彭立

摘 要：目的：選擇高效液相色譜法對(duì)糧油制品中黃曲霉毒素B1展開快速測(cè)定。方法：提取、凈化并濃縮樣品中黃曲霉毒素B1后，確定流動(dòng)相為乙酸銨溶液（5 mmol/L）、乙腈-甲醇溶液（50︰50），以梯度洗脫程序?yàn)橐罁?jù)，采取液相色譜法展開測(cè)定，定量使用外標(biāo)法。結(jié)果：在濃度范圍為0.2～20 ng/mL時(shí)，黃曲霉毒素B1線性回歸方程為Y=68 577.3X-20 845，R>0.998，線性關(guān)系良好;方法檢出限為0.07 μg/kg、定量限為0.2 μg/kg;加標(biāo)回收率超過85.0%，RSD不超過5.5%。結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)方法結(jié)果準(zhǔn)確可靠、重復(fù)性好，可用于快速檢測(cè)糧油制品中黃曲霉毒素B1。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜法;糧油食品;黃曲霉毒素;含量測(cè)定

Determination of Aflatoxin in Cereals， Oils and Foods by HPLC

PENG Li

（Yichun Grain and Oil Quality Supervision and Inspection Station， Yichun 336000）

Abstract： objective： to develop an HPLC method for the rapid determination of aflatoxin B1 in grain and oil products. Methods： after extraction， purification and concentration of aflatoxin B1 in the sample， the mobile phase was determined as ammonium acetate solution （5 mmol/L） and acetonitrile methanol solution （50：50）. Based on the gradient elution procedure， the determination was carried out by liquid chromatography， and the external standard method was used quantitatively. Results： In the concentration range of 0.2～20 ng/mL， the linear regression equation of aflatoxin B1 was， and the linear relationship was good; The detection limit was 0.07 μg/kg，limit of quantitation 0.2 μg/kg;The recovery rate of standard addition is more than 85.0%，and the RSD is not more than 5.5%.Conclusion： the results of this method are accurate， reliable and reproducible.It can be used for the rapid determination of aflatoxin B1 in grain and oil products.

Keywords： high performance liquid chromatography; grain， oil and food; aflatoxin; content determination

黃曲霉與寄生曲霉等菌株在特定溫濕度條件下會(huì)產(chǎn)生黃曲霉毒素，屬于一類二級(jí)代謝產(chǎn)物，此類毒素對(duì)人體有強(qiáng)烈致癌危害。黃曲霉毒素包含黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2，其中毒性最強(qiáng)的為黃曲霉毒素B1。由于自然環(huán)境中存在的黃曲霉毒素相對(duì)較多，且對(duì)人類的危害性極高，因此有必要做好相關(guān)的控制工作。目前，在檢測(cè)黃曲霉毒素時(shí)多選擇液相色譜法、金標(biāo)試紙法、酶聯(lián)免疫法及液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法等。其中，高效液相色譜法具備極高的靈敏度和可觀的準(zhǔn)確性，能夠精確定量黃曲霉毒素，因此被廣泛應(yīng)用于食品中黃曲霉毒素的檢測(cè)。本文選擇免疫親和柱凈化-高效液相色譜技術(shù)測(cè)定糧油食品中黃曲霉毒素B1。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇、乙腈（色譜級(jí)）;乙酸銨（分析純）;0.22 μm

微孔有機(jī)濾膜;黃曲霉毒素免疫親和柱;黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液（2 μg/mL）。實(shí)驗(yàn)用糧油樣品獲取自近期本地市場(chǎng)抽樣。

1.2 儀器與設(shè)備

液相色譜儀（Agilent 1260）;電子天平（梅特勒ME204E型）;渦旋混合器（vortex genie2）;臺(tái)式高速離心機(jī)（TG16）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 配制標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液

精準(zhǔn)量取黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入適量甲醇稀釋為100 ng/mL濃度的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

1.3.2 配制標(biāo)準(zhǔn)工作液

分別量取0.20 μL、2.00 μL、5.00 μL、10.00 μL、20.00 μL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液置于樣品瓶?jī)?nèi)，加入初始比例流動(dòng)相定容，完成濃度分別為0.20 ng/mL、2.00 ng/mL、5.00 ng/mL、10.00 ng/mL、20.00 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制。

1.3.3 樣品提取

精準(zhǔn)稱取5.00 g糧油樣品置于離心管（50 mL），加入甲醇-水溶液（70︰30）25.0 mL，渦旋混勻后轉(zhuǎn)移至超聲波儀內(nèi)持續(xù)20 min提取后，再持續(xù)10 min離心（6 000 r/min），收集上清液，待凈化。

1.3.4 樣品凈化

精準(zhǔn)量取上清液5.0 mL，加入含1%吐溫-20的磷酸鹽緩沖溶液20 mL并混勻，待免疫親和柱原有液體恢復(fù)至室溫并流進(jìn)后，用注射器裝載上述樣液，控制下滴流速為1.0 mL/min，全部下滴后用水淋洗免疫親和柱（分2次，共計(jì)耗水20 mL）[1-2]。待滴完水后抽干免疫親和柱，用甲醇洗脫免疫親和柱（分2次，共計(jì)使用甲醇2 mL），控制下滴流速為1.0 mL/min，用氮吹管裝載收集的洗脫液，50 ℃下氮?dú)獯蹈珊?，殘?jiān)贸跏急壤鲃?dòng)相（1 mL）溶解后，過0.22 μm微孔有機(jī)濾膜并轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣小瓶?jī)?nèi)，待測(cè)。

1.3.5 色譜條件

選擇Shim-pack GIST C18色譜柱，100 mm×2.1 mm，2 μm;40 ℃柱溫，0.3 mL/min柱流量，10 μL進(jìn)樣體積[3]。流動(dòng)相A、B分別為乙酸銨溶液（5 mmol/L）、乙腈-甲醇溶液（50︰50）.表1為梯度洗脫程序。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性方程及相關(guān)性

根據(jù)1.3.1和1.3.2的步驟完成標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制，檢測(cè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，參照對(duì)應(yīng)化合物濃度（X）和目標(biāo)化合物響應(yīng)峰面積（Y）獲取黃曲霉毒素B1線性回歸方程為Y=68 577.3X-20 845，線性范圍為0.2～20 ng/mL，R>0.998。

2.2 方法檢出限

精準(zhǔn)量取適量的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，移至空白樣品溶液內(nèi)，加入初始流動(dòng)相逐級(jí)稀釋，以檢出限為信噪比S/N=3為根據(jù)，通過計(jì)算獲取0.07 μg/kg的黃曲霉毒素B1檢出限，以定量限為信噪比S/N=10為根據(jù)，通過計(jì)算獲取0.2 μg/kg的黃曲霉毒素B1定量限。

2.3 加標(biāo)回收率及重現(xiàn)性

分別精準(zhǔn)稱取空白糧油樣品5.00 g，共計(jì)18份，圍繞1 ng/mL、4 ng/mL、15 ng/mL的水平對(duì)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備分別進(jìn)行6次加標(biāo)，通過處理檢測(cè)后得到黃曲霉毒素B1加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。加標(biāo)回收率超過85.0%，RSD處于2.8%～5.5%，見表2。

2.4 實(shí)際樣品測(cè)定

為對(duì)該方法實(shí)用性與可靠性展開驗(yàn)證，參照上述實(shí)驗(yàn)方法對(duì)2種能力驗(yàn)證樣品及3種市場(chǎng)糧油制品進(jìn)行前處理后，獲取黃曲霉毒素B1含量測(cè)定結(jié)果，見表3。根據(jù)兩種能力驗(yàn)證樣品中測(cè)定的黃曲霉毒素B1含量結(jié)果得知，Z比分?jǐn)?shù)為-0.83，|Z|≤2，結(jié)果滿意，證實(shí)了該方法的準(zhǔn)確性。以《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量》（GB 2761—2017）中有關(guān)谷物及其制品、油脂及其制品中規(guī)定的黃曲霉毒素B1為5.0～20 μg/kg、10～20 μg/kg的安全限量為根據(jù)，市場(chǎng)糧油制品測(cè)定結(jié)果中的黃曲霉毒素B1含量與國(guó)家安全限量標(biāo)準(zhǔn)相符合。

2.5 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

經(jīng)提取、凈化后的糧油制品，結(jié)合高效液相色譜法檢測(cè)黃曲霉毒素B1，獲取的結(jié)果與國(guó)家安全限量標(biāo)準(zhǔn)相符合，加標(biāo)回收率超過85.0%，RSD處于2.8%～5.5%。實(shí)際樣品檢測(cè)中，結(jié)果滿意，證實(shí)了方法準(zhǔn)確性。本實(shí)驗(yàn)方法結(jié)果準(zhǔn)確可靠、重復(fù)性好，可用于快速檢測(cè)糧油制品中黃曲霉毒素B1。

3 討論與結(jié)論

3.1 檢測(cè)方法選擇

目前，可用于檢測(cè)黃曲霉毒素的方法有很多，如膠體金試紙條法、酶聯(lián)免疫吸附法、高效液相色譜法、薄層色譜法及免疫親和柱-溴化熒光分光光度法等。其中，由于薄層色譜法會(huì)消耗大量溶劑，且重現(xiàn)性不太可觀，因此在檢測(cè)黃曲霉毒素中并不太適用[4]。膠體金試紙條法與酶聯(lián)免疫吸附法一般在快速篩查黃曲霉毒素中應(yīng)用，液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法能夠同時(shí)檢測(cè)多種真菌毒素，然而因本身需要使用過于昂貴的儀器，會(huì)產(chǎn)生較高的使用成本，故而也不太適用。免疫親和柱無(wú)需消耗太多有機(jī)溶劑，且特異性強(qiáng)、機(jī)制干擾少、靈敏度高，在多種復(fù)雜基質(zhì)樣品中適用，在精確定量及確認(rèn)黃曲霉毒素中十分適用[5]。因此，本試驗(yàn)在綜合對(duì)比多種方法的優(yōu)劣后，最終選擇了免疫親和柱凈化-高效液相色譜技術(shù)對(duì)糧油食品中的黃曲霉毒素B1展開測(cè)定。

3.2 樣品前處理優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)樣品中黃曲霉毒素時(shí)，在樣品前處理方面多以手動(dòng)凈化的方式為主[6]。但是該凈化方式涉及了過于煩瑣的過程，且會(huì)消耗大量時(shí)間，每天能夠完成的樣本處理量較少，面對(duì)較大樣品量時(shí)會(huì)暴露出人為因素影響大、時(shí)效性低等不足。而通過免疫親和柱在線凈化高效液相色譜法的應(yīng)用，能將上述不足有效彌補(bǔ)，大幅提升檢測(cè)時(shí)效性，且能為檢測(cè)結(jié)果提供準(zhǔn)確性保障。

3.3 流動(dòng)相選擇

以標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.22—2016中洗脫程序?yàn)楦鶕?jù)，以甲醇-乙腈和水、乙腈-水、甲醇-乙腈和0.5 mmol/L乙酸銨溶液為對(duì)象，對(duì)比流動(dòng)相組合洗脫效果[7]。其中，甲醇-乙腈洗脫效率更顯著，洗脫時(shí)間更短。通過乙酸銨溶液的添加，能獲取對(duì)稱性良好的峰型，出峰時(shí)間更穩(wěn)定，單個(gè)樣品測(cè)試時(shí)間更短。因此，在綜合對(duì)比多種流動(dòng)相的優(yōu)劣后，本實(shí)驗(yàn)中確定流動(dòng)相為甲醇-乙腈（50︰50）溶液和乙酸銨溶液（0.5 mmol/L）。

3.4 提取劑選擇

本次實(shí)驗(yàn)前對(duì)提取劑選擇甲醇-水溶液和乙腈-水溶液時(shí)的提取效果展開對(duì)比分析，分析得到兩者之間不存在明顯差異，確定提取劑為成本相對(duì)更低的甲醇-水[8]。

參考文獻(xiàn)

[1]李麗，吳宇，王海波，等.全自動(dòng)免疫親和固相萃取超高效液相色譜法測(cè)定糧油中黃曲霉毒素[J].中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2020，35（7）：165-172.

[2]李宗師.糧油食品中黃曲霉毒素檢測(cè)技術(shù)研究[J].現(xiàn)代食品，2020（5）：132-133.

[3]唐志峰，盧錦永.糧油食品中黃曲霉毒素的檢測(cè)方法[J].現(xiàn)代食品，2017（1）：80-81.

[4]甘仁榕，彭瀏宇，肖靖松，等.超高效液相色譜法檢測(cè)花生油中4種黃曲霉毒素的含量[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2016，26（8）：1109-1111.

[5]任宏彬，賈曉婷，楊曉偉，等.高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速檢測(cè)糧油制品中黃曲霉毒素B1的含量[J].食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，2019，10（19）：6438-6442.

[6]田爾諾，杜馨，蔡俊.有機(jī)溶劑萃取-高效液相色譜法檢測(cè)玉米漿中黃曲霉毒素B1[J].食品工業(yè)科技，2018，39（23）：267-271.

[7]楊柳，王朝仁，楊黎耀，等.冷凍-離心凈化-高效液相色譜法測(cè)定植物油中黃曲霉毒素B1[J].中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2020，35（1）：169-175.

[8]林玉娜，羅曉燕，朱惠揚(yáng)，等.廣州市市售糧油食品中黃曲霉毒素B1的污染調(diào)查分析[J].醫(yī)學(xué)動(dòng)物防制，2019，35（7）：86-88.