邵帥銘 徐寧 徐佳元 劉維宇 楊衛(wèi)良

骨肉瘤是一種常見的間充質(zhì)來源的原發(fā)性骨惡性腫瘤，好發(fā)于青春發(fā)育期，在老年人中還有第2個小高峰[1]。該疾病好發(fā)于于脊柱、骨盆和骶骨，且單發(fā)病灶患者占大多數(shù)，惡性程度較高，早期極有可能發(fā)生肺轉(zhuǎn)移。隨著治療理念與化療水平的改進(jìn)，骨肉瘤生存率已由原先的不到30%升高到70%以上，但近幾十年來療效上沒有本質(zhì)上的提高，尤其是對轉(zhuǎn)移患者[2]。RNA干擾技術(shù)是利用雙鏈RNA高效、特異性地降解細(xì)胞內(nèi)同源信使RNA，從而阻斷特定基因表達(dá)，使細(xì)胞出現(xiàn)靶基因缺失表型[3]。小干擾RNA(siRNA)也被稱為短干擾RNA、沉默RNA、非編碼 RNA，它是生物宿主對外源侵入基因表達(dá)的雙鏈RNA進(jìn)行切割所產(chǎn)生具有特定長度(21～25 bp)和特定序列的小片段RNA。這些siRNA可以單鏈形式與外源基因表達(dá)的mRNA相結(jié)合，并誘導(dǎo)相應(yīng)mRNA降解[4]。siRNA 可用于沉默與腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移有關(guān)的基因、與腫瘤信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)基因、抗癌藥物敏感性相關(guān)基因、腫瘤細(xì)胞凋亡相關(guān)基因，以此來降低腫瘤惡性程度，提高患者預(yù)后水平[5]。本文就骨肉瘤相關(guān)小干擾RNA 研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 siRNA對骨肉瘤的調(diào)控

1.1 抑制骨肉瘤血管生成

血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是重要的促血管生成活性的生長因子，對內(nèi)皮細(xì)胞具有促有絲分裂和抗凋亡作用，可增加血管通透性，促進(jìn)細(xì)胞遷移等[6]。研究表明，骨肉瘤是一種血運(yùn)豐富的惡性腫瘤，VEGF高表達(dá)與其惡性程度及肺轉(zhuǎn)移相關(guān)[7]。缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)可調(diào)節(jié)腫瘤關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄，激活VEGF基因。Zhang等[8]通過調(diào)節(jié)VEGF表達(dá)對骨肉瘤細(xì)胞的影響研究HIF-1，將含有HIF-1 siRNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染骨肉瘤細(xì)胞SaoS-2，發(fā)現(xiàn)被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中VEGF蛋白含量及mRNA表達(dá)被明顯抑制。研究表明，巨噬細(xì)胞集落刺激因子-1(CSF-1)可募集腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAM)，而TAM會進(jìn)一步釋放VEGF，從而促進(jìn)腫瘤血管生成，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤發(fā)展[9]。葉凱山等[10]將siRNA-CSF-1轉(zhuǎn)染骨肉瘤細(xì)胞SaoS-2，并應(yīng)用蛋白免疫印跡法檢測細(xì)胞中同種異體移植炎性因子-1(AIF-1)和 Ras 相關(guān)C3肉毒素底物-1(Rac-1)的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中 AIF-1 和 Rac-1 表達(dá)水平均下調(diào)；收集轉(zhuǎn)染后細(xì)胞上清液制成條件培養(yǎng)液，培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)，結(jié)果顯示HUVEC增殖、遷移及小管形成能力均顯著降低，且VEGF和 Rac-1表達(dá)水平下調(diào)，證明干擾CSF-1表達(dá)可能通過抑制AIF-1/Rac-1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控VEGF表達(dá)，從而影響腫瘤血管生成，抑制骨肉瘤生長。Survivin蛋白是凋亡抑制蛋白家族的新成員，只表達(dá)于腫瘤和胚胎組織，且與腫瘤細(xì)胞分化增殖及浸潤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Gu等[11]使用雙重siRNA同時沉默VEGF和Survivin，發(fā)現(xiàn)與單獨(dú)抑制VEGF或Survivin相比，雙重siRNA可更顯著地抑制腫瘤血管生成，且與單靶siRNA沉默單基因相比，雙重siRNA沉默2種基因的相關(guān)作用顯著增強(qiáng)。

以上研究證明，構(gòu)建VEGF及其相關(guān)基因的siRNA可抑制骨肉瘤血管新生，從而調(diào)控骨肉瘤發(fā)生發(fā)展，有望為骨肉瘤提供一種新穎的治療策略。

1.2 抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖

研究表明，CBX3、PLK1等細(xì)胞因子及Janus激酶(JAK)/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子(STAT)等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可調(diào)控骨肉瘤細(xì)胞增殖[12]。JAK/STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及STAT3和STAT5持續(xù)激活可影響腫瘤細(xì)胞存活、增殖和侵襲，從而使JAK/STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路成為藥物開發(fā)和癌癥治療的首選靶標(biāo)[13]。研究證實， STK35在骨肉瘤細(xì)胞中較正常骨細(xì)胞中明顯過表達(dá)，將STAT3 siRNA轉(zhuǎn)染骨肉瘤細(xì)胞MG-63和HOS，發(fā)現(xiàn)可明顯抑制STK35 mRNA表達(dá)，且顯著抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖[14]。IRX2可對多種免疫系統(tǒng)細(xì)胞如樹突狀細(xì)胞(DC)、T細(xì)胞和自然殺傷性細(xì)胞起作用，從而克服腫瘤介導(dǎo)的免疫抑制作用[15]。史繼德等[16]采用IRX2-siRNA轉(zhuǎn)染骨肉瘤細(xì)胞MG-63，并用四唑鹽(MTT)比色法和流式細(xì)胞儀檢測 MG-63 細(xì)胞增殖和周期，蛋白免疫印跡法檢測JAK3和STAT5活化水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)沉默IRX2表達(dá)可顯著抑制骨肉瘤細(xì)胞MG-63增殖，促使其S期細(xì)胞比例增加，G2/M期細(xì)胞比例降低，且IRX2-siRNA可下調(diào)JAK3和STAT5活化水平，而轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-IRX2可上調(diào)IRX2 mRNA及蛋白表達(dá)，且過表達(dá)IRX2可上調(diào)JAK3和STAT5水平；進(jìn)一步采用JAK3和STAT5抑制劑處理MG-63細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染后的MG-63細(xì)胞增殖受抑制，且pcDNA3.1-IRX2誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖部分受抑制，表明IRX2-siRNA可通過JAK3/STAT5信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路作用于骨肉瘤細(xì)胞增殖。染色體盒蛋白同源物 3(CBX3)是異染色蛋白1的直系同源物之一，與基因轉(zhuǎn)錄抑制及沉默有關(guān)[17]。Ma等[18]研究發(fā)現(xiàn)，相比脂肪組織及正常骨細(xì)胞，人骨肉瘤細(xì)胞中CBX3過表達(dá)；為研究CBX3在骨肉瘤中的功能和預(yù)后價值，將CBX3-siRNA轉(zhuǎn)染人骨肉瘤細(xì)胞MG-63，發(fā)現(xiàn)骨肉瘤細(xì)胞生長明顯減少，通過流式細(xì)胞儀分析發(fā)現(xiàn)，抑制CBX3表達(dá)可誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯在G0/G1期，并促進(jìn)骨肉瘤MG-63細(xì)胞凋亡。由此表明，CBX3-siRNA可通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期停滯來實現(xiàn)抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖。此外，范兆陽等[19]將siRNA-PLK1轉(zhuǎn)染人骨肉瘤細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中PLK基因表達(dá)水平下調(diào)，且可有效抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖。因此，構(gòu)建特異性siRNA下調(diào)或抑制骨肉瘤增殖相關(guān)基因表達(dá)，對骨肉瘤細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用。

1.3 促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞凋亡

糖原磷酸化酶是細(xì)胞中糖原分解的關(guān)鍵酶，人類糖原磷酸化酶有3種同工型,分別為肝型、肌型、腦型(PYGB)[20]。先前的研究發(fā)現(xiàn)PYGB在非小細(xì)胞肺癌、胃癌等中過表達(dá)[21-22]。Zhang等[23]用PYGB siRNA 轉(zhuǎn)染PYGB過表達(dá)的人骨肉瘤細(xì)胞 MG-63和 HOS，通過蛋白免疫印跡法檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax表達(dá)，結(jié)果表明MG-63和HOS細(xì)胞中Bax明顯上調(diào)，Bcl-2明顯下調(diào)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而激活Bcl/Caspase 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，證明PYGB干擾可能通過Bcl/Caspase 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路阻滯細(xì)胞周期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。此外，Shen等[24]將TCTP siRNA通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人腎上皮細(xì)胞系(293細(xì)胞)，48 h后收獲慢病毒顆粒(Lv-shTCTP和Lv-shCon)，分別感染Saos-2和U2OS細(xì)胞，流式細(xì)胞儀分析發(fā)現(xiàn)Lv-shTCTP 組中S期細(xì)胞百分比顯著增加，而G2/M期細(xì)胞百分比隨之降低；隨后檢測一些細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子和凋亡標(biāo)記物表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)TCTP受抑制， G2/M 期相關(guān)蛋白 Cyclin B1 和 Cdc25A水平下調(diào)，但TCTP耗竭后，凋亡因子如 Bad 和 Caspase-3 斷裂被逆向上調(diào)。這些結(jié)果證實，TCTP siRNA可通過抑制CyclinB1和Cdc25A阻止細(xì)胞周期進(jìn)程，并通過誘導(dǎo) Bad和Caspase-3促進(jìn)細(xì)胞凋亡。研究表明，特殊細(xì)胞周期分裂蛋白20(CDC20)高表達(dá)與實體瘤中生存率不良相關(guān)[25]。Gao等[26]將CDC20 siRNA分別轉(zhuǎn)染到骨肉瘤細(xì)胞MG-63和U2OS中，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中CDC20蛋白水平明顯降低，且骨肉瘤細(xì)胞凋亡加速，CDC20耗竭可誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞周期停滯在G2/M期，表明CDC20抑制增強(qiáng)了骨肉瘤細(xì)胞凋亡，并誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯。

1.4 調(diào)控骨肉瘤藥物敏感性

隨著化療的不斷進(jìn)步，骨肉瘤患者5年生存率得到了極大提高，骨肉瘤一線化療通常包括順鉑、阿霉素和甲氨蝶呤聯(lián)合治療，但高劑量的化療藥物導(dǎo)致不良反應(yīng)十分明顯，所以進(jìn)行增強(qiáng)骨肉瘤對化療敏感性的研究十分必要。熱休克蛋白(HSP)是一種伴侶蛋白，可通過一系列不同應(yīng)激如熱刺激等誘導(dǎo)，并起保護(hù)細(xì)胞免受應(yīng)激作用。研究表明，HSP70與多種癌癥預(yù)后及抗癌藥耐藥有關(guān)。Mori等[27]將HSP70 siRNA轉(zhuǎn)染人骨肉瘤細(xì)胞MG-63，并將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞用順鉑處理，48 h后發(fā)現(xiàn)與對照組相比，HSP70 siRNA 轉(zhuǎn)染組HSP70 蛋白和mRNA表達(dá)均被明顯抑制，且在Hsp70 siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞中順鉑半抑制濃度(IC50)值顯著降低，證明抑制骨肉瘤細(xì)胞中HSP70表達(dá)可增強(qiáng)其對順鉑的敏感性，抑制HSP70 表達(dá)有可能為骨肉瘤化療提供新的輔助治療方法。

白細(xì)胞介素(IL)-22可能可調(diào)節(jié)骨肉瘤細(xì)胞生長。Li等[28]將IL-22 siRNA用質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染MG-63/DDP細(xì)胞及MG-63細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)IL-22 siRNA可顯著降低MG-63/DDP細(xì)胞活力并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，IL-22 siRNA可下調(diào)Bcl-2和磷酸化STAT3蛋白表達(dá)，上調(diào)Bax表達(dá)，并切割Caspase-3，且顯著降低順鉑IC50值；將IL-22過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MG-63細(xì)胞，結(jié)果顯示過表達(dá)IL-22可顯著增加MG-63細(xì)胞中順鉑IC50值，增加MG-63細(xì)胞活力，抑制細(xì)胞凋亡，上調(diào)Bcl-2和磷酸化STAT3表達(dá)，下調(diào)Bax和Caspase-3表達(dá)。這表明IL-22可通過調(diào)節(jié)STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路影響骨肉瘤細(xì)胞活力和凋亡，從而影響骨肉瘤細(xì)胞對順鉑的敏感性。但未來仍需進(jìn)一步研究確定IL-22表達(dá)水平與骨肉瘤細(xì)胞中順鉑IC50值之間的關(guān)系。

Copine1(CPNE1)是高度保守的鈣依賴性磷脂結(jié)合蛋白，可能在調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和膜運(yùn)輸中起作用。Jiang等[29]將CPNE siRNA轉(zhuǎn)染人骨肉瘤細(xì)胞后，用2種計量的順鉑和阿霉素分別處理轉(zhuǎn)染后的MG-63細(xì)胞，結(jié)果顯示CPEN1可減弱這兩種藥物對 Saos-2細(xì)胞增殖的抑制作用，為CPNE抑制劑與一線化療藥物聯(lián)合治療骨肉瘤提供了直接證據(jù)。

1.5 抑制骨肉瘤細(xì)胞侵襲能力

四跨膜蛋白是具有4個跨膜結(jié)構(gòu)域的膜蛋白家族，人類中已知 33 種四跨膜蛋白，包括CD9、CD63、CD81、CD82和CD151等。Mizoshiri等[30]研究發(fā)現(xiàn)，CD81在骨肉瘤細(xì)胞，尤其是骨肉瘤細(xì)胞143B中高表達(dá)；應(yīng)用基因工程技術(shù)構(gòu)建3種siCD81，將其轉(zhuǎn)染人骨肉瘤細(xì)胞MG-63/143B，發(fā)現(xiàn)3種siCD81分子在所有測試的細(xì)胞類型中均顯著抑制 CD81 mRNA表達(dá)，并通過MTT比色法及傷口愈合實驗發(fā)現(xiàn)被 siCD81 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞增殖受顯著抑制，且48 h后遷移能力受顯著抑制，證明siCD81對于骨肉瘤遷移具有明顯的抑制作用。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)是一種生物多肽生長因子，其可促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞生長。Chen等[31]通過將BMP-2 siRNA轉(zhuǎn)染人骨肉瘤細(xì)胞MG-63，發(fā)現(xiàn)骨肉瘤侵襲能力受到明顯抑制。

2 siRNA應(yīng)用存在的問題

siRNA臨床應(yīng)用中主要存在的難題是開發(fā)將 siRNA傳遞至靶細(xì)胞安全有效的方法，以及如何對靶組織施用具有生物活性的siRNA。目前siRNA遞送主要有局部遞送和全身遞送2個有效途徑，已研究出如基于脂質(zhì)的納米顆粒(LNP)、N-乙酰半乳糖胺共軛siRNA系統(tǒng)(GalNAc-siRNA)和靶向 RNA干擾分子(TRiM)平臺等多種遞送系統(tǒng)來克服siRNA傳遞障礙。但siRNA傳遞中仍存在許多挑戰(zhàn)，siRNA 具有很高的特異性，可以實現(xiàn)所需的靶標(biāo)沉默，但它們可能會產(chǎn)生諸如多種類型脫靶效應(yīng)、由于脫靶效應(yīng)造成的siRNA 長期安全性隱患、siRNA 免疫原性、納米載體長期安全性、全身性 siRNA 傳遞中的非特異性肝臟吸收及由于疾病異質(zhì)性造成的單個siRNA沉默1種特定致癌基因可能不足以有效地引起長期腫瘤抑制等問題[32]，尚需進(jìn)一步研究。

3 展望

自RNA干擾發(fā)現(xiàn)以來，學(xué)者們對基因沉默治療某些疾病表現(xiàn)出了極大的興趣與期望，在了解和利用基因沉默技術(shù)方面已取得顯著進(jìn)展。骨肉瘤是骨科中最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，siRNA不僅有望為骨肉瘤提供一種全新的革命性治療方法，而且有降低骨肉瘤耐藥性的可能，且與傳統(tǒng)化療相比，siRNA治療不良反應(yīng)極小。上述研究證明，通過siRNA誘導(dǎo)基因沉默可對骨肉瘤發(fā)生發(fā)展調(diào)控，且對骨肉瘤治療有巨大的應(yīng)用前景，但目前尚無一種安全、高效的治療方法投入臨床中。如何設(shè)計一種安全、穩(wěn)定、可攜帶多種siRNA及化療藥物或其他治療劑的遞送系統(tǒng)，是減少化療藥物劑量、降低不良反應(yīng)的關(guān)鍵，需進(jìn)一步探索研究。