楊 朵，周心娜，王 碩，王小利，袁艷華，楊化兵，耿會珍，彭 兵，李子博，李 彬，任 軍△

(1.首都醫(yī)科大學附屬北京世紀壇醫(yī)院腫瘤內科，腫瘤治療性疫苗北京市重點實驗室，北京 100038；2.河北博海生物工程開發(fā)有限公司，石家莊 050035)

近年來，免疫療法已成為腫瘤治療的研究熱點，而腫瘤疫苗是免疫治療重要的選擇之一。由于樹突狀細胞(dendritic cell，DC)具有高效的抗原遞呈能力，選擇其作為載體制備DC腫瘤疫苗已成為有效的腫瘤免疫治療手段[1]。DC疫苗在使用中需要對其進行適宜的腫瘤抗原負載，其所負載的腫瘤抗原決定了DC疫苗應用的成敗[2]。同時由于腫瘤生物學的高度異質性，進行個體化治療也是腫瘤治療的重要發(fā)展方向[3]。利用個體化的、有效的腫瘤抗原負載DC細胞，將能更有效強化DC疫苗的抗腫瘤特性。

樹突狀細胞疫苗特異腫瘤多肽庫(專利號CN 104655849 B，2016-08-24)包含360個多肽序列，每個序列分別含有15～30個氨基酸。這些多肽分子具有腫瘤特異性，特異多肽涉及26種腫瘤類型?；颊咄庵苎ㄟ^蛋白質譜分析并與多肽庫中序列進行比較，檢測得出患者特異腫瘤多肽靶點，據此體外合成該患者的特異腫瘤多肽序列。體外合成的患者特異多肽小分子同時具有患者特異性和腫瘤特異性。本研究利用DC細胞作為抗原遞呈載體，檢測了患者特異腫瘤多肽在體外對淋巴細胞的激活功能，為未來樹突狀細胞疫苗特異腫瘤多肽負載DC疫苗在腫瘤治療中的應用提供實驗依據。

1 資料與方法

1.1 實驗材料及患者腫瘤特異多肽檢測合成

研究使用的外周血來自于2019年12月至2021年1月北京世紀壇醫(yī)院腫瘤內科住院治療患者，本研究開始前已經北京世紀壇醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審查批準(批件編號：2019-科研51)，所有研究對象均簽署知情同意書。本研究使用的腫瘤細胞系(包括A549、TCCSUP、SGC-7901、BGC-823、CFPAC-1、MCF-7、MDA-MB-453、HCT-116)均購自中國科學院細胞庫。患者外周血特異腫瘤多肽由河北博海生物工程開發(fā)有限公司檢測并提供合成。患者一般信息及腫瘤多肽檢測結果見表1，不同患者檢測并合成的多肽序列類別數(shù)不同，體外實驗采用患者細胞及其各自特異的腫瘤多肽。

1.2 試劑

DC細胞培養(yǎng)基采用德國CellGenix 樹突細胞培養(yǎng)基(貨號20801-0500)，淋巴細胞培養(yǎng)基Lymphocyte serum-free medium(LSFM)為美國Corning公司生產，胎牛血清、RIPM-1640、DMEM高糖培養(yǎng)基為美國ThermoFisher公司生產，細胞因子白介素-4(interleukin-4，IL-4)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-ɑ)購自美國R&D公司，白介素-2(interleukin-2，IL-2)、巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulation factor,GM-CSF)購自廈門特寶生物工程有限公司，細胞因子檢測試劑購自瑞典Mabtech公司，淋巴細胞分離液購自天津灝洋生物科技有限公司，CCK-8檢測試劑盒購自廣州賽國科技生物有限公司。

1.3 患者體外DC細胞培養(yǎng)及細胞因子誘導的殺傷細胞(cytokine-induced killer，CIK)培養(yǎng)

外周血DC細胞分離及培養(yǎng)采用貼壁法[4]，用含自體血漿的RIPM-1640培養(yǎng)液在37 ℃ 5%(體積分數(shù))CO2條件下靜置培養(yǎng)2 h，移除非貼壁細胞用于后續(xù)CIK細胞培養(yǎng)，貼壁細胞用含TNF-α 2.5 mg/L、GM-CSF 0.4 mg/L和IL-4 0.02 mg/L的新鮮CellGenix 樹突細胞培養(yǎng)基，37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)，每2～3天補液并補充細胞因子。實驗組DC細胞培養(yǎng)體系中依據前期動物預實驗結果，按照每種腫瘤多肽2.5 mg/L的工作(質量)濃度加入患者特異腫瘤多肽。

患者體外CIK細胞的培養(yǎng)中，原始細胞為上述貼壁法移除的非貼壁細胞，培養(yǎng)方法依照文獻[5]的方法進行。

外周血DC細胞培養(yǎng)5 d后，按照數(shù)量比DC ∶CIK=1 ∶8的比例進行混合，繼續(xù)培養(yǎng)≥3 d后進行淋巴細胞功能檢測。實驗分為實驗組[DC細胞(經樹突狀細胞疫苗特異腫瘤多肽刺激)+CIK細胞聯(lián)合培養(yǎng)：肽-DC-CIK]、對照組1[DC細胞(無腫瘤多肽刺激)+CIK細胞聯(lián)合培養(yǎng)：DC-CIK]和對照組2(單純CIK細胞：CIK)。

1.4 增殖功能檢測

采用CCK-8法檢測不同組CIK細胞的增殖活性：采用96孔板進行接種，每孔腫瘤細胞接種濃度為6×103，每組設4個復孔，37 ℃分別培養(yǎng)2 d、4 d和6 d后每孔加10%體積的CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，450 nm測定光密度值。培養(yǎng)體系設為兩組，一組含有終濃度為1 000 IU/mL的 IL-2，一組不含IL-2。

1.5 細胞因子分泌功能檢測

采用酶聯(lián)免疫斑點法檢測不同組CIK細胞分泌細胞因子的功能，每組設3個復孔，按試劑操作指南進行操作，細胞接種量為2.5×105/孔，孵育18 h后進行細胞因子分泌量檢測。

1.6 殺腫瘤細胞功能檢測

采用CCK-8法檢測不同組CIK細胞對腫瘤細胞株的殺傷作用。采用96孔板進行接種，每孔腫瘤細胞接種濃度為1×103，貼壁培養(yǎng)2 h后，按比例加入不同濃度效應細胞，并使效靶比為10 ∶1、20 ∶1、30 ∶1。同時設單獨效應細胞組和單獨靶細胞組，每組設3個復孔，37 ℃培養(yǎng)18 h和24 h后每孔加10%體積的CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，450 nm測定光密度值，計算效應細胞對腫瘤細胞的殺傷率。殺傷率=[1-(實驗孔-效應孔)/靶細胞孔]×100%。

1.7 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 19.0軟件，計量資料采用均數(shù)±標準差表示，組間增殖光密度比較、細胞因子分泌量比較及殺腫瘤效率的比較均采用秩和檢驗。存在多組間比較時，組間兩兩比較采用Kruskal-Wallis 檢驗，統(tǒng)計結果均采用雙側檢驗。P<0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 患者外周血特異腫瘤多肽檢測

本體外研究涉及腫瘤類型包括非小細胞肺癌、胃癌、乳腺癌、膀胱癌、胰腺癌、結腸癌等(表1)。

表1 患者一般信息及腫瘤特異多肽檢測結果Table 1 Patient characters and specific tumor polypeptide information

2.2 體外淋巴細胞增殖

采用CCK-8 法體外測量腫瘤多肽對淋巴細胞增殖作用，測量時間點分別為當日、第2天、第4天、第6天。在培養(yǎng)體系中IL-2存在的情況下(圖1A)，實驗組與對照組均增殖明顯，但腫瘤多肽組在第4天(Z=-3.79,P<0.001)、第6天(Z=-2.95,P<0.01)時光密度顯著高于單純CIK組，差異有統(tǒng)計學意義，并在第4天時光密度顯著高于DC-CIK組(Z=-2.02,P<0.05)，提示在有IL-2存在的情況下，腫瘤多肽可刺激淋巴細胞的增殖。培養(yǎng)體系中無IL-2時，各組淋巴細胞均增殖緩慢，在各時間點光密度差異無統(tǒng)計學意義(圖1B)。

* P<0.05,# P<0.001.A,in the presence of IL-2,the absorbance at 450 nm of different groups at different time point;B,the absorbance at 450 nm of different groups at different time point without IL-2.圖1 腫瘤多肽刺激淋巴細胞增殖情況Figure 1 Lymphocyte proliferation when stimulated by specific tumor polypeptides

2.3 細胞因子分泌功能

經18 h孵育后，腫瘤多肽刺激組CIK細胞的多種細胞因子產生量高于單純CIK組，其中IL-4(Z=-2.61,P<0.01)、GM-CSF(Z=-3.85,P<0.001)、IFN-γ(Z=-3.56,P<0.001)和TNF-α(Z=-3.40,P<0.001)的分泌量與單純CIK組相比，差異有統(tǒng)計學意義。腫瘤多肽刺激組與DC-CIK組相比，除IL-4分泌量差異有統(tǒng)計學意義外(Z=-2.15,P<0.05)，其余各項細胞因子分泌量差異均無統(tǒng)計學意義。DC-CIK組與單純CIK組相比，IFN-γ(Z=-2.44,P<0.05)、TNF-ɑ(Z=-2.26,P<0.05)和GM-CSF(Z=-3.73,P<0.001)分泌量差異有統(tǒng)計學意義(圖2)。

*P<0.05,△P<0.01,# P<0.001.圖2 不同組細胞因子的分泌量Figure 2 Cytokine secretion of CIK cells in different groups

2.4 殺腫瘤細胞功能

不同效靶比例下，腫瘤多肽組與DC-CIK組、單純CIK組在18 h與24 h的殺傷效率差異無統(tǒng)計學意義，但腫瘤多肽組有高于其他兩個對照組的趨勢(圖3)。

圖3 不同效應細胞/靶細胞比共孵育18 h(A)及24 h(B)各組CIK細胞對腫瘤細胞的殺傷效率Figure 3 The killing efficiency of CIK cells to tumor cells at 18 h(A) and 24 h(B)time point with different effector/target cells ratio

3 討論

DC細胞具有強大的抗原遞呈功能，DC腫瘤疫苗能夠激活原始T細胞，同時激活先天免疫和獲得性免疫，并可通過同時負載多種腫瘤抗原實現(xiàn)多種腫瘤抗原的遞呈，基于DC細胞的腫瘤疫苗在腫瘤治療中取得了良好的療效[6-7]。目前，用于負載DC的抗原可以是腫瘤特異性抗原、腫瘤相關抗原或腫瘤全細胞抗原等[8]，如采用個體化腫瘤抗原進行DC細胞負載，可達到DC疫苗的個體化治療特性，將更好地發(fā)揮DC腫瘤疫苗的治療效果。本研究采用的個性化腫瘤特異多肽，為一組患者個性化定制腫瘤多肽，通過DC細胞遞呈給T淋巴細胞，最終刺激機體產生特異性抗腫瘤免疫反應。

本研究發(fā)現(xiàn)經腫瘤多肽負載的DC細胞組與CIK細胞共培養(yǎng)后，相比較于DC+CIK組、單純CIK組，在有IL-2存在的情況下，能夠顯著刺激誘導淋巴細胞的增殖，增殖效果隨孵育時間延長而明顯提高，提示樹突狀細胞疫苗特異腫瘤多肽可增強CIK細胞的增殖功能。培養(yǎng)體系中IL-2對維持T 細胞生存與增殖具有重要作用[9]，IL-2的存在可顯著促進淋巴細胞的增殖。本研究結果也顯示培養(yǎng)體系中如沒有IL-2，腫瘤特異多肽對淋巴細胞的增殖沒有顯著影響。腫瘤特異多肽需要在有IL-2存在的情況下，才能發(fā)揮促進淋巴細胞增殖的功能。

DC細胞呈遞腫瘤抗原給T淋巴細胞后，活化的T淋巴細胞可分泌相應細胞因子。本研究發(fā)現(xiàn)，樹突狀細胞疫苗特異腫瘤多肽負載組可顯著提高IFN-γ的分泌量，與單純CIK組相比，IFN-γ分泌量差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。IFN-γ可由活化的Th1細胞分泌，具有調節(jié)Th1細胞活化、分化、成熟，促進DC 細胞及巨噬細胞 MHC 類分子表達和抗原遞呈功能，并能激活 NK 細胞增強其細胞毒性[10]。本研究還發(fā)現(xiàn)，樹突狀細胞疫苗特異腫瘤多肽負載組的TNF-α、GM-CSF與IL-4分泌量顯著高于單純CIK組。有學者報道[11]，高濃度TNF-α可以破壞腫瘤血管引起細胞壞死，并可促進MHC-1類分子表達，增強NK、CTL對腫瘤的殺傷作用，TNF-α已成功應用于臨床腫瘤治療。GM-CSF可由活化的Th1淋巴細胞分泌，有學者發(fā)現(xiàn)GM-CSF可改善放化療引起的T淋巴細胞損傷，改善機體免疫功能，并可刺激特異性細胞毒性T細胞向腫瘤組織浸潤[12-13]。而IL-4在不同的細胞類型中參與調節(jié)不同的生物過程，如細胞的增殖、分化和凋亡等。有研究報道[14]，非小細胞肺癌患者中，IL-4可通過增強 CD8+T 細胞的細胞毒作用，以及活化嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞等參與機體的抗腫瘤免疫反應。此外，它還可通過協(xié)同TNF-α來活化內皮細胞，增加機體血管的通透性，從而有利于淋巴細胞的浸潤并誘導自然殺傷細胞的活化。本研究結果提示腫瘤特異多肽負載組，在體外可顯著提高多種細胞因子的分泌量，可潛在提高CIK細胞的抗腫瘤功能。

本研究不同實驗組在體外對腫瘤細胞的殺傷實驗發(fā)現(xiàn)，負載了樹突狀細胞疫苗特異腫瘤多肽的實驗組，其對相應腫瘤細胞系的殺傷效率在兩個時間點及多個靶/效濃度的殺傷效率均顯著高于DC-CIK組及單純CIK組，但也有部分患者3組免疫細胞對腫瘤細胞系的殺傷效率無顯著差別?？傮w殺傷效率經統(tǒng)計學分析后顯示，在不同時間點以及不同的效/靶濃度比，3組雖然差異無統(tǒng)計學意義，但腫瘤多肽負載組仍有高于其他兩組的趨勢。分析殺傷效率統(tǒng)計學無差異的原因可能為：(1)不同患者負載的腫瘤多肽均為患者特異的定制腫瘤肽，其與腫瘤細胞系之間不存在交叉抗原的可能；(2)可能有樣本量不夠大導致的統(tǒng)計偏差。另外，有研究者報告多種具有抗腫瘤效應的多肽，其抗腫瘤機制為誘導了腫瘤細胞的凋亡，從而達到抗腫瘤目的[15]。本研究并未檢測多肽的體外誘導腫瘤細胞凋亡功能，有待后續(xù)研究探索。

綜上所述，樹突狀細胞疫苗特異腫瘤多肽聯(lián)合DC細胞，在體外可有效增強T淋巴細胞的增殖能力及多個細胞因子的分泌功能。