史朝為，石 攀，田長麟

非天然氨基酸在蛋白質(zhì)動(dòng)態(tài)特性核磁共振研究中的應(yīng)用

史朝為，石 攀，田長麟*

中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)合肥微尺度物質(zhì)科學(xué)國家研究中心，生命科學(xué)學(xué)院，安徽 合肥 230027

核磁共振（NMR）是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析的主要方法之一．除可獲得蛋白質(zhì)的高分辨結(jié)構(gòu)外，NMR還可用于觀測(cè)最接近生理?xiàng)l件的蛋白質(zhì)動(dòng)態(tài)構(gòu)象，獲得蛋白質(zhì)行使生物學(xué)功能的詳細(xì)機(jī)制．非天然氨基酸定點(diǎn)標(biāo)記方法可顯著減少大分子量蛋白質(zhì)的信號(hào)數(shù)目，降低數(shù)據(jù)采集和分析難度，已廣泛運(yùn)用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能研究．本文介紹了常用的在蛋白質(zhì)中引入非天然氨基酸的實(shí)驗(yàn)方法，包括蛋白質(zhì)化學(xué)合成法、蛋白質(zhì)化學(xué)修飾法、氟代芳香族氨基酸插入和基因密碼子編輯的位點(diǎn)特異性插入等方法，并介紹了部分應(yīng)用非天然氨基酸結(jié)合NMR研究大分子量蛋白的成功案例．此外，此篇綜述討論了目前非天然氨基酸標(biāo)記在蛋白質(zhì)研究中的局限性及發(fā)展方向．

液體核磁共振；固體核磁共振；非天然氨基酸；大分子量蛋白質(zhì)

引 言

近年來，隨著設(shè)備開發(fā)和技術(shù)進(jìn)步，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)生物學(xué)取得了跨越式發(fā)展．如同步輻射光源提供可調(diào)波長的穩(wěn)定強(qiáng)光，可大大提高X-射線晶體衍射解析蛋白結(jié)構(gòu)的效率；直接電子探測(cè)器的發(fā)明和圖像處理技術(shù)的發(fā)展，使得利用冷凍電鏡解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的方法進(jìn)入到原子分辨率水平．然而，僅解析靜態(tài)三維結(jié)構(gòu)無法完美地解釋大多數(shù)蛋白質(zhì)的分子機(jī)制和生物學(xué)作用．蛋白質(zhì)在行使功能時(shí)同時(shí)存在多種構(gòu)象，不同構(gòu)象的相互轉(zhuǎn)化實(shí)現(xiàn)了諸如酶催化、配體識(shí)別、信號(hào)傳遞和生物分子機(jī)器組裝等重要生命活動(dòng)[1]．核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）是獲得原子分辨率蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)信息的三種主要方法之一，除了高分辨率結(jié)構(gòu)解析外，NMR還可用以獲得蛋白質(zhì)在常溫近生理?xiàng)l件下的動(dòng)力學(xué)信息，這些動(dòng)態(tài)變化過程也是絕大多數(shù)蛋白質(zhì)行使功能的重要途徑．結(jié)合特殊的選擇性同位素氨基酸殘基標(biāo)記方案和先進(jìn)的數(shù)據(jù)采集分析方法，液體NMR可研究的蛋白質(zhì)的分子量上限也因此成倍增加．但在超大蛋白體系中，仍然存在NMR譜峰過多、譜峰展寬、分辨率較低的情況，從而影響構(gòu)象信息的進(jìn)一步獲?。?/p>

在蛋白質(zhì)關(guān)鍵位點(diǎn)引入非天然氨基酸，通過觀測(cè)非天然氨基酸標(biāo)記在蛋白質(zhì)中的NMR信號(hào)，可獲得蛋白質(zhì)在相關(guān)生命活動(dòng)中的構(gòu)象變化．自然界中氫原子和氟原子的旋磁比大、NMR信號(hào)強(qiáng)，是比較理想的NMR觀測(cè)對(duì)象．氟原子在生物分子結(jié)構(gòu)中極少存在，無觀測(cè)背景信號(hào)，是理想的NMR觀測(cè)探針．而氫原子NMR信號(hào)更強(qiáng)，但蛋白質(zhì)中氫原子多，需設(shè)計(jì)特殊官能團(tuán)，以使得非天然氨基酸上待觀測(cè)氫原子的化學(xué)位移與蛋白質(zhì)上氫原子化學(xué)位移的分布存在顯著差異；或利用相鄰原子的同位素標(biāo)記，通過選擇性相關(guān)譜獲得特殊標(biāo)記位置的氫原子信號(hào)．非天然氨基酸標(biāo)記的方法已成功運(yùn)用到抗菌肽、膜蛋白、病毒衣殼等等蛋白的研究中．

本文將簡要概括近年來常用的非天然氨基酸的標(biāo)記方法，包括蛋白質(zhì)化學(xué)合成法、蛋白質(zhì)化學(xué)修飾法、氟代芳香族氨基酸插入和基因密碼子編輯的位點(diǎn)特異性插入的生物合成法等，以及這些方法在蛋白質(zhì)研究中的應(yīng)用．

1 非天然氨基酸標(biāo)記方法

1.1 肽鏈化學(xué)合成法

固相多肽合成（solid-phase peptide synthesis，SPPS）方法由Merrifield在1963年提出，通過固相樹脂作為載體固定合成的多肽中間體，極大簡化液相反應(yīng)模式中的分離步驟[2]．此方法由肽鏈羧基端到N端的合成順序，逐個(gè)將氨基酸殘基接入肽鏈．利用微波輔助多肽固相合成技術(shù)[3]及連續(xù)流式多肽固相合成技術(shù)[4]，這一方法可用于合成含近百個(gè)氨基酸殘基的肽鏈，這一過程已在商用多肽合成儀上實(shí)現(xiàn)[圖1(a)]．

肽鏈的化學(xué)合成具有很高的靈活性，可在肽鏈中插入多種多個(gè)非天然氨基酸．此方法多運(yùn)用于抗菌肽以及毒素多肽等小分子量蛋白質(zhì)的研究中．雖然清華大學(xué)劉磊教授課題組[5]發(fā)展了酰肼連接法，將化學(xué)方法合成肽鏈的長度延長到近五百個(gè)氨基酸殘基，但大分子量蛋白的正確折疊仍然是巨大的挑戰(zhàn)，這也限制了化學(xué)合成方法在大蛋白質(zhì)研究中的廣泛應(yīng)用．

圖1 在蛋白質(zhì)中引入非天然氨基酸的標(biāo)記方法．紅色為核磁共振可檢測(cè)的氨基酸或原子核，藍(lán)色為天然非標(biāo)記氨基酸

1.2 氨基酸殘基側(cè)鏈化學(xué)修飾法

通過對(duì)蛋白質(zhì)中氨基酸殘基的修飾，可在氨基酸殘基側(cè)鏈上連接NMR可觀測(cè)的同位素標(biāo)記基團(tuán)．最常用的方式是利用半胱氨酸殘基側(cè)鏈，以二硫鍵或碳硫鍵方式連接含氟化合物，如三氟乙硫醇（2,2,2-trifluoroethanethiol，TFET）[6]、溴三氟丙酮（3-bromo-1,1,1-trifluoroacetone，BTFA）[7]和溴三氟甲基乙酰苯胺（2-bromo-4-trifluoromethyl-acetanilide，BTFMA）[8]等等．

用谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶可以將谷氨酰胺殘基的側(cè)鏈氨基與溶液中的銨離子置換，也可以將三氟乙胺（2,2,2-trifluoroethylamine，TFEA）連接在谷氨酰胺殘基的側(cè)鏈，用于檢測(cè)氟原子[9]．用氰基硼氫化物（cyanoborohydride）可將13C標(biāo)記的甲醛鏈接在賴氨酸的側(cè)鏈胺基上[10]，通過13C原子過濾，即可通過標(biāo)記位點(diǎn)的1H-13C二維相關(guān)譜觀測(cè)蛋白質(zhì)的構(gòu)象[圖1(b)]．

1.3 類天然氨基酸插入的生物合成法

若非天然氨基酸與天然氨基酸在結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)方面極其相似，如個(gè)別氫原子被替換成氟原子，此非天然氨基酸仍可被細(xì)胞內(nèi)的氨酰tRNA合酶識(shí)別，將其插入到細(xì)胞合成的蛋白質(zhì)中．將芳香族氨基酸芳環(huán)上的氫原子替換成氟原子，對(duì)其空間結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)影響較小，使得生物合成法成為可能．常用于此方法的非天然氨基酸包括3F-苯丙氨酸（Phe）[11]、4F-苯丙氨酸（Phe）[12]、3F-酪氨酸（Tyr）[13]、5F-色氨酸（Trp）[14]和6F-Trp[15]等等．草甘膦（glyphosate）可抑制芳香族氨基酸的合成，在無機(jī)細(xì)胞培養(yǎng)基中加入草甘膦和芳香族非天然氨基酸，即可在重組表達(dá)的蛋白質(zhì)中高效引入這些非天然氨基酸[16][圖1(c)]．

1.4 基因密碼子編輯的位點(diǎn)特異性插入的生物合成法

核酸中的四種堿基構(gòu)成64種三聯(lián)密碼子，其中61種密碼子編碼20種天然氨基酸．另外的三種密碼子不編碼氨基酸，其中琥珀密碼子作為終止密碼的使用頻率極低．菌中編碼酪氨酸的氨酰tRNA合酶對(duì)tRNA識(shí)別結(jié)構(gòu)域較小，密碼子結(jié)合區(qū)域缺失，所以對(duì)密碼子的改變不敏感[17]．因此可修改tRNA上識(shí)別三聯(lián)密碼子的配對(duì)堿基，實(shí)現(xiàn)對(duì)琥珀密碼子的識(shí)別．同時(shí)修改氨酰tRNA合酶的氨基酸識(shí)別結(jié)構(gòu)域，通過篩選獲得正交氨酰tRNA合酶/tRNA對(duì)，實(shí)現(xiàn)利用琥珀密碼子編碼非天然氨基酸的目的[18]．最終在重組表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞中導(dǎo)入所改造的tRNAUAG及氨酰tRNAUAG合酶基因，即可在蛋白質(zhì)特定位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)非天然氨基酸的定點(diǎn)插入，最終獲得單一氨基酸位點(diǎn)的信號(hào)，無需進(jìn)一步信號(hào)歸屬[圖1(d)]．

2 非天然氨基酸在大分子量蛋白質(zhì)NMR研究中的應(yīng)用實(shí)例

2.1 氨基酸殘基側(cè)鏈化學(xué)修飾法的應(yīng)用

蛋白質(zhì)中還原性半胱氨酸側(cè)鏈化學(xué)活性較高、易被修飾，常被用于連接含氟基團(tuán)用于NMR檢測(cè)．目前國際上已有多個(gè)課題組將含有CF3基團(tuán)的化合物，如TFET、BTFA、BTFMA，連接到蛋白質(zhì)中，應(yīng)用NMR線寬分析、飽和轉(zhuǎn)移等實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行蛋白質(zhì)的功能狀態(tài)分布和交換速率等動(dòng)態(tài)特性檢測(cè)．另外，13CH3標(biāo)記的賴氨酸和13CH3標(biāo)記的甲硫氨酸也廣泛應(yīng)用到蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化分析中．

諾貝爾獎(jiǎng)獲得者Kurt Wuthrich課題組[6,19]通過二硫鍵將TFET定點(diǎn)引入到G蛋白偶聯(lián)受體-2腎上腺素受體（2AR）中，2AR既可以偶聯(lián)G蛋白，也可以結(jié)合-arrestin蛋白．應(yīng)用TFET定點(diǎn)19F標(biāo)記方法分析了不同類型配體對(duì)2AR的調(diào)節(jié)作用．激動(dòng)劑的結(jié)合會(huì)使受體跨膜螺旋VI的構(gòu)象朝G蛋白激活的狀態(tài)移動(dòng)，而-arrestin偏向的配體結(jié)合會(huì)對(duì)受體跨膜螺旋VII的構(gòu)象變化產(chǎn)生影響．這一標(biāo)記方法也成功應(yīng)用在A2A腺苷受體（A2AAR），以及在糖代謝和糖尿病發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用的胰高血糖素樣肽受體（GLP-1R）和胰高血糖素受體（GCGR）上．Wang等[20]運(yùn)用19F NMR方法動(dòng)態(tài)揭示了A2AAR不同構(gòu)象狀態(tài)的動(dòng)態(tài)集合，并測(cè)定了不同構(gòu)象狀態(tài)間的交換速率，同時(shí)分析了變構(gòu)調(diào)節(jié)劑NAM NNC0640對(duì)GLP-1R的變構(gòu)調(diào)控作用．

北京大學(xué)金長文教授課題組[21]與Brian Lobilka教授合作，應(yīng)用13C標(biāo)記的甲醛與賴氨酸反應(yīng)標(biāo)記2AR，研究了2AR對(duì)下游信號(hào)分子Gs和Gi蛋白的選擇性構(gòu)象變化．該研究分別采集了2AR各賴氨酸標(biāo)記位點(diǎn)在反向激動(dòng)劑卡拉洛爾（carazolol）、無配體結(jié)合狀態(tài)（apo）、激動(dòng)劑BI167107結(jié)合狀態(tài)以及激動(dòng)劑BI167107和G蛋白同時(shí)結(jié)合狀態(tài)的1H-13C HSQC譜圖，根據(jù)NMR波譜分析，激動(dòng)劑BI167107穩(wěn)定的受體構(gòu)象狀態(tài)與結(jié)合了下游G蛋白的構(gòu)象狀態(tài)不同．2AR的胞內(nèi)第二個(gè)loop環(huán)（ICL2）偶聯(lián)Gs和Gi后構(gòu)象發(fā)生顯著差異．受體的ICL2在與Gs的激活作用中起到關(guān)鍵作用，是決定下游信號(hào)通路（Gs和Gi）選擇性的關(guān)鍵因素．

相比傳統(tǒng)的NMR標(biāo)記方法，氨基酸側(cè)鏈標(biāo)記在研究大分子量蛋白質(zhì)，尤其是膜蛋白的動(dòng)態(tài)特性方面有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，很大程度上簡化了NMR譜圖，方便了NMR信號(hào)的歸屬，并能夠針對(duì)性的對(duì)某些氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行動(dòng)態(tài)性質(zhì)分析．

2.2 類天然氨基酸插入的生物合成法的應(yīng)用

氨基酸苯環(huán)上的19F修飾在蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)研究中也有廣泛應(yīng)用，含氟的芳香族類似物受電子特性影響最大，由于蛋白質(zhì)周圍環(huán)境的影響，19F NMR化學(xué)位移會(huì)發(fā)生顯著變化．對(duì)5F-Trp標(biāo)記的半乳糖結(jié)合蛋白的研究發(fā)現(xiàn)，在變性條件下19F NMR化學(xué)位移向低場(chǎng)移動(dòng)[22]．3F-Tyr標(biāo)記方法被成功運(yùn)用到綠色熒光蛋白的活性和變性狀態(tài)研究中[23]，以及Fyn酪氨酸激酶SH3結(jié)構(gòu)域的溶劑暴露研究和多肽結(jié)合分析中[24]．

中國科學(xué)院精密測(cè)量科學(xué)與技術(shù)創(chuàng)新研究院的李從剛研究小組應(yīng)用3F-Tyr標(biāo)記結(jié)合19F NMR直接觀測(cè)到了爪蟾卵母細(xì)胞中鈣調(diào)蛋白（CaM）的構(gòu)象轉(zhuǎn)換．在生理?xiàng)l件下，大部分CaM處于Apo狀態(tài)，僅在高濃度Ca2+存在的條件下，CaM才與Ca2+結(jié)合．實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：信號(hào)通路的激活受不同Ca2+濃度下CaM靶標(biāo)的相對(duì)親和力調(diào)節(jié)[25]．應(yīng)用6F-Trp和3F-Tyr標(biāo)記的A34F GB1蛋白研究了細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用，揭示了大腸桿菌的胞內(nèi)擁擠程度更高，但復(fù)合物二聚體在真核爪蟾細(xì)胞中比在大腸桿菌細(xì)胞中更穩(wěn)定[26]，并應(yīng)用5F-Trp標(biāo)記方法研究了GB1蛋白在細(xì)胞內(nèi)的擴(kuò)散行為[27]．

含氟的芳香族類似物對(duì)蛋白質(zhì)構(gòu)象擾動(dòng)較小，能夠進(jìn)行蛋白質(zhì)中多位點(diǎn)的19F引入，但由于19F原子在苯環(huán)上運(yùn)動(dòng)受限，含氟的芳香族氨基酸類似物在大分子量蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)分析應(yīng)用中有一定局限．

2.3 基因密碼子編輯的位點(diǎn)特異性插入法的應(yīng)用

三氟甲基苯丙氨酸（tfmF）是最早通過擴(kuò)展基因密碼子方法引入蛋白質(zhì)并運(yùn)用NMR研究的非天然氨基酸，它能夠被特異性引入到蛋白質(zhì)的特定位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的位點(diǎn)特異性動(dòng)態(tài)特性分析．基因密碼子擴(kuò)展目前也是應(yīng)用最廣泛的非天然氨基酸定點(diǎn)引入方法，已受到國內(nèi)外很多研究者的關(guān)注．中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)田長麟課題組應(yīng)用19F-標(biāo)記的tfmF實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的定點(diǎn)同位素標(biāo)記，并結(jié)合NMR方法研究了大分子量蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)復(fù)合物或膜蛋白在不同功能狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系，包括水溶性蛋白vinexin SH3結(jié)構(gòu)域和膜蛋白DAGK的19F定點(diǎn)標(biāo)記和動(dòng)力學(xué)分析[28,29]，膜蛋白DAGK的溶劑暴露行為[30]；并利用位點(diǎn)19F特異性非天然氨基酸標(biāo)記結(jié)合19F弛豫增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)對(duì)多結(jié)構(gòu)域蛋白的構(gòu)象辨認(rèn)[31]；應(yīng)用19F位點(diǎn)特異性標(biāo)記和固體NMR相結(jié)合的技術(shù)對(duì)膜蛋白DAGK進(jìn)行了研究[32]．

tfmF在表觀遺傳相關(guān)蛋白質(zhì)的NMR研究中也有重要作用．蛋白質(zhì)構(gòu)象變化及動(dòng)態(tài)特性對(duì)DNA甲基化修飾的功能闡述起著至關(guān)重要的作用．田長麟課題組與徐彥輝課題組合作通過tfmF定點(diǎn)標(biāo)記方法，分析了與多種癌癥密切相關(guān)的甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT3A蛋白多個(gè)不同位點(diǎn)在甲基化或非甲基化組蛋白H3片段存在情況下的NMR波譜，確認(rèn)了DNMT3A蛋白只受非甲基化H3蛋白的功能調(diào)控[圖2(a)][33]．MLL家族蛋白（MLL1/2/3/4，SET1A/B）是一類特異性針對(duì)H3K4的甲基轉(zhuǎn)移酶，需要多個(gè)輔助蛋白WDR5、RBBP5、ASH2L組成復(fù)合體行使功能．田長麟課題組與雷鳴課題組合作應(yīng)用19F非天然氨基酸定點(diǎn)標(biāo)記和NMR方法分析得知RBBP5-ASH2L能夠顯著地使MLL SET-I結(jié)構(gòu)固定在一種活性構(gòu)象，這種活性構(gòu)象有利于底物和輔因子的結(jié)合，從而增強(qiáng)MLL的甲基轉(zhuǎn)移酶活性[圖2(b)][34]．Nedd4家族E3連接酶是細(xì)胞生長和增殖的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，并且在人類癌癥和其他疾病中經(jīng)常被錯(cuò)誤調(diào)節(jié)．Nedd4 E3s的連接酶活性通過自身抑制嚴(yán)格控制．然而，人們對(duì)Nedd4 E3自身抑制和激活的分子機(jī)制知之甚少．田長麟課題組與溫文玉課題組合作應(yīng)用19F非天然氨基酸定點(diǎn)標(biāo)記和NMR方法協(xié)助分析了Nedd4家族E3鏈接酶Itch自抑制激活機(jī)制[圖2(c)][35]．

G蛋白偶聯(lián)的受體可以通過G蛋白或者Arrestin介導(dǎo)信號(hào)通路，研究發(fā)現(xiàn)不同的Arrestin構(gòu)象也與不同的下游蛋白相偶聯(lián)，將胞外刺激轉(zhuǎn)化為胞內(nèi)信號(hào)．王江云課題組與田長麟課題組合作運(yùn)用19F NMR及非天然氨基酸定點(diǎn)插入的方法，研究得知Arrestin可以通過N端磷酸化位點(diǎn)來識(shí)別特異的受體磷酸化條形碼，并產(chǎn)生特異性的構(gòu)象變化，從而選擇不同下游蛋白信號(hào)通路，并提出了受體磷酸化編碼“笛子模型”[36]（圖3）．王江云研究員和孫金鵬教授合作發(fā)展了4-三甲基硅基苯丙氨酸（TMSiPhe）的非天然氨基酸特異性標(biāo)記方法（DeSiPher），應(yīng)用晶體學(xué)揭示了非天然氨基酸氨酰合酶對(duì)TMSiPhe的選擇性識(shí)別機(jī)制．利用TMSiPhe特有的1H NMR化學(xué)位移和靈敏度，檢測(cè)了不同配體結(jié)合GPCR后調(diào)控下游蛋白arrestin的多重構(gòu)象狀態(tài)[37]，并應(yīng)用DeSiPher技術(shù)說明了GPCR單磷酸化位點(diǎn)缺陷可引起arrestin遠(yuǎn)端功能結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象變化[38]．

圖3 一維19F NMR數(shù)據(jù)顯示不同受體磷酸識(shí)別碼引發(fā)阻遏蛋白不同構(gòu)象變化[36]

氟原子在生物體中的豐度極低，沒有背景氟原子信號(hào)，因此氟原子可作為細(xì)胞內(nèi)原位檢測(cè)的高效NMR探針．中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)田長麟課題組還運(yùn)用19F tfmF實(shí)現(xiàn)了大分子量膜蛋白的原位NMR分析．大腸桿菌酪氨酸激酶（tyrosine kinase，ETK）是一個(gè)含有兩個(gè)跨膜螺旋和胞內(nèi)一段可溶性激酶催化結(jié)構(gòu)域的膜蛋白（圖4）．應(yīng)用位點(diǎn)特異性非天然氨基酸標(biāo)記方法在ETK的活性位點(diǎn)引入F2-Tyr，并在蛋白質(zhì)不用純化的情況下，加入聚苯乙烯馬來酸酐（styrene maleic acid，SMA）化合物形成納米尺寸的磷脂盤結(jié)構(gòu)（lipodisq），應(yīng)用超高速魔角旋轉(zhuǎn)的固體19F NMR方法，原位測(cè)定ETK的磷酸化[39]．在大腸桿菌中也實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞有絲分裂中重要激酶MEKK3、MEK5的共表達(dá)和多位點(diǎn)19F標(biāo)記，在細(xì)胞裂解液條件下獲得兩個(gè)蛋白的原位19F NMR光譜，并分析了蛋白質(zhì)復(fù)合物界面[40]．

圖4 一維固體19F NMR譜測(cè)定大腸桿菌酪氨酸激酶（ETK）的磷酸化水平[39]

通過基因密碼子編輯的非天然氨基酸定點(diǎn)引入方法在大分子量蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)分析中發(fā)揮巨大的作用，能夠在特定蛋白質(zhì)的特定位點(diǎn)進(jìn)行非天然氨基酸標(biāo)記，得到簡化的NMR圖譜，從而進(jìn)行蛋白質(zhì)特定結(jié)構(gòu)域、特定功能區(qū)的動(dòng)態(tài)特性研究．目前國際上越來越多的課題組將基因密碼子擴(kuò)展技術(shù)從原核細(xì)胞體系逐步發(fā)展到真核細(xì)胞表達(dá)體系中，應(yīng)用基因密碼子編輯的非天然氨基酸定點(diǎn)引入方法將有越來越復(fù)雜的蛋白質(zhì)機(jī)器能夠進(jìn)行非天然氨基酸標(biāo)記．

3 非天然氨基酸在蛋白質(zhì)NMR研究中的應(yīng)用展望

3.1 標(biāo)記方法的發(fā)展

盡管非天然氨基酸標(biāo)記已成功運(yùn)用在大蛋白體系的研究中，但各種標(biāo)記方法均存在自己的短板．化學(xué)合成大蛋白效率低、成本極高；化學(xué)修飾的效率受蛋白質(zhì)構(gòu)象和空間位阻影響，蛋白核心區(qū)修飾效率較低．生物合成方式克服了上述兩個(gè)缺點(diǎn)，成本低、標(biāo)記穩(wěn)定性高．基于拓展密碼子編碼的非天然氨基酸插入技術(shù)更是大大提高了引入位點(diǎn)的特異性．但目前基于生物合成插入的非天然氨基酸主要是芳香族氨基酸類似物，還沒有可靠的其他類別的氨基酸插入方法．蛋白與底物和配體的結(jié)合不僅僅靠芳香氨基酸的相互作用，更多的氫鍵、鹽鍵需要親水氨基酸和帶電氨基酸的參與．因此，應(yīng)當(dāng)發(fā)展更多類別的探針，適用于不同類別氨基酸的殘基的研究，減少對(duì)蛋白功能的影響．同時(shí)提高非天然氨基酸插入效率，實(shí)現(xiàn)多位點(diǎn)、不同種類非天然氨基酸的插入，提高單個(gè)樣品提供的信息量，同時(shí)降低樣品制備成本．

3.2 與高轉(zhuǎn)速魔角旋轉(zhuǎn)固體NMR方法的結(jié)合

非天然氨基酸標(biāo)記可顯著減少大分子量蛋白中的可觀測(cè)信號(hào)個(gè)數(shù)，大大降低信號(hào)歸屬難度．但隨著蛋白質(zhì)分子量變大，蛋白質(zhì)分子在溶液中的自由翻滾變慢．原子間的偶極耦合（ΗD～ [3cos2-1]*-3）不能及時(shí)被完全平均掉，導(dǎo)致譜線變寬．即使通過非天然氨基酸標(biāo)記方法，減少了信號(hào)數(shù)目，但信號(hào)仍然仍會(huì)變寬減弱．魔角旋轉(zhuǎn)固體NMR方法讓樣品繞與靜磁場(chǎng)54.7?的軸高速旋轉(zhuǎn)，使得（3cos2-1）因子為0，從原理上突破樣品分子量的限制，只受魔角轉(zhuǎn)速的影響．只要旋轉(zhuǎn)角速度足夠大即可有效平均偶極耦合和化學(xué)位移各向異性對(duì)核磁信號(hào)的影響[41]．因此可用于超大蛋白分子機(jī)器特定位點(diǎn)的觀測(cè)，進(jìn)一步可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞原位環(huán)境中的觀測(cè)．

麻省理工的Mei Hong研究組的研究結(jié)果表明，20～40 kHz的中低魔角轉(zhuǎn)速條件下即可有效平均19F原子的化學(xué)位移各向異性，以及周圍氟原子或氫原子對(duì)其偶極相互作用，獲得高分辨率19F NMR譜圖，實(shí)現(xiàn)高效的氟原子同核或異核之間的磁化傳遞[42,43]．蛋白質(zhì)中氫原子密度高，偶極相互作用強(qiáng)，目前商用魔角探頭最大轉(zhuǎn)速為111 kHz，已能有效觀測(cè)蛋白質(zhì)主鏈區(qū)域氫的信號(hào)，但蛋白質(zhì)側(cè)鏈氫原子密度大，尤其是甲基氫原子信號(hào)分辨率仍然較低[44]．受限于音障，更高的轉(zhuǎn)速需要設(shè)計(jì)更小的轉(zhuǎn)子，樣品倉體積只能設(shè)計(jì)的更小，限制了信號(hào)強(qiáng)度．目前轉(zhuǎn)速可達(dá)111 kHz的0.7 mm轉(zhuǎn)子，樣品倉體積僅0.3 μL．為了平衡高分辨率對(duì)高魔角轉(zhuǎn)速的要求和高信號(hào)強(qiáng)度對(duì)轉(zhuǎn)子內(nèi)樣品總量的要求，可設(shè)計(jì)合成氘代非天然氨基酸，結(jié)合蛋白質(zhì)的氘代方法，可在較低魔角轉(zhuǎn)速下獲得高分辨氫譜．

無

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NMR Studies of Large Protein Dynamics Using Unnatural Amino Acids

，，*

Hefei National Laboratory of Physical Science at Microscale and School of Life Sciences, University of Science and Technology of China, Hefei 230027, China

Nuclear magnetic resonance (NMR) is a major method used to study protein structure at atomic resolution.Besidespresenting the high-resolution structure, NMR facilitates studies on protein dynamics near physiological conditions that are intimately related to the biological mechanism of the proteins. Unnatural amino acids (UAA) labeling could significantly reduce the complexity of protein NMR spectra. In this review, we briefly summarize the widely used UAA labeling strategies for proteins, including chemical peptide synthesis, residue-specific peptide modification,19F labeled aromatic amino acids incorporation and genetic code expansion based UAA incorporation. The recent applicants of UAA in characterizing protein structure and dynamics, the limitations and prospects of UAA are also highlighted.

solution NMR, solid-state NMR, unnatural amino acid, large size protein

O482.53

A

10.11938/cjmr20212931

2021-07-02;

2021-08-26

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(22077117, 31971152)；國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃資助項(xiàng)目(2019YFA0904104, 2017YFA0505400)．

* Tel: 0551-63600872, E-mail: cltian@ustc.edu.cn.