韓 笑，王亞楠，姜金慶，范國英，李任峰，王自良

(河南科技學院 動物科技學院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

豬腸道冠狀病毒(swine enteric coronavirus，SECoV)屬于SECoV屬于尼多病毒目(Nidovirales)、冠狀病毒科(Coronaviridae)、冠狀病毒屬(Coronavirus)，是有囊膜的單股正鏈RNA病毒。病毒表面有棒狀突起，形似“日冕”或皇冠狀，大小為70～200 nm[1]。SECoV基因組含有5’端的帽子結構和3’端的Poly(A)結構，編碼四種主要結構蛋白，即纖突蛋白(Spike, S)、核衣殼蛋白(Nucleocapsid, N)、膜蛋白(Membrane, M)、包膜蛋白(Envelope, E)[2-5]。由于其RNA具有較高的重組頻率，導致病毒結構不穩(wěn)定，容易變異。目前已知的SECoV主要包括豬傳染性胃腸炎病毒(transmissible gastrogenteritis virus，TGEV)、豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)、豬德爾塔冠狀病毒(porcine deltacoronavirus，PDCoV)以及豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒(swine acute diarrhea syndrome coronavirus，SADS-CoV)[6-8]。

近年來，SECoV的流行與進化越來越復雜，毒株間和毒株內(nèi)重組現(xiàn)象加劇，防控形勢依然嚴峻[9]。本文就目前SECoV的核酸和免疫學檢測方法進行綜述，旨在為SECoV的防控提供參考依據(jù)。

1 核酸檢測技術

1.1 聚合酶鏈式反應

聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction, PCR)是一種通過體外擴增病原特定DNA序列從而對疾病進行診斷的分子生物學技術。該技術誕生于1985年，經(jīng)過不斷改進已衍生出多種體外擴增方法。Ding等[10]基于TGEV、PEDV和PDCoV的N基因、豬A型輪狀病毒(porcine rotavirus A，PRoV-A)VP7基因以及豬庫布病毒(porcine kobuvirus，PKV)和豬薩博病毒(porcine sapovirus，PSaV)的多聚蛋白基因建立了多重逆轉錄-聚合酶鏈式反應(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)檢測方法，該方法能同時檢測TGEV、PEDV、PDCoV、PRoV、PKV和PSaV六種豬腸道病毒，與豬的其他病原之間無交叉反應。隨著技術的不斷進步，熒光定量PCR(quantitative PCR，qPCR)的出現(xiàn)解決了普通PCR技術存在的難以定量、變異系數(shù)較大等問題。Pan等[11]針對PEDV、豬環(huán)曲病毒(porcine torovirus，PToV)和SADS-CoV的ORF1a區(qū)域以及PDCoV的ORF1b區(qū)域設計特異性引物和TaqMan熒光探針，建立了能夠同時檢測PEDV、PDCoV、SADS-CoV三種豬冠狀病毒和PToV的RT-qPCR方法，該方法的靈敏度可以達到100拷貝/μl。Ma等[12]根據(jù)冠狀病毒基因組M基因中的保守區(qū)域設計引物，建立了基于SYBR Green Ⅰ的RT-qPCR技術，可用于SADS-CoV的檢測和流行病學調(diào)查，其靈敏度高于基于探針的RT-qPCR和基于凝膠的常規(guī)RT-PCR方法。雙啟動子寡核苷酸(double promoter oligonucleotide, DPO)引物比常規(guī)引物特異性更強，可以減少對實驗條件的優(yōu)化以及引物與模板的錯配機率。Jia等[13]研制的基于DPO的實時RT-qPCR技術能夠實現(xiàn)對PEDV、TGEV、PRoV和PDCoV進行特異性檢測。

近年來，納米PCR作為一種新型診斷技術得到了快速發(fā)展。Zhu等[14]根據(jù)PEDV和TGEV的N基因保守區(qū)域設計兩對引物，建立了能夠同時檢測PEDV和TGEV的雙重納米PCR檢測技術，其檢測限分別達到7.6×101和8.5×101拷貝/μl，靈敏度為普通RT-PCR的10倍。Luo等[15]建立了一種基于功能化磁珠富集和特異性納米擴增技術的超靈敏納米DNA探針PCR檢測方法，其靈敏度可以達到25個拷貝/克樣品?？捎糜赑EDV和TGEV的雙重檢測。以上PCR技術為SECoV的檢測提供了有力工具，大大提升了豬場SECoV的防控效率。

1.2 環(huán)介導等溫擴增技術

2000年，日本學者Notomi開發(fā)了環(huán)介導等溫擴增技術(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)[16]。其基本原理是利用具有較強鏈置換活性的Bst DNA聚合酶和特殊設計的4條或6條引物，在60～65℃恒溫下快速擴增目的基因。Mohamed等[17]開發(fā)了一種低成本、快速、半定量的3D打印微流體RT-LAMP芯片檢測系統(tǒng)，可同時檢測PEDV、PDCoV和TGEV 3種冠狀病毒，整個檢測過程可以在30min內(nèi)快速完成，檢測結果與qRT-PCR具有很好的一致性。針對新型的豬腹瀉冠狀病毒SADS-CoV，Wang等[18]根據(jù)其病毒N基因的保守序列，建立了準確靈敏的實時RT-LAMP方法，與其他病原無交叉反應，臨床樣本檢測結果與實時RT-PCR方法一致。LAMP檢測技術具有快速、簡單、靈敏、高通量、精度高等優(yōu)點，已成為當前臨床診斷的熱點技術之一。

1.3 重組酶聚合酶擴增技術

重組酶聚合酶擴增技術(recombinase polymerase amplification, RPA)是一種新型的DNA擴增技術，利用重組酶、單鏈DNA結合蛋白和鏈置換DNA聚合酶三種酶的共同作用下，在37℃甚至常溫下快速擴增目的基因，與常規(guī)PCR相比具有更高的靈敏性，且擴增過程不需要變換溫度。Li等[19]根據(jù)PEDV和PDCoV的保守區(qū)域設計引物成功建立了針對PEDV和PDCoV雙重RT-RPA檢測方法，靈敏度為100個拷貝/μl。Wang等[20]針對TGEV的S基因設計特異性引物，開發(fā)了快速檢測TGEV的RT-RPA技術，與其他病原體無交叉反應。Gao等[21]將RPA技術與側向流免疫層析技術(later flow dipstick,LFD)相結合，建立了LFD-RPA快速檢測技術，能夠在20 min內(nèi)檢測到PDCoV病毒，其靈敏度是傳統(tǒng)PCR的10倍。靈敏度高、特異性強的LFD-RPA技術對設施匱乏地區(qū)PDCoV檢測具有重要臨床應用價值。

1.4 基因芯片技術

基因芯片技術是一種通過雜交測序的原理進行核酸檢測的方法。胡靖飛等[22]建立了能夠同時檢測PEDV、TGEV、PRoV、PDCoV四種豬腸道病毒的寡核苷酸芯片，該芯片靈敏度高，最低檢測限為106拷貝/μl，與PRRSV、PCV、CSFV、JEV、PEDV、TGEV、PRoV和PDCoV均無交叉反應。馬銳等[23]針對PEDV、TGEV和PRoV設計引物，將常規(guī)PCR與不對稱PCR兩種靶基因標記技術應用于可視化芯片，比較兩種方法對芯片雜交效率的影響，發(fā)現(xiàn)不對稱PCR可顯著提高豬腹瀉病毒可視化共檢芯片的雜交效率，為進一步提髙可視化芯片的臨床應用提供了重要參考。

2 免疫學檢測技術

2.1 中和試驗

病毒中和試驗(virusneutralization testing)是基于抗原抗體特異性結合原理檢測病毒的方法。董志珍等[24]分別采用狗直腸瘤細胞A72和豬腎細胞PK15培養(yǎng)TGEV用于中和試驗研究。結果顯示，采用A72細胞的中和試驗結果好于PK15，且與ELISA檢測結果相一致。為了避免目測對實驗結果造成的差異，Sigh等[25]開發(fā)了一種基于MTT比色法測定PEDV誘導的細胞病變檢測方法，該方法適用于病毒中和試驗和TCID50的測定，避免了通過目測細胞病變確定抗體滴度的主觀性，同時也縮短了實驗室檢測時間。基于熒光聚焦中和測定(fluorescence focusing neutralization, FFN)的方法已經(jīng)在PEDV和PDCoV的中和試驗中得到應用[26]。Zhang等[27]將PDCoV與熱滅活陽性血清在37 ℃孵育1～2 h，將其混合物添加至豬睪丸細胞(ST)或豬腎小管上皮細胞(LLC-PK1)細胞中，通過熒光染色測定其結果，該方法降低了人為因素對細胞病變判斷的誤差。

2.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗

酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)是一種較為成熟的實驗室血清學檢測方法，通過檢測抗原或抗體對病毒進行診斷。Luo等[28]基于PDCoV的M蛋白建立了間接ELISA檢測方法，該方法具有較好的特異性，不與抗TGEV、PEDV、PRV、PCV2、CSFV、PRRSV等病毒抗體發(fā)生交叉反應，能夠用于臨床樣本的檢測。S1蛋白是冠狀病毒S蛋白的亞單位，與病毒的入侵有關，其抗體能夠產(chǎn)生免疫保護，阻止病毒感染。Shan等[29]通過構建PEDV S1基因原核表達質(zhì)粒，建立了基于S1蛋白的間接ELISA方法(rS1-ELISA)，以IFA作為金標準，結果顯示rS1-ELISA具有較高的靈敏度和特異性，為PEDV的抗體檢測提供了可靠工具。Zhou等[30,31]利用熒光素酶免疫沉淀系統(tǒng)開發(fā)了一種基于SADS-CoV S1蛋白的快速ELISA抗體檢測方法，可用于SADS-CoV的早期診斷和再次爆發(fā)的流行病學調(diào)查。

抗體檢測是豬腸道冠狀病毒診斷的重要方法，納米抗體因其特異性強、親和力高等優(yōu)勢已在醫(yī)藥開發(fā)、臨床診斷等研究中得到廣泛應用[32]。Ma等[33]首次開發(fā)出一種帶有生物素PEDV納米抗體的新型阻斷ELISA方法，具有靈敏度高、特異性強的特點，可用于PEDV的臨床檢測。

為了能夠在同一樣本中區(qū)分出不同的病原，Malbec等[34]開發(fā)了一種類似固相ELISA的多重免疫分析法，通過將PEDV、TGEV和PDCoV的共同序列S1結構域構建重組蛋白并固定在96孔板，能夠在單個樣本中同時檢測多個不同的病原。該多重免疫分析法是一種有效、可靠的PEDV、TGEV和PDCoV鑒別診斷方法。

2.3 免疫層析技術

在免疫層析檢測技術(immunochromatographyassay, ICA)中，膠體金免疫層析技術應用最為廣泛，該技術具有快速、簡便、特異性強等優(yōu)點，為基層獸醫(yī)工作者供了有效的檢測手段[35]。李嘉琛等[36]采用檸檬酸鈉還原法制備膠體金顆粒，利用兩株單克隆抗體成功研制出檢測TGEV膠體金試紙條，該試紙?zhí)禺愋院?，靈敏度與RT-PCR檢測結果一致，優(yōu)于進口試紙卡。Li等[37]采用純化后的PEDV重組N蛋白與膠體金結合作為檢測線，研制出一種新的膠體金免疫試紙，能夠在10 min內(nèi)檢測特異性PEDV抗體，靈敏度和特異性均高于ELISA試劑盒。

近年來，關于PEDV的免疫層析技術發(fā)展迅速。Bian等[38]利用細胞表面熒光免疫分析技術(cell surface fluorescence immunoassay, CSFIA)制備了PEDV單克隆抗體(mAbs)，采用膠體金標記的mAb作為檢測信號，研制了一種新型的免疫層析方法，可用于豬糞便中PEDV的高靈敏檢測。Xu等[39]開發(fā)了一種基于銪納米粒子標記單克隆抗體(EuNPs-mAb)熒光探針的免疫色譜分析方法，與傳統(tǒng)熒光試紙相比，使用EuNPs時背景熒光干擾小，靈敏度提高，用于PEDV檢測時，檢測限可以達到0.218 μg/ml(2.725×103TCID50/mL)。

此外，隨著生物技術的不斷發(fā)展，蛋白質(zhì)芯片技術在豬病檢測方面逐步得到應用[40]。武鑫宇等[41]將PEDV、TGEV、PHEV三種冠狀病毒原核表達純化的N蛋白固定在芯片載體上制備出可視化蛋白芯片，能快速準確的檢測以上三種病毒，與ELISA檢測結果符合率達90%以上，具有潛在的臨床應用價值。

3 展望

SECoV引起的臨床癥狀較為相似，常出現(xiàn)兩種或兩種以上混合感染情況，而且冠狀病毒具有較強的變異性，導致診斷和防控難度加大[42,43]。因此，開發(fā)能同時鑒別不同SECoV的多重檢測技術，以及適用于基層快速檢測標準化規(guī)范化的診斷方法對SECoV的防控至關重要。

盡管通過病毒的分離和培養(yǎng)鑒定病原結果可靠，準確性高，但操作周期長，難以在基層推廣使用。分子生物學診斷技術需要特殊的實驗室環(huán)境和專業(yè)技術人員操作。免疫層析試紙由于其技術成熟，操作簡便快捷，不需要專業(yè)技術人員即可完成，非常適合于在基層使用，但在檢測靈敏度和定量方面仍需改善。同時，應加大對檢測技術的規(guī)范性和可重復性的嚴格把控，以確保檢測結果的真實可靠。未來SECoV的檢測將朝著更加便捷化、自動化、高通量和低成本方向發(fā)展，為SECoV的防控提供更加可靠的技術支撐。