血清球蛋白水平持續(xù)下降25%以上，并按照實(shí)體瘤的療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)（RECIST）胸部CT檢查顯示轉(zhuǎn)移灶縮小、減少則提示131I治療有效[5]，131I治療有效率=有效患者例數(shù)/總例數(shù)。

1.3 標(biāo)本采集及檢測(cè) 46例DTC組織分別由2位病理科副主任醫(yī)師通過HE染色獨(dú)立作出診斷并選擇有代表性的區(qū)域。作3μm厚切片，采用免疫組化Envision二步法檢測(cè)TSHR、NIS、CgA、CD56、Syn的表達(dá)。切片常規(guī)脫蠟，然后二甲苯脫蠟，并在不同濃度的乙醇稀釋液中進(jìn)行水合；在pH 6.0的檸檬酸緩沖液中微波預(yù)處理15 min進(jìn)行抗原恢復(fù)，再用5%H2O2處理切片5 min以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性，然后將切片與CgA（美國Invitrogen公司，MA1-25038）、CD56（美國Invitrogen公司，MA5-11563）、Syn（美國Abcam公司，ab32127）、TSHR（美國Abcam公司，ab218108）、NIS（美國Abcam公司，ab242007）抗體（1：100稀釋）在室溫下孵育1 h；用PBS洗滌3次后，加入二抗（美國Santa Cruz公司，羊抗鼠sc-2005，鼠抗兔sc-2357，1：2 000稀釋）在室溫下孵育20 min。所有切片用DAB顯色5 min，然后用蘇木素復(fù)染，并由2位病理科副主任醫(yī)師復(fù)查。

1.4 結(jié)果判定 根據(jù)免疫組化染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分率評(píng)估TSHR、NIS、CgA、CD56、Syn的半定量表達(dá)水平。未染色、淺黃、黃棕色和棕色的染色強(qiáng)度評(píng)分分別為0、1、2和3。陽性細(xì)胞百分率分別為0%、1%～25%、26%～50%、51%～75%和＞75%，評(píng)分分別為0、1、2、3和4。將染色強(qiáng)度評(píng)分和陽性細(xì)胞百分率評(píng)分乘積代表CgA、CD56、Syn、TSHR、NIS的半定量表達(dá)水平，＜4分為陰性表達(dá)，≥4分為陽性表達(dá)[6]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 相關(guān)基因表達(dá)與臨床特征的關(guān)系 46例患者中131I治療有效率為36.9%（17/46），病灶攝碘率為60.8%（28/46）。NIS、TSHR、CgA、CD56在DTC中的陽性表達(dá)率 分 別 為28.2%（13/46）、15.2%（7/46）、8.6%（4/46）、15.2%（7/46）。Syn無陽性表達(dá)。CgA、CD56表達(dá)水平在不同年齡、性別、單雙側(cè)、分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及療效的DTC患者之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；NIS表達(dá)水平在不同年齡DTC患者之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而在不同性別、單雙側(cè)、分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、攝碘率及療效的DTC患者之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；TSHR表達(dá)水平在不同性別DTC患者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而在不同年齡、單雙側(cè)、分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、攝碘率及療效的DTC患者之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。見表1。

表1 相關(guān)基因表達(dá)與臨床特征的關(guān)系（例）

2.2 CgA、CD56表達(dá)與NIS、TSHR表達(dá)的關(guān)系 CgA與TSHR、NIS表達(dá)之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。CD56陽性患者中NIS陽性率為38.5%（5/13），高于CD56陰性的6.9%（2/29），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而CD56陽性與陰性患者TSHR表達(dá)率的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 CgA、CD56表達(dá)與NIS、TSHR表達(dá)的關(guān)系（例）

3 討論

目前甲狀腺癌的DTC發(fā)病率較高，經(jīng)過手術(shù)、甲狀腺激素抑制治療及131I治療后大部分患者預(yù)后良好[7]。本研究中大部分患者病灶能夠攝取131I，并且大部分?jǐn)z碘患者療效較好，與相關(guān)報(bào)道相符[8]。但部分患者存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移且不可手術(shù)切除的病灶對(duì)131I治療抵抗，患者預(yù)后不良，相關(guān)機(jī)制仍需要進(jìn)一步的研究[9]。腫瘤進(jìn)展過程中組織存在NED，將對(duì)常規(guī)的放化療等治療手段產(chǎn)生抵抗。已有研究證明肺癌及前列腺癌存在NED并與患者的放化療療效和預(yù)后之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[10-11]，而DTC中是否存在NED鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。

評(píng)價(jià)是否存在NED的基因主要有Syn、CgA、CD56。Syn是與突觸結(jié)構(gòu)和功能密切相關(guān)的膜蛋白，在神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞中Syn可作為一種非特異的神經(jīng)內(nèi)分泌標(biāo)志物[12]；CgA是一種位于嗜鉻性顆粒內(nèi)的親水性分泌蛋白，是良好的腫瘤進(jìn)展標(biāo)志物，具有調(diào)節(jié)機(jī)體神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)的功能[13]；CD56是一種表達(dá)于甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞和腎上腺的同型膜糖蛋白，屬免疫球蛋白超家族成員，在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，與多種腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移相關(guān)[14]，在腫瘤細(xì)胞發(fā)育和分化過程中參與細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用以及細(xì)胞與基質(zhì)之間的相互作用，調(diào)控細(xì)胞的遷移。因此本研究將納入分析CgA、CD56、Syn作為NED標(biāo)志物在病理組織中的表達(dá)情況，其中任何一個(gè)陽性即認(rèn)為有NED特征。本研究中CgA、CD56、TSHR、NIS在甲狀腺癌中均有陽性表達(dá)，Syn無陽性表達(dá)。

NIS和TSHR是參與甲狀腺碘代謝的重要蛋白。DTC術(shù)后甲狀腺激素抑制治療及131I治療的理論依據(jù)均與NIS和TSHR的表達(dá)有關(guān)。TSHR是促甲狀腺激素（thyroid-stimulating hormone，TSH）的受體，其將TSH刺激信號(hào)傳遞到甲狀腺上皮細(xì)胞內(nèi)，啟動(dòng)NIS等碘代謝基因的表達(dá)，促進(jìn)甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞攝取碘并完成甲狀腺激素的合成，對(duì)細(xì)胞的碘代謝具有重要意義[15]。DTC保留了甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞對(duì)碘的代謝功能，病灶可特異性濃聚碘，因此給予患者發(fā)射β射線的放射性131I可以達(dá)到治療轉(zhuǎn)移灶的作用。TSHR和NIS的表達(dá)對(duì)患者病灶是否攝碘及療效有重要意義。相關(guān)研究表明，DTC中NIS表達(dá)降低且在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜的定位與BRAFV600E突變有關(guān)，與性別、年齡、腫塊大小、分期等臨床特征均無關(guān)[16]。TSHR表達(dá)與腫塊大小有關(guān)，與其它臨床特征均無關(guān)。本研究表明，不同性別患者中TSHR表達(dá)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其它臨床特征的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；NIS的表達(dá)與年齡差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與其它臨床特征的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究中CgA、CD56的表達(dá)與臨床特征均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，相關(guān)研究在國內(nèi)外鮮有報(bào)道。

由于NED基因是否影響TSHR和NIS表達(dá)的研究較少。因此，本研究統(tǒng)計(jì)分析CgA、CD56、Syn表達(dá)與TSHR和NIS表達(dá)之間的關(guān)系。NIS表達(dá)是決定131I治療療效的關(guān)鍵因素，結(jié)果顯示CD56表達(dá)與NIS表達(dá)之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。有研究顯示CD56在正常甲狀腺、PTC、濾泡性腺瘤中都有不同程度的表達(dá)，但在PTC癌組織中表達(dá)陽性率低于癌旁組織[17]。

綜上所述，131I治療可以使部分肺轉(zhuǎn)移DTC患者獲益，是DTC術(shù)后治療的重要手段。部分DTC組織存在NED，其中CD56表達(dá)與NIS表達(dá)之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，CD56可能對(duì)NIS的表達(dá)發(fā)揮作用，相關(guān)機(jī)制需進(jìn)一步研究。由于組織樣本病例數(shù)目有限以及免疫組化評(píng)價(jià)方法的局限，研究結(jié)果仍然需要進(jìn)一步的研究確認(rèn)。