張 鳳，林 敏，高 皋，楊曉玉

1南京醫(yī)科大學(xué)康本醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所，江蘇 南京 210029；2南京醫(yī)科大學(xué)康達(dá)學(xué)院，江蘇 連云港 222000；3南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，江蘇 南京 210029

男性不育癥是引起育齡夫婦不育的主要原因之一，有10%～15%的育齡夫婦不能生育，其中男性因素占30%～50%［1］。遺傳學(xué)異常是男性不育的重要病因之一，約占男性不育病因的30%［2］。非梗阻性無精子癥（non?obstructive azoospermia，NOA）和重度少精子癥占男性不育患者總數(shù)的10%～20%。其中，染色體核型異常和無精子因子（azoospermia factor，AZF）微缺失可解釋15%～20%的NOA 及少精子癥。

染色體核型異常包括染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)異常，染色體數(shù)目異常主要是47，XXY、47，XYY；結(jié)構(gòu)異常包括染色體缺失、易位、倒位、插入、重復(fù)和環(huán)狀染色體等［3］。染色體數(shù)目異常和結(jié)構(gòu)異常都可能會(huì)導(dǎo)致精子發(fā)生異常。Y 染色體長(zhǎng)臂上存在控制睪丸發(fā)育，精子發(fā)生及維持的區(qū)域，稱為AZF，AZF 由AZFa、AZFb 和AZFc 3 個(gè)區(qū)域構(gòu)成，AZF 微缺失可導(dǎo)致NOA 和重度少精子癥，繼而引起男性不育。重度少精子癥中7%～10%因AZF 微缺失所致，而在NOA 中這一比例上升至15%～20%［4］。本文對(duì)1 899例患者進(jìn)行染色體核型和AZF 微缺失的分析，報(bào)告如下。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象

2017年1月—2020年6月在南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖中心就診的中重度少精子癥和非梗阻無精子癥患者。入組標(biāo)準(zhǔn)：非梗阻無精子癥（精液量正常，3次離心沉淀后鏡檢未發(fā)現(xiàn)精子，睪丸體積縮小，雙側(cè)輸精管存在，促卵泡刺激素>7.6 U/L）；中重度少精子癥（2次以上精液分析精子濃度均低于5×106個(gè)/mL為重度少精子癥，精子濃度位于5×106～10×106個(gè)/mL為中度少精子癥）［5］。共入組1 899例患者，其中非梗阻無精子癥894例，重度少精子癥641例，中度少精子癥364例。所有患者均進(jìn)行染色體核型分析和AZF微缺失檢查。

1.2 方法

1.2.1 精液常規(guī)分析

按照《世界衛(wèi)生組織人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)（5 版）》［6］的精液分析標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，計(jì)算機(jī)輔助精液技術(shù)分析（江蘇瑞祺CFT?9202精子質(zhì)量檢測(cè)分析系統(tǒng)）。受檢者常規(guī)進(jìn)行精液分析，無精子癥需進(jìn)行離心沉渣確認(rèn)。

1.2.2 外周血染色體核型分析

采集患者外周血2～3 mL，肝素抗凝。無菌方式接種28～30滴抗凝血于人體外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基（廣州達(dá)暉生物技術(shù)股份有限公司）中，置于37 ℃飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)68～72 h。培養(yǎng)終止前在培養(yǎng)基中加入濃度為20 μg/mL 的秋水仙素2～3 滴（1 mL針頭垂直滴加），使最終濃度為0.04～0.08 μg/mL，37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)2.5 h 后收獲細(xì)胞。正常進(jìn)行染色體制片及G 顯帶進(jìn)行染色體核型分析，每例樣本計(jì)數(shù)30 個(gè)中期分裂相，分析計(jì)數(shù)5 個(gè)細(xì)胞核型，對(duì)于異常染色體核型分析計(jì)數(shù)100個(gè)中期分裂相。

1.2.3 AZF微缺失檢測(cè)

DNA 的提取按照血液基因柱式小量提取試劑盒說明書進(jìn)行，-20 ℃保存。AZF 微缺失檢測(cè)試劑盒由上海透景生命科技股份有限公司提供。采用兩管多重PCR 擴(kuò)增，4 個(gè)通道熒光檢測(cè)的方法，判斷AZFa 區(qū)（sY84、sY86）、AZFb 區(qū)（sY127、sY134）和AZFc 區(qū)（sY254、sY255）的3 個(gè)區(qū)域6 個(gè)序列標(biāo)簽位點(diǎn)（STS）的微缺失，同時(shí)設(shè)置2 個(gè)內(nèi)對(duì)照基因：男性性別決定基因（SRY）和編碼鋅指蛋白基因（ZFY）。

PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件：第一階段50 ℃2 min；第二階段95 ℃5 min；第三階段95 ℃15 s，60 ℃30 s，72 ℃30 s，38 個(gè)循環(huán)；第四階段72 ℃5 min。在第三階段的60 ℃時(shí)收集FAM/VIC/ROX/Cy5 信號(hào)，并保存相關(guān)文件。當(dāng)FAM 通道結(jié)果為典型的S型擴(kuò)增曲線且CT＜32，進(jìn)行結(jié)果判讀。否則實(shí)驗(yàn)失敗。

2 結(jié)果

2.1 染色體核型分析

1 899例檢出225例異常染色體核型，異常率為11.85%。其中數(shù)目異常100例（44.44%），結(jié)構(gòu)異常76例（33.78%），嵌合體10例（4.44%），多態(tài)性18例（8.00%）；46，XX性發(fā)育異常21例（9.33%）。異常染色體核型具體分布見表1。225例異常染色體核型病例臨床表現(xiàn)為無精子癥的有156例（69.33%），少精子癥的有69例（30.67%）。異常核型占比最多的是47，XXY，共檢出94例，占41.78%；其次為46，XX核型，檢出21例，占9.33%。

表1 異常染色體核型分布

（續(xù)表1）

2.2 AZF微缺失分析

1 899例進(jìn)行AZF微缺失分析，檢出215例存在AZF微缺失，缺失率為11.32%。發(fā)生缺失區(qū)域最高為AZFc區(qū)149例，缺失率為69.30%；其次為AZFb+c區(qū)缺失25例，缺失率為11.63%；AZFa+b+c 區(qū)缺失21例，缺失率為9.77%，但其染色體核型均為46，XX。215例AZF 微缺失病例臨床表現(xiàn)為NOA 病例143例，少精子癥的病例為72例（表2）。進(jìn)一步將全部病例分為3組觀察，NOA組894例，發(fā)生AZF微缺失143例（15.99%，143/894）；重度少精子癥組641例，發(fā)生AZF 微缺失63例（9.83%，63/641）；中度少精子癥組364例，發(fā)生AZF 微缺失9例（2.47%，9/364）。

表2 AZF微缺失分布 （n）

2.3 染色體核型異常合并AZF微缺失的分析

1 899例患者中共檢出染色體核型異常合并AZF微缺失的病例36例，36例患者均為NOA。21例為染色體核型46，XX 合并AZFa+b+c 缺失；12例為AZFb+c缺失合并染色體異常，主要是出現(xiàn)del（Y）和inv（Y）；AZFb 缺失1例，染色體核型為45，X（85%）/46，X，inv（Y）（q11q12）（15%）；AZFc 缺失2例，染色體核型為46，XY，inv（9）（p12q13）和45，X（40%）/46，XY（60%）（表3）。

表3 染色體核型異常合并AZF微缺失異常分布

3 討論

染色體核型異常和AZF 微缺失是導(dǎo)致男性不育的常見遺傳因素。本文對(duì)1 899例男性不育癥患者同時(shí)進(jìn)行染色體核型分析和AZF微缺失檢測(cè)，其中異常染色體核型者225例，占11.85%，這與其他學(xué)者研究基本一致［7-8］。染色體核型異常中，無精子癥156例，占69.33%，少精子癥69例，占30.67%。Klinefelter 綜合征（47，XXY）是男性不育癥患者中最常見的染色體核型異常［8-9，14］，本文檢出47，XXY患者94例，比例最高，占染色體異常核型的41.78%。47，XXY又稱為Klinefelter 綜合征，與正常男性染色體核型相比多了1條X 染色體。在男性不育癥中發(fā)生率為1/10，這類患者多因不育就診，實(shí)驗(yàn)室檢查常表現(xiàn)為無精子癥或重度少精子癥，血清睪酮明顯降低，促卵泡刺激素和促黃體生成素分泌增高［9］。染色體核型異常除Klinefelter 綜合征最為常見外，還有相對(duì)常見的1 號(hào)染色體核型異常15例，異常率6.67%（15/225）；15號(hào)染色體核型異常11例，異常率4.89%（11/225），這與其他學(xué)者報(bào)道基本一致［11-12］。

染色體結(jié)構(gòu)異常為69例，羅伯遜易位和9號(hào)臂間倒位占較大比例。羅伯遜易位在總的人群中發(fā)病率為1.23‰，在不孕人群中占1%［13］。人類羅伯遜易位發(fā)生在D、G組染色體之間，涉及13、14、15、21、22 號(hào)染色體，這5條染色體均為近端著絲粒染色體。其各號(hào)染色體之間發(fā)生羅伯遜易位在人群中是有明顯差異的，本研究中羅伯遜易位病例有17例，占受檢人數(shù)的0.89%（17/1899），der（13；14）就占了14例，也是最為常見的羅伯遜易位。由于短臂上遺傳基因不多，遺傳效應(yīng)不太明顯，因此羅伯遜易位攜帶者的表型和智力發(fā)育一般都正常。男性不育患者通常因?yàn)樯倬影Y和無精子癥而就診，其產(chǎn)生原因是由于羅伯遜易位在減數(shù)分裂時(shí)染色體交叉和聯(lián)會(huì)時(shí)異常導(dǎo)致減數(shù)分裂異常，從而各種基因組產(chǎn)生不平衡導(dǎo)致配子死亡［14］。

男性不育的遺傳學(xué)病因包括染色體畸變、Y 染色體微缺失和單基因突變等。其中以Klinefelter 綜合征、囊性纖維化跨膜介導(dǎo)的調(diào)節(jié)子基因和Y染色體微缺失最為常見［15］。Y染色體上有大量的回文序列，其內(nèi)部的非等位同源重組是Y 染色體微缺失的主要原因［16］。有些Y 染色體同源序列在X 染色體或常染色體，因此同源重組都可能導(dǎo)致Y染色體微缺失的產(chǎn)生［15，17-18］。Y 染色體長(zhǎng)臂的AZF 區(qū)是微缺失的好發(fā)區(qū)域，一般認(rèn)為AZFa 的缺失與唯支持細(xì)胞綜合征或早期的生精阻滯具有明顯的相關(guān)性，引起嚴(yán)重生精障礙；AZFb 的缺失表現(xiàn)為生精阻滯、無精子癥或少精子癥；AZFc 的缺失臨床表現(xiàn)多樣，從重度少精子癥到無精子癥都可觀察到，也是Y染色體微缺失的熱點(diǎn)區(qū)域。本文對(duì)1 899例患者進(jìn)行AZF微缺失檢測(cè)，無精子癥894例，占47.08%，少精子癥1 005例，占52.92%?？偣矙z測(cè)出215例AZF 微缺失，異常率為11.32%，與多數(shù)學(xué)者報(bào)道相近［4，19］。發(fā)生AZF 微缺失區(qū)域由高到低依次為AZFc 缺失149例（69.3%），臨床表現(xiàn)為無精子癥或重度少精子癥；AZFb+c 缺失25例（11.63%），臨床表現(xiàn)均為無精子癥；AZFa+b+c 缺失21例（9.77%），染色體核型均為46，XX，臨床表現(xiàn)為無精子癥；AZFa 缺失11例（5.11%）和AZFb 缺失9例（4.19%），除1例AZFa 部分缺失（sY86缺失）表現(xiàn)為重度少精子癥外，其余表現(xiàn)為無精子癥。

本研究中有21例AZFa+b+c 缺失的病例，染色體核型均為46，XX，根據(jù)性別決定基因（sex deter?mining region，SRY）是否缺失，又分為SRY 陽(yáng)性和SRY 陰性。既往稱之為46，XX 男性或男性性反轉(zhuǎn)綜合征，在男性新生兒中發(fā)病率約為1/20 000，患者染色體核型為46，XX，但表型為男性［20］。絕大多數(shù)SRY 陽(yáng)性患者青春期前無異常，婚后因不育和無精子癥進(jìn)行染色體檢查而被發(fā)現(xiàn)。大多數(shù)SRY 陰性患者外生殖器異常，青春期前多以尿道下裂、兩性畸形等發(fā)育問題就診［19］。本研究顯示21例46，XX患者中有15例SRY 呈陽(yáng)性，6例SRY 呈陰性，臨床表現(xiàn)都為無精子癥。有研究證明提示性別的決定和分化并不完全由SRY 基因決定，可能有位于常染色體和X 染色體上的基因參與性別表型的調(diào)控［21］。臨床上對(duì)于該類患者可以適當(dāng)進(jìn)行雄激素補(bǔ)充治療，同時(shí)輔以心理治療。對(duì)于有生育訴求的患者，建議考慮借助供精人工授精或供精體外受精。

一般建議精子濃度少于5×106個(gè)/mL 以及NOA需要檢測(cè)AZF 微缺失，本研究中無精子癥病例AZF微缺失率最高為15.99%，精子濃度低于5×106個(gè)/mL的重度少精子癥病例AZF 微缺失率為9.83%，而精子濃度在5×106～10×106個(gè)/mL 的中度少精子癥病例中也發(fā)現(xiàn)2.47% AZF 微缺失率值得引起臨床關(guān)注。染色體核型異常中，Klinefelter 綜合征94例，均沒有發(fā)現(xiàn)AZF微缺失。臨床上出現(xiàn)無精子癥，小睪丸的Klinefelter 綜合征（染色體核型為47，XXY），可以考慮不做AZF微缺失的檢查。

染色體核型檢查主要是對(duì)染色體的畸變進(jìn)行診斷，包括數(shù)目和結(jié)構(gòu)的畸變，但該技術(shù)的精確性有限，不能檢測(cè)出微小基因組片段的缺失、重復(fù)或重排。Y 染色體長(zhǎng)臂上存在與精子發(fā)生相關(guān)的候選基因，因此，開展Y染色體的AZF微缺失的檢測(cè)具有重要的臨床意義。將染色體核型分析和基因位點(diǎn)的檢測(cè)結(jié)合，對(duì)男性不育的治療及輔助生殖技術(shù)的臨床開展，具有重要的理論和實(shí)踐意義。胞漿內(nèi)單精子注射助孕則會(huì)將AZFc缺失垂直遺傳給男性子代，遺傳咨詢后可以考慮PGT性別選擇［22-23］。隨著近些年分子遺傳學(xué)的快速進(jìn)展，越來越多的非梗阻無精子癥和重度少弱精子癥被證實(shí)為單基因的致病性變異所致［24］。應(yīng)用高通量的測(cè)序技術(shù)，比如全外顯子組測(cè)序（whole?exome sequencing，WES）或基因panel已經(jīng)成功鑒定了多個(gè)致病基因，將來在臨床可能會(huì)得到廣泛應(yīng)用［25-26］。