宋月芹，白小軍，陳慶霄，呂琪卉，孫會(huì)忠*

(1.河南科技大學(xué)林學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471000；2.宜陽(yáng)縣林業(yè)技術(shù)指導(dǎo)站，河南 洛陽(yáng) 471600)

昆蟲(chóng)的化學(xué)感受系統(tǒng)在其生存和繁殖過(guò)程中起著極其重要的作用[1-3]。在過(guò)去10 多年的時(shí)間里，研究者對(duì)昆蟲(chóng)觸角嗅覺(jué)信號(hào)傳導(dǎo)的分子機(jī)制研究有了突出的進(jìn)步。在昆蟲(chóng)嗅覺(jué)識(shí)別時(shí)，氣味分子從觸角感器孔滲入，然后被氣味結(jié)合蛋白（odorant binding proteins，OBPs）或化學(xué)感受蛋白（chemosensory proteins，CSPs）識(shí)別和轉(zhuǎn)移，最后激活位于嗅覺(jué)感覺(jué)神經(jīng)元（olfactory sensory neurons，OSNs）樹(shù)突膜上的嗅覺(jué)受體（odorant receptors，ORs）或離子型受體（ionotropic receptors，IRs），產(chǎn)生電位，指導(dǎo)昆蟲(chóng)做出相應(yīng)的行為反應(yīng)[4-8]。此外，還有一些蛋白如感覺(jué)神經(jīng)元膜蛋白（sensory neuron membrane proteins，SNMPs）在昆蟲(chóng)氣味識(shí)別過(guò)程中也扮演著至關(guān)重要的作用[5]。

昆蟲(chóng)SNMPs 也是一種膜蛋白，與脊椎動(dòng)物CD36 家族為同源基因，具有2 個(gè)跨膜區(qū)域，其功能主要是識(shí)別和轉(zhuǎn)運(yùn)親脂性氣味分子如脂肪酸和脂類(lèi)化合物等[9-14]。昆蟲(chóng)第一個(gè)SNMP 基因在多音天蠶（Antheraea polyphemusCramer）中被鑒定，并命名為ApolSNMP1[9]。隨后在煙草天蛾（Manduca sextaL.）中發(fā)現(xiàn)SNMP 的第二個(gè)亞類(lèi)型，即命名為MsexSNMP2[10,15]。緊接著SNMP 的同源基因在鱗翅目Lepidoptera[10,15-16]、雙翅目Diptera[17]、鞘翅目Coleoptera[18]、直翅目Orthoptera[13]和膜翅目Hymenoptera[19]等昆蟲(chóng)中都有發(fā)現(xiàn)。一直以來(lái)被認(rèn)為SNMP 基因家族就2 個(gè)成員，即SNMP1 和SNMP2。最近昆蟲(chóng)SNMP 家族的第三個(gè)成員SNMP3 在鱗翅目中被鑒定[20-21]，但認(rèn)為該基因的主要功能與昆蟲(chóng)的免疫反應(yīng)有關(guān)，這還需要進(jìn)一步的去證明。

紅脊長(zhǎng)蝽（Tropidothorax elegansDistant）屬半翅目（Hemiptera）長(zhǎng)蝽科（Lygaeidae），主要為害刺槐（Robinia pseudoacaciaL.）、辣椒（Capsicum annuumL.）、葫蘆（Lagenaria sicerariaMolina）、油菜（Brassica napusL.）、大白菜（Brassica pekinensisLour.）和小麥（Triticum aestivumL.）等多種植物，食性較雜。關(guān)于紅脊長(zhǎng)蝽的嗅覺(jué)基因研究較少，本研究通過(guò)前期紅脊長(zhǎng)蝽觸角轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果[22]，鑒定了紅脊長(zhǎng)蝽的2 個(gè)SNMP 基因，即TeleSNMP1和TeleSNMP2，并通過(guò)熒光定量PCR 技術(shù)對(duì)紅脊長(zhǎng)蝽TeleSNMP1和TeleSNMP2在不同組織中的表達(dá)情況進(jìn)行分析，為進(jìn)一步探索紅脊長(zhǎng)蝽SNMPs 的化學(xué)通訊功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試蟲(chóng)的準(zhǔn)備

紅脊長(zhǎng)蝽來(lái)自河南科技大學(xué)林學(xué)院昆蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)室，該群體為自2014 年7 月在洛陽(yáng)周邊（112?26′ E，34?43′ N）蔬菜地采集的成蟲(chóng)，然后在溫室內(nèi)繼代飼養(yǎng)至今。溫室條件為：溫度25 ± 2℃，相對(duì)濕度60% ± 5%，光周期14L∶10D。

1.2 總RNA 的提取與第一鏈cDNA 的合成

選取紅脊長(zhǎng)蝽羽化后第3 d 的雌雄成蟲(chóng)，收集觸角各100 頭、頭部各30 頭、胸部各20 頭、腹部各5 頭、足各50 頭、翅各50 頭，每個(gè)樣品收集材料重復(fù)3 次。將紅脊長(zhǎng)蝽各部分組織解剖后立即放入浸在液氮中的1.5 mL 離心管內(nèi)，然后保存于?80℃中。

總RNA 的提取采用RNAiso Plus Kit（TaKaRa，北京）試劑盒進(jìn)行，并使用RNase-free DNase I（TaKaRa，北京）對(duì)提取的RNA 進(jìn)行除DNA 處理。采用1%的瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 2000c 分光光度計(jì)（Thermo Scientific）進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)。采 用PrimeScript? 1st Strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa，北京）試劑盒對(duì)RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

1.3 紅脊長(zhǎng)蝽SNMPs 基因的克隆

從本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)紅脊長(zhǎng)蝽觸角轉(zhuǎn)錄組測(cè)序注釋結(jié)果中[21]搜素到2 個(gè)SNMP 基因。根據(jù)該序列設(shè)計(jì)特異性引物，TeleSNMP1-F：5′-ATGGCTG CACCACTGAGG-3′，TeleSNMP1-R：5′-CTAGTA CTTTGCCGGGGGTG-3′；TeleSNMP2-F：5′-ATG ACGAAGGTGCTGTTCCC-3′，TeleSNMP2-R：5′-T TAGCTTGTGAGAGTCCTTTTGA-3′，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系為20 μL：雌蛾觸角cDNA 模板1 μL，上下游引物各1.5 μL（10 μmol·L?1），dNTPs混合液1.6 μL（2.5 μmol·L?1），Ex Taq DNA 聚合酶0.2 μL（TaKaRa，大連），10×Ex Taq buffer 2 μL，ddH2O 為12.2 μL。PCR 反應(yīng)條件為：94℃5 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，35 個(gè)循環(huán)；最后72℃ 10 min。膠回收目的片段，將目的片段克隆到pMDTM19-T 載體上，轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性克隆培養(yǎng)過(guò)夜，送去測(cè)序。

1.4 紅脊長(zhǎng)蝽SNMPs 基因的序列分析

核酸序列采用在線(xiàn)工具（http://www.bio-soft.net/sms/）翻譯；采用（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM）在線(xiàn)工具進(jìn)行跨膜區(qū)域預(yù)測(cè)；利用在線(xiàn)工具（https://web.expasy.org/protparam/）對(duì)蛋白序列特性進(jìn)行分析；蛋白親疏水性采用在線(xiàn)工具（https://web.expasy.org/protscale/）分析；序列比對(duì)采用線(xiàn)下DNAMAN 進(jìn)行多重序列比較；進(jìn)化樹(shù)采用線(xiàn)下MEGA 6.0 構(gòu)建。

1.5 實(shí)時(shí)定量PCR

通過(guò)熒光定量PCR 檢測(cè)紅脊長(zhǎng)蝽SNMPs 基因在不同組織中的表達(dá)情況。根據(jù)紅脊長(zhǎng)蝽SNMPs基因的開(kāi)放閱讀框和熒光定量引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)特異性引物，TeleSNMP1-F：TCACCATCCCTCATC CA，TeleSNMP1-R：TCTTCGCCGTCTTTCAT，Tele SNMP2-F：TGTGGGAACGGAACTCT，TeleSNMP2-R：GCACCTTGGCACTTTG。內(nèi)參基因?yàn)榧t脊長(zhǎng)蝽Actin 基因（基因登陸號(hào)為MG322127），引物為：TeleActin-F：CAAGGACGAAACAATCA；TeleActin-R：GAGAATACACTCCCAGAAC。

熒光定量PCR被執(zhí)行在ABI 7500 PCR 儀（ABI，Carlsbad，CA，USA）上進(jìn)行，每個(gè)反應(yīng)體積20 μL，包括10 μL 的2×SYBR Green PCR Master Mix（TaKaRa，大連）、0.8 μL 的正反向引物（10 μmol·L?1）、2 μL 的cDNA 模板（200 ng）和6.4 μL 的DEPC 水。PCR 循環(huán)遵循95℃ 30 s，然后95℃ 5 s，53℃ 31 s，共循環(huán)40 個(gè)周期。試驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.6 數(shù)據(jù)分析

紅脊長(zhǎng)蝽SNMPs 基因在不同組織中的相對(duì)表達(dá)量采用公式2???CT[23]計(jì)算。利用SPSS 17.0 軟件中的ANOVA 方法對(duì)TeleSNMPs 在紅脊長(zhǎng)蝽不同組織中的表達(dá)量進(jìn)行顯著性差異比較（新復(fù)極差法檢驗(yàn)，P≤ 0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅脊長(zhǎng)蝽SNMPs 基因克隆及序列分析

將測(cè)序結(jié)果在NCBI 上進(jìn)行同源性搜索，結(jié)果表明所測(cè)序列與多種昆蟲(chóng)的SNMP 基因序列高度同源，證明這2 個(gè)基因就是紅脊長(zhǎng)蝽的SNMP 基因，并分別命名為T(mén)eleSNMP1和TeleSNMP2，在NCBI基因登陸號(hào)分別為MW442946 和MW442947。

這2 個(gè)SNMPs 基因都具有全長(zhǎng)的開(kāi)放閱讀框，TeleSNMP1長(zhǎng)度為1 497 bp，編碼498 個(gè)氨基酸（圖1）；而TeleSNMP2長(zhǎng)度為1 686 bp，編碼561 個(gè)氨基酸。這2 個(gè)基因都是酸性，TeleSNMP1的等電點(diǎn)是8.26，蛋白分子量是55.59 kD；TeleSNMP2的等電點(diǎn)是7.05，蛋白分子量是63.37 kD。

TeleSNMP1和TeleSNMP2在氨基酸序列的N-端和C-端各有一個(gè)跨膜區(qū)域，其中TeleSNMP2在氨基酸第158 和180 之間還有一個(gè)跨膜區(qū)域。在膜外區(qū)域6 個(gè)保守的半胱氨酸殘基位點(diǎn)被預(yù)測(cè)（圖1），這6 個(gè)保守的半胱氨酸位點(diǎn)與CD36 基因家族相似。

圖1 紅脊長(zhǎng)蝽TeleSNMP1 和TeleSNMP2 與其他昆蟲(chóng)SNMPs 的序列比對(duì)Fig.1 Alignment of Tropidothorax elegans SNMP1 and SNMP2 with SNMPs from other insects

2.2 紅脊長(zhǎng)蝽SNMPs 與其他昆蟲(chóng)SNMP 基因的同源性及進(jìn)化樹(shù)分析

將紅脊長(zhǎng)蝽TeleSNMP 基因與已報(bào)道的其他昆蟲(chóng)SNMP 基因的氨基酸序列在NCBI 中的Blastp在線(xiàn)搜索工具進(jìn)行同源性分析，發(fā)現(xiàn)TeleSNMP 基因與不同種類(lèi)昆蟲(chóng)SNMP 基因一致性差別較大。與同目昆蟲(chóng)SNMP 基因一致性較高，如TeleSNMP1與茶翅蝽 (Halyomorpha halysStal)HhalSNMP1序列一致性在81.33%；與苜蓿盲蝽 (Adelphocoris lineolatusGoeze)AlinSNMP1序列一致性在68.54%；與不同目昆蟲(chóng)SNMP 基因一致性較低，如TeleSNMP1與斑痣懸繭蜂 (Meteorus pulchricornisWesmael)MpulSNMP1序列一致性在43.44%。但TeleSNMP2與所有昆蟲(chóng)SNMP 基因一致性都不高，如與茶翅蝽HhalSNMP2序列一致性在48.68%；與苜蓿盲蝽AlinSNMP2序列一致性在41.18%；與德國(guó)小蠊 (Blattella germanicaLinnaeus)BgerSNMP1序列一致性在46.22%。TeleSNMP2與玉帶鳳蝶 (Papilio polytesL.)PpolSNMP2序列一致性在30.94%；與亞洲小車(chē)蝗 (Oedaleus asiaticusBei-Bienko)OasiSNMP2序列一致性在34.76%。紅脊長(zhǎng)蝽TeleSNMP1和TeleSNMP2之間序列一致性?xún)H有29.66%。

使用MEGA6.0 對(duì)9 個(gè)目的36 種昆蟲(chóng)SNMP同源基因進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)比較。SNMPs 基因被分成2 個(gè)亞組，即SNMP1 和SNMP2（圖2），每亞組中同目昆蟲(chóng)SNMP 基因同源性最高。紅脊長(zhǎng)蝽的TeleSNMP1和TeleSNMP2基因分別被集聚到這2 個(gè)亞組，并且與同為半翅目昆蟲(chóng)的苜蓿盲蝽、茶翅蝽和黑肩綠盲蝽SNMP 基因進(jìn)化關(guān)系最近，與其他目昆蟲(chóng)SNMP 關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖2 紅脊長(zhǎng)蝽SNMPs 與其他昆蟲(chóng)SNMPs 氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of the SNMPs of Tropidothorax elegans and other insects based on amino acid sequences by using neighbor-joining method

2.3 紅脊長(zhǎng)蝽SNMPs 基因表達(dá)譜分析

使用熒光定量PCR 對(duì)紅脊長(zhǎng)蝽TeleSNMP1和TeleSNMP2在不同組織中的表達(dá)情況進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：TeleSNMP1和TeleSNMP2在雌雄蛾觸角中高度表達(dá)，TeleSNMP1在雄蛾觸角中的表達(dá)量明顯高于雌蛾，TeleSNMP2的表達(dá)情況剛好相反，即TeleSNMP2在雌蛾觸角中的表達(dá)量明顯高于雄蛾。除觸角外，TeleSNMP1幾乎不在其他組織中表達(dá)或表達(dá)量甚微。TeleSNMP2除在觸角中表達(dá)量豐富外，在足和翅中也有少量表達(dá)（圖3）。

圖3 紅脊長(zhǎng)蝽SNMPs 在不同組織中的相對(duì)表達(dá)量Fig.3 Expression level of SNMPs in different tissues of Tropidothorax elegans

3 討論

本研究根據(jù)前期紅脊長(zhǎng)蝽觸角轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)，通過(guò)BLASTX 在線(xiàn)搜索和同源性比較鑒定出2 個(gè)SNMPs 基因，即TeleSNMP1和TeleSNMP2。這2 個(gè)基因與其他昆蟲(chóng)SNMPs 具有類(lèi)似的特征，如在氨基酸序列N 端和C 端附近有2 個(gè)保守的跨膜區(qū)域，并且由6 個(gè)保守的半胱氨酸殘基形成二硫鍵組成一個(gè)大的胞外環(huán)，此結(jié)構(gòu)也與CD36 基因家族極其相似[24-26]。根據(jù)對(duì)這2 個(gè)跨膜蛋白結(jié)構(gòu)投影預(yù)測(cè)，這部分的功能是轉(zhuǎn)運(yùn)和結(jié)合脂類(lèi)分子[27-28]，我們可推測(cè)紅脊長(zhǎng)蝽SNMPs 的2 個(gè)跨膜區(qū)具有同樣的功能。但紅脊長(zhǎng)蝽TeleSNMP2在氨基酸序列第158 和180 之間多了1 個(gè)跨膜區(qū)域，目前關(guān)于SNMPs 基因具有3 個(gè)跨膜區(qū)域的報(bào)道還沒(méi)有，可能是鑒定的SNMPs 數(shù)量還不夠龐大，也可能長(zhǎng)期進(jìn)化形成的。

紅脊長(zhǎng)蝽TeleSNMP 基因同源性搜索發(fā)現(xiàn)TeleSNMP 基因與不同種類(lèi)昆蟲(chóng)SNMP 基因一致性差別較大。與同目昆蟲(chóng)SNMP 基因一致性較高，與不同目昆蟲(chóng)SNMP 基因一致性較低。紅脊長(zhǎng)蝽TeleSNMP1和TeleSNMP2之間分歧也比較大。進(jìn)化樹(shù)結(jié)果也顯示，紅脊長(zhǎng)蝽TeleSNMP1和TeleSNMP2分別被集聚到SNMP1 和SNMP2 兩個(gè)亞組，在同一組內(nèi)同目昆蟲(chóng)的SNMP 基因進(jìn)化關(guān)系最近，與其他目昆蟲(chóng)SNMP 關(guān)系較遠(yuǎn)。此結(jié)果與大多數(shù)昆蟲(chóng)SNMP 基因特性相同[26,29-30]。在鱗翅目中曾經(jīng)鑒定出SNMP3 亞家族基因[20]，而在紅脊長(zhǎng)蝽觸角轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)該基因，可能是這個(gè)基因在幼蟲(chóng)腸中高度表達(dá)的原因。

組織特異性表達(dá)可以為功能預(yù)測(cè)提供可靠性的參考。我們研究發(fā)現(xiàn)紅脊長(zhǎng)蝽SNMP1主要表達(dá)在雌雄蛾的觸角中，此結(jié)果與多音蠶蛾[9]、臍橙螟（Amyelois transitellaWalker）[31]、甜 菜夜蛾（Spodoptera exiguaHtibner）[32]和中紅側(cè)溝繭蜂（Microplitis mediatorHaliday）[33]等多種昆蟲(chóng)SNMP1的表達(dá)模式相同。Benton 等[34]在果腹黑蠅（Drosophila melanogasterwDm）中發(fā)現(xiàn)，DmelSNMP1能夠識(shí)別集合信息素cVA，激活受體HR13。Pregitzer 等[28]在煙芽夜蛾（Heliothis virescensFabricius）中也發(fā)現(xiàn)，HvirSNMP1 能明顯增強(qiáng)HR13 對(duì)信息素Z11-16:Ald 的結(jié)合力。以上研究都暗示昆蟲(chóng)SNMP1 的功能是調(diào)節(jié)信息素的識(shí)別和通過(guò)SNMP-OR 互作轉(zhuǎn)運(yùn)信息素。相對(duì)于TeleSNMP1，TeleSNMP2的表達(dá)相對(duì)廣泛，除嗅覺(jué)感器觸角外，在非嗅覺(jué)感器足中也有少量表達(dá)，此結(jié)果與小菜蛾（Plutella xylostellaL.）[35]、二化螟（Chilo suppressalisWalker）[36]、稻縱卷葉螟（Cnaphalocrocis medinalisG.）[37]、甜菜夜蛾[31]和中紅側(cè)溝繭蜂[32]一致。昆蟲(chóng)身體上分布有大量的味覺(jué)感器[38]，而CD36 蛋白的主要功能是轉(zhuǎn)運(yùn)脂類(lèi)化合物，因此可推測(cè)TeleSNMP2和GRs 在這些組織中共同表達(dá)，識(shí)別脂類(lèi)分子完成味覺(jué)過(guò)程。

4 結(jié)論

本研究首次克隆和鑒定了紅脊長(zhǎng)蝽的2 個(gè)SNMPs 基因，即TeleSNMP1和TeleSNMP2。同目昆蟲(chóng)同類(lèi)SNMP 同源序列一致性較高，反之，不同目昆蟲(chóng)不同類(lèi)SNMP 同源序列一致性較低。同樣，TeleSNMP1和TeleSNMP2之間的序列一致性也極低。TeleSNMP1主要在雌雄觸角中特異性表達(dá)，而TeleSNMP2除觸角外，在非觸角組織中也有表達(dá)。