張 媛，常思源

（1.南京鐘鼎生物技術(shù)有限公司研發(fā)部，江蘇 南京 210034 ；2.南京科技職業(yè)學(xué)院生命健康學(xué)院，江蘇 南京 210048）

噬菌體是能夠侵襲細(xì)菌、真菌、藻類、放線菌或螺旋體等微生物的一類病毒的總稱。噬菌體的基因組中含有許多個(gè)基因。所有已知的噬菌體均是由細(xì)菌細(xì)胞中利用細(xì)菌的核糖體、蛋白質(zhì)合成時(shí)所需的各種因子、各種氨基酸和能量產(chǎn)生系統(tǒng)來(lái)實(shí)現(xiàn)其自身的生長(zhǎng)和增殖。噬菌體具有嚴(yán)格的宿主特異性，只寄居在易感宿主的菌體內(nèi)。噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)是一項(xiàng)新的基因工程抗體制備技術(shù)。該技術(shù)在人源性抗體克隆、抗體技能改造、抗體基因研究等方面發(fā)揮著重要的作用。在對(duì)噬菌體抗體庫(kù)進(jìn)行篩選的過(guò)程中，按照噬菌體抗體庫(kù)的具體分類選擇合適的篩選方法尤為重要。通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）等基因工程的方法，能夠?qū)κ删w進(jìn)行擴(kuò)增，以獲得抗體的可變區(qū)和/ 或恒定區(qū)，然后利用酶連或重組技術(shù)將目的基因構(gòu)建至特定的噬菌粒載體中，使外源基因與噬菌體的核衣殼蛋白Ⅲ或Ⅷ融合表達(dá),進(jìn)而可直接展示在噬菌體核衣殼表面獲得的噬菌體抗體庫(kù)。有研究表明，外源多肽或蛋白的基因主要與噬菌體的DNA 融合表達(dá)，基因與表型之間是一一對(duì)應(yīng)的關(guān)系。因此，直接通過(guò)對(duì)篩選獲得的噬菌體DNA 進(jìn)行一代測(cè)序即可獲得抗體基因序列的具體信息，進(jìn)而為新藥及疫苗的研制奠定基礎(chǔ)[1]。本研究主要是探討噬菌體抗體庫(kù)的分類與篩選方法。

1 噬菌體抗體庫(kù)的分類

按照抗體庫(kù)的來(lái)源可將噬菌體抗體庫(kù)分為免疫噬菌體抗體庫(kù)和非免疫噬菌體抗體庫(kù)兩大類。免疫噬菌體抗體庫(kù)來(lái)源于經(jīng)過(guò)免疫接種動(dòng)物的組織或血清。非免疫噬菌體抗體庫(kù)來(lái)源于未經(jīng)過(guò)免疫接種動(dòng)物的組織或血清。非免疫噬菌體抗體庫(kù)除了可直接通過(guò)動(dòng)物的組織或血清獲得，還可通過(guò)半合成或全合成的方式獲得[2]。

1.1 免疫噬菌體抗體庫(kù)

免疫噬菌體抗體庫(kù)是指從獲取細(xì)胞免疫或體液免疫(包括但不局限于注射疫苗、感染微生物、罹患腫瘤性疾病等)后的個(gè)體上獲得的抗體庫(kù)。通過(guò)免疫壓力的篩選，可大大地增加免疫噬菌體抗體庫(kù)中特異性抗體的豐度，不需要很大的庫(kù)容即可篩選到針對(duì)特異性抗原的抗體。目前，市面上有大量的商業(yè)化免疫抗體庫(kù)制備試劑盒，包括Amersham Pharmacia的RPAS 小鼠ScFv 庫(kù)構(gòu)建試劑盒。該試劑盒是從RPAS 小鼠脾臟或骨髓瘤細(xì)胞中擴(kuò)增獲得的ScFv 基因庫(kù)。該試劑盒不適用于檢測(cè)弱免疫原性的抗原、免疫個(gè)體自身的抗原或者有毒性的抗原,其應(yīng)用受到一定的限制。

1.2 非免疫噬菌體抗體庫(kù)

免疫噬菌體抗體庫(kù)是從獲取細(xì)胞免疫或體液免疫后的動(dòng)物組織中擴(kuò)增獲得特異性抗體，而非免疫噬菌體抗體庫(kù)是不需動(dòng)物獲取細(xì)胞免疫或體液免疫后獲得的抗體庫(kù)。按照噬菌體抗體庫(kù)可變區(qū)的組成情況，非免疫噬菌體抗體庫(kù)可分為以下3 類：1）天然噬菌體抗體庫(kù)。天然噬菌體抗體庫(kù)中所有抗體庫(kù)的可變區(qū)均來(lái)源于未經(jīng)免疫動(dòng)物的B 淋巴細(xì)胞。2）半合成噬菌體抗體庫(kù)。此類抗體庫(kù)中一部分可變區(qū)的序列是通過(guò)人工化學(xué)合成獲得，另一部分可變區(qū)的序列則來(lái)源于未經(jīng)免疫動(dòng)物的B 淋巴細(xì)胞。3）全合成噬菌體抗體庫(kù)?？贵w庫(kù)中所有可變區(qū)的序列均是通過(guò)人工化學(xué)合成的方式獲得。在構(gòu)建非免疫噬菌體抗體庫(kù)的過(guò)程中，所有抗體的來(lái)源均可不經(jīng)過(guò)細(xì)胞免疫或體液免疫的作用。因此，非免疫噬菌體抗體庫(kù)中針對(duì)特異性抗原的抗體的比例較低。Mondon 等[3]的報(bào)道中稱，2007 年非免疫噬菌體抗體庫(kù)的庫(kù)容已經(jīng)普遍達(dá)到了1011的水平。從理論上分析，只要非免疫噬菌體抗體庫(kù)的庫(kù)容足夠大，就可以篩選到任何特異性抗體，但為了獲得針對(duì)特異性抗原的抗體，建議構(gòu)建特異性非免疫噬菌體抗體庫(kù)。

2 噬菌體抗體庫(kù)的篩選方法

噬菌體抗體庫(kù)篩選方法的選擇，可在很大程度上決定能否從其中篩選出所需的特異性抗體。影響噬菌體抗體庫(kù)篩選過(guò)程的因素包括（但不局限于）以下情況：抗體庫(kù)本身的庫(kù)容、重復(fù)率、存放條件、擴(kuò)增方法及篩選方法[4]。噬菌體抗體庫(kù)篩選方法的選擇，需根據(jù)所需抗原的具體性質(zhì)而定。按照篩選抗原的純度，噬菌體抗體庫(kù)的篩選方法可分為純化抗原篩選法和非純化抗原篩選法兩大類。

2.1 純化抗原篩選法

純化抗原篩選法是指采用純化過(guò)的抗原進(jìn)行抗體庫(kù)篩選的方法。該篩選法具有效率高、特異性強(qiáng)、流程簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，是目前被普遍使用的噬菌體抗體庫(kù)的篩選方法。純化抗原篩選法分為固相篩選法和液相篩選法兩種：1）固相篩選法是將純化后的抗原，直接包被在酶標(biāo)條或免疫管等固相介質(zhì)上投入抗體庫(kù)中，經(jīng)過(guò)若干輪的篩選、富集后獲得特異性抗體的方法。固相篩選法具有操作簡(jiǎn)單、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，是最常用的抗體庫(kù)篩選方法。2010 年Han DG 等[5]采用固相篩選法對(duì)噬菌體抗體庫(kù)進(jìn)行了4 輪的篩選、富集后，成功地獲得了抗EGFRv Ⅲ的特異性噬菌體抗體庫(kù)。在采用固相篩選法對(duì)噬菌體抗體庫(kù)進(jìn)行篩選時(shí)，可通過(guò)多種調(diào)整包被密度及洗脫強(qiáng)度的方法獲得不同親和力的抗體，且包被的密度越高、洗脫的強(qiáng)度越大，獲得抗體的親和力就越高。在采用固相篩選法對(duì)噬菌體抗體庫(kù)進(jìn)行篩選時(shí)，還可通過(guò)增加競(jìng)爭(zhēng)性抗體的方法進(jìn)行篩選調(diào)整。2001 年Bracci等[6]將煙堿乙酰膽堿受體增加到篩選體系中，使其與噬菌體抗體進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性篩選后，獲得了抗蛇毒的 sc Fv 抗體。固相篩選法的缺點(diǎn)是：⑴由于抗原的包被附著在固相介質(zhì)的表面上,部分表位極易受到影響而丟失特異性抗體。⑵在對(duì)抗體庫(kù)進(jìn)行篩選的過(guò)程中，對(duì)抗原的需求較大,較難根據(jù)抗體、抗原的性質(zhì)進(jìn)行相應(yīng)的量化處理。2）液相篩選法。目前，在對(duì)噬菌體抗體庫(kù)進(jìn)行液相篩選時(shí)，一般采用以下兩種方法：⑴對(duì)抗原進(jìn)行生物素標(biāo)記，再利用生物素與鏈霉親和素相結(jié)合的原理，將抗原包被在偶聯(lián)的鏈霉親和素磁珠上，然后對(duì)噬菌體抗體庫(kù)進(jìn)行篩選。⑵對(duì)抗原進(jìn)行生物素標(biāo)記后，將其放入噬菌體抗體庫(kù)中，讓抗原與抗體進(jìn)行配對(duì)結(jié)合，將反應(yīng)后的產(chǎn)物加入到偶聯(lián)的鏈霉親和素磁珠中進(jìn)行篩選。與固相篩選法相同，液相篩選法也可通過(guò)多種調(diào)整包被的密度和洗脫的強(qiáng)度獲得親和力不同的抗體，且包被的密度越高、洗脫的強(qiáng)度越大，獲得抗體的親和力就越高。與采用固相篩選法相比，采用液相篩選法對(duì)噬菌體抗體庫(kù)進(jìn)行篩選的優(yōu)勢(shì)是：1）抗原和抗體的運(yùn)動(dòng)相對(duì)自由，可使其結(jié)合得更加充分。2）抗原在液相環(huán)境中能夠保持自身的空間構(gòu)象，可避免受到抗原表位的影響。液相篩選法的缺點(diǎn)是：⑴在對(duì)抗原進(jìn)行生物素標(biāo)記時(shí)，一些潛在的、能夠與特異性抗體結(jié)合的抗原表位可能出現(xiàn)失活的現(xiàn)象。⑵偶聯(lián)在磁珠上的鏈霉親和素可能會(huì)與非特異抗體相結(jié)合。陳瑛煒等[7]將帶有His-tag的抗原與噬菌體抗體庫(kù)進(jìn)行混合反應(yīng)后,再將反應(yīng)產(chǎn)物通過(guò)鎳柱進(jìn)行純化洗脫,獲得了特異性噬菌體抗體，從而解決了上述問(wèn)題。

2.2 非純化抗原篩選法

非純化抗原篩選法包括細(xì)胞篩選法和組織或體內(nèi)篩選法兩種。1）細(xì)胞篩選法。在無(wú)法獲得足夠量的抗原或抗原的免疫原性較弱、性質(zhì)不確定時(shí)，不能直接采用抗原-抗體結(jié)合的方式進(jìn)行篩選，需采用完整的細(xì)胞對(duì)噬菌體抗體庫(kù)進(jìn)行篩選。由于完整細(xì)胞的膜蛋白、表面蛋白可以保證抗原維持完整的天然構(gòu)象，故采用完整的細(xì)胞對(duì)抗體庫(kù)進(jìn)行篩選獲得的抗體更符合后續(xù)的需求。在采用細(xì)胞篩選法對(duì)抗體庫(kù)進(jìn)行篩選時(shí)，可使用貼壁細(xì)胞或懸浮細(xì)胞。采用貼壁細(xì)胞對(duì)抗體庫(kù)進(jìn)行篩選的過(guò)程與采用固相篩選法對(duì)抗體庫(kù)進(jìn)行篩選的流程類似。采用懸浮細(xì)胞對(duì)抗體庫(kù)進(jìn)行篩選的流程與采用液相篩選法對(duì)抗體庫(kù)進(jìn)行篩選的流程相似。雖然細(xì)胞篩選法更加符合蛋白的天然構(gòu)象，但因細(xì)胞的表面存在大量的非相關(guān)蛋白質(zhì)、脂類、糖類等其他成分，可能會(huì)發(fā)生目的蛋白與非特異性噬菌體抗體相結(jié)合的現(xiàn)象。一般情況下，目的蛋白在細(xì)胞表面的含量較低，如進(jìn)行篩選的批次較多，則易丟失特異性抗體。2008 年Taipa 等[8]采用磁性細(xì)胞分選器（magnetic cell sorter，MACS）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分選，方法是：將陽(yáng)性細(xì)胞包裹在MACS 中的磁珠上，加入大量的陰性細(xì)胞，再加入能夠與特異性噬菌體結(jié)合的陽(yáng)性細(xì)胞，隨后通過(guò)磁珠快速地進(jìn)行分離篩選。2）組織內(nèi)或體內(nèi)篩選法。細(xì)胞培養(yǎng)存在一定的局限性，許多細(xì)胞往往無(wú)法進(jìn)行體外培養(yǎng)。部分細(xì)胞雖可進(jìn)行體外培養(yǎng)，但體外環(huán)境的改變會(huì)使細(xì)胞膜表面的蛋白發(fā)生變化，使其與在體內(nèi)環(huán)境中培養(yǎng)的膜蛋白構(gòu)象出現(xiàn)較大的差異，進(jìn)而無(wú)法有效地觀察到抗體的結(jié)合。與進(jìn)行體外篩選相比，在組織內(nèi)或體內(nèi)對(duì)噬菌體抗體進(jìn)行篩選，能夠保持抗體本身自然的三維環(huán)境，更加適用于對(duì)腫瘤組織及器官上細(xì)胞特異性標(biāo)志物的抗體進(jìn)行篩選[9]。有研究表明，將待篩選的噬菌體抗體通過(guò)尾靜脈注射的方式注入到小鼠的體內(nèi)，這些抗體會(huì)通過(guò)小鼠自身的血液循環(huán)作用分布至其全身，其血液中的非特異性抗體會(huì)逐漸被稀釋、清除，而特異性抗體則能夠結(jié)合在不同的組織、器官中。通過(guò)分離其相應(yīng)的組織或器官的細(xì)胞可對(duì)特異性抗體進(jìn)行洗脫、富集，獲得特異性噬菌體抗體。2000 年Johns 等[10]通過(guò)組織內(nèi)或體內(nèi)篩選法成功地從內(nèi)皮細(xì)胞中獲得了特異性噬菌體抗體庫(kù)。1997年Tordson 等[11]采集了黑色素瘤的組織樣本，將其制備成冰凍組織切片，通過(guò)幾輪的平移后進(jìn)行篩選、富集，獲得了針對(duì)黑色素瘤的特異性噬菌體抗體庫(kù)。但是，組織內(nèi)或體內(nèi)篩選法具有一定的局限性，即進(jìn)行篩選的過(guò)程無(wú)法在體內(nèi)完成，故不能對(duì)非特異性結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行封閉處理，致使抗體與組織結(jié)合的背景復(fù)雜，隨意性較強(qiáng)。

3 小結(jié)

噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、高效等特點(diǎn)，其應(yīng)用的前景廣泛。目前，篩選噬菌體抗體庫(kù)的方法雖然較多，但這些篩選方法的效率卻普遍不高。因此，需在今后的研究中進(jìn)一步優(yōu)化噬菌體抗體庫(kù)的篩選方法，以提高篩選噬菌體抗體庫(kù)的效率，進(jìn)而為新藥的研發(fā)及疫苗的研制提供幫助。