田捧，郭玉琪，郭智寬

(1.鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院 a.超聲科；b.中醫(yī)科，河南 鄭州 450052；2.河南省人民醫(yī)院 婦產(chǎn)科，河南 鄭州 450003)

胎兒生長(zhǎng)受限(fetal growth restriction，F(xiàn)GR)是指足月胎兒出生體質(zhì)量小于2 500 g，或胎兒體質(zhì)量低于同孕齡平均體質(zhì)量的兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差，或低于同孕齡正常體重的第十百分位數(shù)[1]。FGR不但影響胎兒的生長(zhǎng)發(fā)育，還會(huì)導(dǎo)致青少年期的體格和智力發(fā)育受損，甚至可能發(fā)生腦性癱瘓，成年后心血管、神經(jīng)系統(tǒng)和代謝性疾病發(fā)病率升高[2-3]。很多因素可造成FGR，F(xiàn)GR的發(fā)病機(jī)制一直是產(chǎn)科、兒科等相關(guān)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。DGCR8是參與miRNA合成與成熟的重要蛋白，可調(diào)控miRNA的生成，影響miRNA對(duì)基因的調(diào)控作用[4]。miRNA是近年新發(fā)現(xiàn)的一種非編碼RNA，是一類長(zhǎng)約22個(gè)核苷酸的非編碼的單鏈RNA大家族，參與多種生物過程。近年研究表明，miRNA在生長(zhǎng)和發(fā)育中扮演著重要角色[5]。miRNA與FGR存在相關(guān)性。因此，本研究推測(cè)可以通過干預(yù)DGCR8的表達(dá)，調(diào)控miRNA的表達(dá)，分析DGCR8對(duì)胎兒生長(zhǎng)發(fā)育的影響。本研究為FGR的治療和產(chǎn)前篩查找到新的靶點(diǎn)，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和實(shí)驗(yàn)儀器DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、青霉素、硫酸鏈霉素均購自美國Life Technologies公司，胰蛋白酶、兔抗DGCR8多克隆抗體、兔抗磷酸化的細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(phospho-extracellular regulated kinase，p-ERK)多克隆抗體均購自美國Centocor公司，蛋白提取試劑盒、蛋白裂解液(radio immunoprecipitation assay，RIPA)均購自美國Pieree公司，離心機(jī)(型號(hào)M162856)、蛋白印跡電泳儀(型號(hào)BLY-DYCP-38C)、蛋白印跡轉(zhuǎn)膜儀(型號(hào)1704150)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)美國田納西大學(xué)動(dòng)物管理委員會(huì)審核通過。選用同一窩出生的14日齡的轉(zhuǎn)基因小鼠(品系批次：C57BL/6SvJ，小鼠模型由美國田納西大學(xué)科學(xué)健康中心郭玉琪與岳軍明教授聯(lián)合共建實(shí)驗(yàn)室提供)，在SPF級(jí)、溫度保持在22～28 ℃、相對(duì)濕度維持在40%～60%的動(dòng)物房飼養(yǎng)。

1.3 可誘導(dǎo)型DGCR8基因敲除小鼠的制備選用可誘導(dǎo)型的Cre轉(zhuǎn)基因小鼠，該Cre酶的表達(dá)由可誘導(dǎo)型的β-actin啟動(dòng)子控制，并含有雌激素受體序列，對(duì)他莫昔芬敏感，可通過控制他莫昔芬的劑量對(duì)小鼠進(jìn)行可誘導(dǎo)性基因敲除。將含有β-actin-Cre-ERT2啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因小鼠和DGCR8loxp/loxp小鼠交配，獲得DGCR8loxp/loxp/actin-cre和DGCR8loxp/loxp小鼠[以上小鼠的基因型均由聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)檢測(cè)確認(rèn)]。將兩種不同基因型的同一窩出生的小鼠分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行飼養(yǎng)(共選擇3窩小鼠重復(fù)實(shí)驗(yàn)，第1窩符合實(shí)驗(yàn)基因型要求的共4組8只，第2窩3組6只，第3窩3組6只)，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠均在小鼠生后第14天注射4 mg他莫昔芬(揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司，08022501)[6-7]，選擇14日齡生長(zhǎng)發(fā)育旺盛期的小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。首次稱14日齡小鼠的體質(zhì)量，以后每3 d對(duì)兩組小鼠分別進(jìn)行稱重，記錄數(shù)據(jù)。

1.4 Mef細(xì)胞的制備取基因型分別為DGCR8loxp/loxp和DGCR8loxp/loxp/actin-cre小鼠胚胎(PCR反應(yīng)檢測(cè)小鼠胚胎的基因型，體系由基因組DNA、引物、PCR buffer、25 mmol·L-1MgCl2、2 mmol·L-1dNTP、ddH2O和Taq酶組成。反應(yīng)條件為95 ℃退火，55 ℃復(fù)性，75 ℃延伸，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。所得產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，于紫外燈下觀察結(jié)果)。新鮮小鼠胚胎在37 ℃酶消化液中孵育8～10 min，在DMEM培養(yǎng)基中清洗3次，置于37 ℃，體積分?jǐn)?shù)為5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1 h，用巴氏吸管反復(fù)吹打組織，使組織塊均勻分散成細(xì)胞層，1 500 r·min-1離心5 min，棄去上清，加入DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，重復(fù)3次后，加入DMEM培養(yǎng)基(10% FBS+1%青鏈霉素)將細(xì)胞置于37 ℃，體積分?jǐn)?shù)為5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.5 Western blot在基因型為DGCR8loxp/loxp和DGCR8loxp/loxp/actin-creMef細(xì)胞中分別加入他莫昔芬，他莫昔芬按能敲除DGCR8基因的最低劑量0.5 μmol·L-1的濃度添加。待細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到80%～100%時(shí)，刮下細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管，加入80～100 μL裂解液，冰上裂解10 min，13 000 r·min-1離心10 min，取上清液保存于-80 ℃冰箱。1.5 mL離心管中加入800 μL ddH2O和200 μL Protein Assay Dye Reagent，加入1 μL蛋白樣品，混勻后用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)595 nm波長(zhǎng)條件下吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白含量。處理好的蛋白樣品，按照每孔40～100 μg上樣，濃縮膠80～100 V電泳，分離膠100～120 V電泳。電泳結(jié)束后，將蛋白樣品轉(zhuǎn)移至NC膜或PVDF膜，25 V轉(zhuǎn)膜2 h，5%脫脂乳封閉1 h，加一抗4 ℃孵育過夜，PBST洗膜3遍后加二抗孵育1 h，顯影，定影，曝光條帶。

2 結(jié)果

2.1 他莫昔芬篩選的最低劑量Western Blot結(jié)果顯示，當(dāng)加入濃度為0.5 μmol·L-1他莫昔芬時(shí)，DGCR8基因已經(jīng)被完全敲除。見圖1。

圖1 加入不同濃度的他莫昔芬處理Mef細(xì)胞48 h DGCR8基因敲除效果

2.2DGCR8基因敲除小鼠生長(zhǎng)速度DGCR8基因敲除組小鼠生長(zhǎng)發(fā)育速度低于對(duì)照組小鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1、圖2。

表1 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠體質(zhì)量比較

圖2 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠生長(zhǎng)曲線

2.3DGCR8基因敲除小鼠p-ERK1/2、PCNA蛋白表達(dá)水平Western blot結(jié)果顯示，DGCR8基因敲除組p-ERK1/2、PCNA蛋白的表達(dá)低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3、4。

圖3 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組p-ERK1/2的表達(dá)

圖4 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組PCNA的表達(dá)

3 討論

FGR是產(chǎn)科的嚴(yán)重并發(fā)癥，我國FGR的發(fā)生率為6.39%，可導(dǎo)致圍生兒發(fā)病率增高4～6倍[8]，是導(dǎo)致圍生兒死亡的主要原因之一[9]，能導(dǎo)致早產(chǎn)、窒息以及腦癱等[10]。FGR是一種復(fù)雜的疾病，其病因多樣，迄今尚未完全闡明。

DGCR8是位于人類22號(hào)染色體q11.2區(qū)域的一個(gè)等位基因，是雙鏈miRNA結(jié)合蛋白，它與RNA酶Ⅲ Drosha相互作用，促進(jìn)miRNA的成熟，影響miRNA對(duì)基因的調(diào)控作用[11]。研究顯示，miRNA參與調(diào)控胎兒發(fā)育和妊娠病理結(jié)局[12]，miRNA的表達(dá)變化與FGR、胎膜早破、子癇前期和巨大兒等妊娠病理結(jié)局密切相關(guān)[13]。Maccani等[14]研究了人類胎盤中的 107個(gè)調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)與分化的miRNA，其中miR-16、miR-21、miR-93、miR-135b、miR-146a和miR-182與胎兒生長(zhǎng)存在相關(guān)性。Mouillet等[15]對(duì)正常妊娠孕婦和妊娠合并FGR孕婦血漿中部分缺氧相關(guān)miRNAs的表達(dá)進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示，F(xiàn)GR組總miRNA表達(dá)較正常妊娠組高1.8倍。此外國內(nèi)一項(xiàng)研究顯示，miR-210可能參與了FGR的發(fā)病，循環(huán)中miR-210可作為FGR診斷的生物標(biāo)志物[16]。miRNA與FGR存在一定的相關(guān)性，循環(huán)中miRNA的表達(dá)可作為FGR診斷的生物標(biāo)志物?；谝陨侠碚摚狙芯客茰y(cè)DGCR8可能與FGR密切相關(guān)，但是目前國內(nèi)外針對(duì)DGCR8與FGR的研究尚未見報(bào)道。本研究旨在探討DGCR8基因?qū)GR的影響及其作用機(jī)制，以期為FGR尋找到新的發(fā)病機(jī)制及基因靶點(diǎn)。

細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶是絲裂原活化蛋白激酶家族成員之一，被激活后成為p-ERK，可介導(dǎo)信號(hào)由胞漿向胞核傳遞，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、分化和凋亡等多種生理過程[17]。PCNA與細(xì)胞增殖狀態(tài)高度相關(guān)，是衡量細(xì)胞增殖能力的重要標(biāo)志物[18]。本研究構(gòu)建DGCR8基因敲除小鼠并提取DGCR8基因敲除Mef細(xì)胞，結(jié)果顯示DGCR8基因敲除小鼠出現(xiàn)了生長(zhǎng)發(fā)育遲緩，DGCR8基因敲除Mef細(xì)胞中p-ERK、PCNA細(xì)胞信號(hào)通路蛋白表達(dá)下降，因此我們推測(cè)DGCR8通過調(diào)控p-ERK、PCNA的表達(dá)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化等，從而影響小鼠的生長(zhǎng)發(fā)育，DGCR8與生長(zhǎng)受限存在相關(guān)性。然而本研究只是在小鼠和細(xì)胞水平進(jìn)行了初步的驗(yàn)證，其在胎兒體內(nèi)的表達(dá)水平是否存在差異，還需要臨床實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究。

綜上所述，DGCR8基因敲除小鼠生長(zhǎng)受限，發(fā)育遲緩，DGCR8可能是通過調(diào)控Mef細(xì)胞中p-ERK、PCNA相關(guān)信號(hào)通路來發(fā)揮作用。據(jù)此，我們有望通過檢測(cè)母體血清或相關(guān)組織中DGCR8的表達(dá)，預(yù)測(cè)胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)受限，以便臨床早期采取有效的干預(yù)措施，從而為胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)受限的早期診斷、預(yù)防、治療提供新的思路。