楊甜甜，楊少勇，侯強(qiáng)川，蔡文超，劉忠軍，郭 壯*

（1.湖北文理學(xué)院 湖北省食品配料工程技術(shù)研究中心，湖北 襄陽 441053；2.襄陽市釀酒生物技術(shù)與應(yīng)用企校聯(lián)合創(chuàng)新中心，湖北 襄陽 441053；3.湖北古襄陽酒業(yè)有限公司，湖北 襄陽 441100）

米酒又稱醪糟，是以糯米為原料，經(jīng)液化、糖化和發(fā)酵而成的中國傳統(tǒng)釀造酒之一[1]，主要分布在我國湖北省、廣西壯族自治區(qū)和四川省等地區(qū)[2]，其營養(yǎng)豐富，具有開胃提神、抗氧化和抗衰老等多種功效[3]。米酒主體香氣成分為乙酸乙酯、乳酸乙酯和β-苯乙醇，主要由微生物在米酒釀造過程中代謝生成[4]。米酒的品質(zhì)與米酒曲的微生物群落息息相關(guān)，因而有“曲為酒之骨”的說法[5-6]。米酒曲的制作通常是在開放的環(huán)境內(nèi)完成，因而其微生物菌群較為豐富，包含細(xì)菌、真菌和霉菌三個類群，其中霉菌分泌的酶可以加速谷物中的淀粉和蛋白質(zhì)等物質(zhì)的轉(zhuǎn)化，糖分在酵母菌的代謝下可進(jìn)一步生成乙醇，而以乳酸菌為代表的細(xì)菌類群則對米酒滋味品質(zhì)的形成具有重要作用[7-8]。

近年來，關(guān)于米酒曲中微生物多樣性的研究卓有成效。向凡舒等[9]對湖北省建始地區(qū)米酒曲微生物群落進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)菌以假單胞菌屬（Pseudomonas）、片球菌屬（Pediococcus）、魏斯氏菌屬（Weissella）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、腸桿菌屬（Enterobacter）、泛菌屬（Pantoea）、克雷伯菌屬（Klebsiella）和乳球菌屬（Lactococcus）為主；真菌以淀粉霉屬（Amylomyces）、復(fù)膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）和威克漢姆酵母屬（Wickerhamomyces）為主；楊春敏等[10]對海南省山蘭米酒曲的微生物多樣性進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)真菌主要以根霉屬（Rhizopus）、假絲酵母屬（Candida）、布勒擲孢酵母屬（Bullera）、擬青霉屬（Simplicillium）、曲霉屬（Aspergillus）和赤霉屬（Gibberella）為主，其中Rhizopus是酒曲中優(yōu)勢真菌屬；蔡海鶯等[11]對12種不同來源的酒曲進(jìn)行篩選和分離得到46株細(xì)菌和54株真菌，真菌主要為酵母屬（Saccharomyces）、畢赤酵母屬（Pichia）及根霉屬（Rhizopus）等。這些研究均表明米酒曲中存在豐富的微生物群落。米酒曲的質(zhì)量與地理和氣候等息息相關(guān)，不同地區(qū)的酒曲中微生物可能存在差異，然而對于不同地區(qū)米酒曲真菌多樣性比較的研究較少。

作為發(fā)酵食品微生物多樣性解析強(qiáng)有力的手段之一，Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)具有通量高和價格相對較低的優(yōu)點，已被廣泛應(yīng)用于腐乳[12-13]、白酒[14]、泡菜[15]以及酸湯[16]等發(fā)酵制品的微生物類群分析中。本研究以采集自廣西壯族自治區(qū)南寧市和湖北省孝感市的米酒曲為研究對象，采用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)對米酒曲中真菌多樣性進(jìn)行解析，以期為酒曲的復(fù)配和改善米酒品質(zhì)提供數(shù)據(jù)支撐與理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）基因組提取試劑盒：德國QIAGEN公司；10×聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（poly merase chain reaction，PCR）緩沖液、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTPs）Mix：寶生物工程（大連）有限公司；引物ITS4R/ITS3F：武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ND-2000C微量紫外分光光度計：美國NanoDrop公司；Veriti 96孔梯度PCR儀：美國ABI公司；CR21N高速冷凍離心機(jī)：日本HITACHI公司；Fluor Chem FC3化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)：美國ProteinSimple公司；Illumina MiSeq高通量測序平臺：美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集

南寧米酒曲：采集自廣西壯族自治區(qū)南寧市（107°45′～108°51′E，22°13′～22°32′N）；孝感米酒曲：采集自湖北省孝感市（113°19′～114°35′E，30°23′～31°52′N）。每個地區(qū)采集米酒曲樣本10個，合計采集20個。所有米酒曲均以糯米為原料且添加5%母曲自然發(fā)酵而成，均不添加辣蓼草等中草藥，均無蟲眼，形狀均為圓形，無異味、無霉斑且儲藏時間在2～4個月之間，均為家庭自制成品。

1.3.2 Illumina高通量測序

按照DNA提取試劑盒中的方法對研磨碎的米酒曲樣本進(jìn)行宏基因組DNA提取，以其為模板，使用引物ITS3F（5'-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3'）/ITS4R（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）參照文獻(xiàn)[17]中的方法對真菌引物內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）2區(qū)基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將合格的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行Illumina MiSeq高通量測序。

1.3.3 生物信息學(xué)分析

首先對序列進(jìn)行拼接和質(zhì)控[18]。使用QIIME（V1.9.1）分析平臺對質(zhì)控后的序列進(jìn)行分析[19-20]，利用PyNAST軟件[21]將序列標(biāo)準(zhǔn)化和對齊，接著使用兩步UCLUST法構(gòu)建操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）矩陣[22]，然后對每個OTU的代表性序列使用UNITE數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性比對[23]，以97%和100%的相似度進(jìn)行OTU劃分，將所有樣本中都存在的某一OTU定義為核心OTU。對同一測序深度下的4種α多樣性指數(shù)（香農(nóng)指數(shù)、辛普森指數(shù)、超1指數(shù)、發(fā)現(xiàn)物種數(shù)）進(jìn)行分析，同時基于UniFrac距離[24]使用主坐標(biāo)分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）對2個地區(qū)米酒曲的真菌類群進(jìn)行β多樣性解析。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

使用曼-惠特尼秩和檢驗（Mann-Whitney）和多元方差分析（multivariate analysis of variance，MANOVA）對2個地區(qū)米酒曲的差異性進(jìn)行分析；采用Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)處理；采用在線網(wǎng)頁（https：//www.omicstudio.cn/tool/24）繪制主成分分析（principal component analysis，PCA）圖；利用R軟件（V4.0.3）的waterfall軟件包繪制瀑布圖；使用Origin 8.5繪制其他圖。實驗均重復(fù)3次，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同地區(qū)米酒曲真菌類群α多樣性的比較分析

采用Illumina高通量測序技術(shù)分別對南寧和孝感地區(qū)20個米酒曲樣本進(jìn)行測序，共得到高質(zhì)量序列1 072 821條，平均每個樣本53 641條。當(dāng)測序深度為23 010條序列時，采用Mann-Whitney檢驗對2個地區(qū)米酒曲樣本的α多樣性指數(shù)（香農(nóng)指數(shù)、辛普森指數(shù)、超1指數(shù)、發(fā)現(xiàn)物種數(shù)）進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果見圖1。

圖1 不同地區(qū)米酒曲真菌菌群的α多樣性指數(shù)比較分析結(jié)果Fig.1 Comparative analysis results of α diversity indexes of fungi community in rice-wine Jiuqu from different regions

由圖1可知，2個地區(qū)米酒曲樣本的α多樣性指數(shù)差異均不顯著（P＞0.05）。由此說明，2個地區(qū)米酒曲真菌的豐富度和物種多樣性并無顯著性差異。

2.2 基于OTU水平不同地區(qū)米酒曲真菌類群的分析

以97%和100%的相似度進(jìn)行OTU劃分后，共得到1 648個OTU，南寧米酒曲樣本劃分得到（379±189）個OTU，孝感米酒曲樣本劃分得到（428±37）個OTU，各OTU出現(xiàn)次數(shù)統(tǒng)計結(jié)果見圖2。

圖2 OTU出現(xiàn)次數(shù)統(tǒng)計分析結(jié)果Fig.2 Statistical analysis results of OTU occurrence number

由圖2可知，各樣本中的OTU分布不盡相同，隨著OTU出現(xiàn)次數(shù)的增加，其所含OTU數(shù)占總OTU數(shù)的比例整體上呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，而所含序列數(shù)占總序列數(shù)的比例則呈現(xiàn)相反的趨勢。由圖2亦可知，出現(xiàn)20次的OTU占總OTU數(shù)的比例僅為0.55%，而其所含序列數(shù)占到總序列數(shù)的69.75%，這說明不同地區(qū)米酒曲樣本共有大量相同的真菌菌群，雖然各樣品特有真菌類群的物種數(shù)較多但其在各樣本的含量少。值得一提的是，1 648個OTU中核心OTU僅有9個，其相對含量瀑布圖見圖3。

圖3 核心OTU相對含量的瀑布圖Fig.3 Waterfall plot of relative content of core OTU

由圖3可知，核心OTU及其平均相對含量分別為OTU50（0.90%）、OTU3825（0.04%）、OTU3491（0.39%）、OTU3211（57.15%）、OTU3006（9.13%）、OTU2939（0.11%）、OTU2637（0.53%）、OTU494（0.98%）和OTU21607（0.51%），這9個OTU均隸屬于根霉屬（Rhizopus），這也進(jìn)一步說明Rhizopus是2個地區(qū)米酒曲中的優(yōu)勢真菌屬。

2.3 不同地區(qū)米酒曲真菌類群β多樣性的比較分析

采用基于加權(quán)和非加權(quán)的UniFrac距離對2個地區(qū)米酒曲中真菌類群的β多樣性進(jìn)行解析，結(jié)果見圖4。

圖4 基于加權(quán)距離（A）和非加權(quán)距離（B）的主坐標(biāo)分析Fig.4 Principal coordinate analysis based on weighted distance (A)and unweighted distance (B)

由圖4A可知，在考慮物種豐度的情況下，2個地區(qū)的米酒曲在空間排布上交疊明顯，且經(jīng)多元方差分析發(fā)現(xiàn)，2個地區(qū)米酒曲真菌群落結(jié)構(gòu)差異不顯著（P＞0.05）。由圖4B可知，在僅考慮真菌種類而不考慮其豐度的情況下，2個地區(qū)的米酒曲在空間排布上較分散，其中南寧地區(qū)的樣本主要位于Y軸負(fù)方向，而孝感地區(qū)樣本主要位于Y軸正方向，且經(jīng)多元方差分析發(fā)現(xiàn)，2個地區(qū)米酒曲真菌群落結(jié)構(gòu)差異顯著（P＜0.05）。由此說明，2個地區(qū)米酒曲真菌類群的差異可能主要體現(xiàn)在一些低豐度的OTU上。

2.4 不同地區(qū)米酒曲真菌菌群結(jié)構(gòu)分析

在門和屬水平上，南寧地區(qū)米酒曲中的真菌類群可被鑒定為5個門和63個屬，孝感地區(qū)米酒曲可被鑒定為4個門和23個屬，不同地區(qū)米酒曲的真菌菌群結(jié)構(gòu)見圖5。

由圖5A可知，毛霉菌門（Mucoromycota）在南寧和孝感地區(qū)米酒曲中的平均相對含量分別為78.58%和91.90%，子囊菌門（Ascomycota）的平均相對含量分別為21.18%和8.08%。由此可見，Mucoromycota和Ascomycota為2個地區(qū)米酒曲中的優(yōu)勢真菌門，經(jīng)Mann-Whitney檢驗發(fā)現(xiàn)其在南寧、孝感地區(qū)米酒曲中的平均相對含量差異顯著（P＜0.05）。

圖5 基于門（A）和屬（B）水平南寧和孝感地區(qū)米酒曲的真菌群落結(jié)構(gòu)Fig.5 Fungal community structure of rice-wine Jiuqu from Nanning and Xiaogan based on phylum (A) and genus (B) level

由圖5B可知，南寧地區(qū)米酒曲中的優(yōu)勢真菌屬分別為根霉屬（Rhizopus）（78.29%）、絲孢畢赤酵母屬（Hyphopichia）（5.52%）、畢赤酵母屬（Pichia）（4.27%）、酵母菌屬（Saccharomyces）（2.95%）、假絲酵母屬（Candida）（2.33%）、枝包酵母屬（Clavispora）（2.06%）和曲霉屬（Aspergillus）（1.40%）；而孝感地區(qū)米酒曲中的優(yōu)勢真菌屬分別為Rhizopus（82.32%）、毛霉屬（Mucor）（9.58%）、雙足囊菌屬（Dipodascus）（3.53%）和Candida（2.45%）。由此可見，2個地區(qū)的米酒曲優(yōu)勢真菌屬均以Rhizopus為主，這與圖3結(jié)果一致。已有研究結(jié)果表明，Rhizopus是米酒曲中最主要的微生物，不僅具有較強(qiáng)的糖化能力、酒化能力同時還能產(chǎn)生各種有機(jī)酸，可顯著影響米酒的風(fēng)味和質(zhì)量[25]。周金虎等[26]從4種甜酒曲中篩選出了一株高產(chǎn)淀粉酶的米根霉（Rhizopus oryzae）；姚淑敏等[27]對湖南韶山、湘潭和祁東、福建福州以及浙江麗水和蘭溪6種甜酒曲進(jìn)行真菌多樣性分析亦發(fā)現(xiàn)，樣本主要真菌類群均包含Rhizopus。

經(jīng)Mann-Whitney檢驗發(fā)現(xiàn)，Aspergillus在南寧地區(qū)米酒曲中的平均相對含量顯著偏高（P＜0.05），而Mucor在孝感地區(qū)米酒曲中的平均相對含量顯著偏高（P＜0.01）。由此可見，2個地區(qū)的米酒曲真菌類群存在一定差異。王丹丹等[28]對孝感鳳窩米酒曲的真菌多樣性研究發(fā)現(xiàn)，孝感鳳窩米酒曲中優(yōu)勢真菌為淀粉霉屬（Amylomyces）、小克銀漢霉屬（Cunninghamella）、毛霉屬（Mucor）、Saccharomycopsis、Aspergillus、Candida、擬威爾酵母屬（Cyberlindnera）和接合酵母屬（Zygosaccharomyces）。由此可見，不同地區(qū)的米酒曲其真菌類群可能存在一定的差異。

3 結(jié)論

本研究通過Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)對廣西省南寧地區(qū)和湖北省孝感地區(qū)米酒曲真菌類群的多樣性進(jìn)行分析比較，結(jié)果表明，2個地區(qū)米酒曲真菌豐富度和物種多樣性均無顯著性差異（P＞0.05），米酒曲中共有9個核心OTU，所含序列數(shù)占總序列數(shù)的69.75%，經(jīng)鑒定均隸屬于根霉屬（Rhizopus）。2個地區(qū)米酒曲的優(yōu)勢真菌門均為毛霉菌門（Mucoromycota）和子囊菌門（Ascomycota），優(yōu)勢真菌屬均以Rhizopus為主，真菌類群的差異可能主要體現(xiàn)在一些低豐度的OTU上。