王以典，郭旭東，康繼賀，康學(xué)文

（蘭州大學(xué)第二醫(yī)院骨科，甘肅省骨關(guān)節(jié)疾病研究重點實驗室，甘肅蘭州 730030）

隨著社會老齡化加重，下腰痛的發(fā)生率逐年升高[1]，流行病學(xué)發(fā)現(xiàn)，約40%的腰痛由椎間盤退變（intervertebral disc degeneration,IDD） 引起[2]。椎間盤退變疾病可致患者勞動能力喪失，甚至發(fā)展為慢性殘疾，給個人和社會帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[3]。目前研究認(rèn)為，遺傳易感性、衰老、創(chuàng)傷、吸煙等與IDD密切相關(guān)[4-7]。褪黑素(melatonin,MT)是一種主要由松果體分泌的神經(jīng)內(nèi)分泌激素[8]，具有抗炎、抗氧化應(yīng)激及抑制細(xì)胞凋亡等功能[8-10]，在人體生理功能調(diào)節(jié)中扮演著重要角色。最近，不少中外學(xué)者發(fā)現(xiàn)MT能通過保護(hù)細(xì)胞功能及抑制細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix,ECM）降解有效延緩IDD進(jìn)程。因此，本文就MT在IDD的應(yīng)用研究做一綜述，為相關(guān)研究提供參考。

1 椎間盤結(jié)構(gòu)和功能概述

椎間盤介于上下兩個椎體之間，主要由髓核（nucleus pulposus,NP）、纖維環(huán) （annulus fibrosus,AF）及軟骨終板（cartilaginous endplate,CEP）三個部分組成，有緩沖脊柱壓力等作用[11]。正常的NP是一種凝膠狀的高水分組織，主要由II型膠原蛋白和蛋白聚糖組成[11，12]。NP細(xì)胞作為NP內(nèi)的主要功能細(xì)胞，對維持NP的微環(huán)境穩(wěn)態(tài)和正常功能至關(guān)重要，其功能和數(shù)量的下降直接促進(jìn)了IDD的發(fā)生發(fā)展[13，14]。AF分為內(nèi)外兩層，外層主要由成纖維細(xì)胞組成，產(chǎn)生I型膠原蛋白，內(nèi)層的細(xì)胞類似軟骨細(xì)胞，主要產(chǎn)生Ⅱ型膠原蛋白和蛋白聚糖，AF的完整性是維持椎間盤內(nèi)壓的必要條件[15，16]。CEP位于椎間盤兩端，覆蓋于上下兩側(cè)的椎骨，是椎間盤營養(yǎng)物質(zhì)和代謝廢物運(yùn)輸?shù)闹饕緩絒17，18]。

2 椎間盤退變可能的發(fā)病機(jī)制

IDD是一個復(fù)雜的過程，其發(fā)病機(jī)制至今尚未闡明。在椎間盤退變過程中，NP細(xì)胞衰老、凋亡，ECM降解，AF結(jié)構(gòu)紊亂，CEP鈣化及微骨折等多種表型變化參與其中[19]。針對這些變化，有人提出了兩種假說：第一種假說認(rèn)為異常的機(jī)械應(yīng)力首先造成椎間盤損傷，如AF微裂隙，導(dǎo)致椎間盤失去完整性，使NP細(xì)胞生存環(huán)境發(fā)生異常改變，引起功能及數(shù)量下降，從而導(dǎo)致IDD[20]。另一種假說認(rèn)為退變首先起自CEP鈣化或微骨折導(dǎo)致的營養(yǎng)運(yùn)輸功能障礙，使椎間盤細(xì)胞營養(yǎng)供給不足，功能細(xì)胞數(shù)量減少，最終引起椎間盤功能障礙[21-22]。然而目前研究表明遺傳易感性在IDD發(fā)生及發(fā)展中同樣扮演著至關(guān)重要的角色[23]。因此，IDD可能是由“雙重打擊”造成的。第一次來自遺傳易感性導(dǎo)致的椎間盤結(jié)構(gòu)異常，在此基礎(chǔ)上，由于環(huán)境、生理及生物等多種因素引起椎間盤微環(huán)境異常及細(xì)胞功能障礙，使合成代謝與分解代謝失衡形成第二次打擊，最終導(dǎo)致IDD。

3 褪黑素的基本生理特性

MT的化學(xué)成分為N-乙酰-5-甲氧基色胺，最早于1958年由Aaron Lerner從牛松果體中發(fā)現(xiàn)并分離[24]，除松果體外，胃腸道、骨髓等局部也有分泌[25，26]。MT經(jīng)過多步酶促反應(yīng)合成，首先色氨酸經(jīng)色氨酸羥化酶（tryptophan hydroxylase,TPH）和芳香族氨基酸脫羧酶（aromatic amino acid decarboxylase,AADC）的羥化脫羧作用生成5-羥色胺（5-hydroxytryptamine,5-HT）。隨后，5-HT在松果體內(nèi)經(jīng)過芳基烷胺N-乙酰基轉(zhuǎn)移酶（Arylalkylamine N-acetyltransferase,AANAT）的乙?；土u基吲哚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(hydroxyindole-O-methyl transferase，HIOMT)的轉(zhuǎn)甲基作用生成MT[27]。AANAT在夜間活性急劇增加，是導(dǎo)致MT晝夜分泌規(guī)律的主要原因[28，29]。在MT的生物活性中，自由基清除能力是較為突出的一種。MT可通過多種途徑發(fā)揮抗氧化應(yīng)激能力：（1）MT與自由基直接反應(yīng)，其反應(yīng)產(chǎn)物如環(huán)狀3-羥基褪黑素、6-羥基褪黑素、2-羥基褪黑素、4-羥基褪黑素及N1-乙?；?N2-甲酰基-5-甲氧基犬尿氨酸等也有對抗氧化應(yīng)激的作用[30，31]；（2）MT 可通過與褪黑素受體1（melatonin receptor 1,MT1）、MT2結(jié)合上調(diào)谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase,GPX）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）和過氧化氫酶（catalase,CAT）等的表達(dá)清除自由基。在抑制炎癥方面，MT可下調(diào)白細(xì)胞介素-2（interleukin-2,IL-2）、IL-1β、干擾素-γ和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）的表達(dá)以及抑制髓過氧化物酶活性和炎癥小體的激活等方式抑制中、重炎癥反應(yīng)[9，32]。此外，MT還可通過調(diào)節(jié)Bcl-2家族基因表達(dá)及降低Caspase的活性抑制細(xì)胞凋亡[10，33]。

4 褪黑素與椎間盤退變

椎間盤是人體最大的無血管組織[11，34]，其營養(yǎng)物質(zhì)及代謝廢物的轉(zhuǎn)運(yùn)主要依靠上下兩側(cè)CEP的滲透作用[18]。椎間盤發(fā)生退變后，其內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)發(fā)生了異常改變，由于這一區(qū)域“相對孤立”，其退變過程很難依靠自身的調(diào)節(jié)作用逆轉(zhuǎn)，而一般的藥物不易通過血運(yùn)到達(dá)椎間盤并發(fā)生作用，因此，目前尚無對IDD有確切療效的藥物。MT具有分子較小以及親脂和親水的特性，這使得它能夠輕易地通過各種生物屏障，從而在細(xì)胞水平發(fā)揮作用[26，28]，且其優(yōu)異的抗炎、抗氧化應(yīng)激及抗細(xì)胞凋亡等生物活性可針對IDD中的多個環(huán)節(jié)發(fā)生作用，具有良好的應(yīng)用基礎(chǔ)（圖1）。近幾年已發(fā)表的MT作用于IDD的相關(guān)研究見表1。

圖1 MT延緩IDD及其潛在機(jī)制。MT可通過下調(diào)含凝血酶敏感蛋白基序的解聚蛋白樣金屬蛋白酶（A disintegrin-like and metalloprotease with thrombospondin motifs,ADAMTS）、基質(zhì)金屬蛋白酶（matrixmetalloproteinases,MMPs）及上調(diào)蛋白聚糖、SOX9、Ⅱ型膠原蛋白的表達(dá)抑制ECM降解，激活絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases,MAPKs）及核因子-κB（nuclear factor-κB,NF-κB）通路，減輕炎癥反應(yīng)，降低磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K）、絲/蘇氨酸蛋白激酶（serine/threonine protein kinase,Akt）的活性從而抑制細(xì)胞增殖。此外，MT還可通過增加SOD、CAT、GPX等酶的表達(dá)減輕氧化應(yīng)激損傷，激活沉默信息調(diào)節(jié)因子1（silent information regulation 1,SIRT1）、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（extracellular regulated protein kinase1/2,ERK1/2）抑制細(xì)胞凋亡，上調(diào)周期蛋白依賴性激酶2（cyclin-dependentkinase2,CDK2）、CDK4的活性延緩細(xì)胞衰老

表1 MT對延緩IDD的應(yīng)用研究

4.1 褪黑素的抗氧化應(yīng)激作用

活性氧（reactive oxygen species,ROS）是一類不穩(wěn)定且具有高活性的分子，包括超氧陰離子（O2-），羥基自由基（OH-），過氧化氫（H2O2）和次氯酸根離子（OC1-）等[35]。ROS積聚所致的氧化應(yīng)激是導(dǎo)致IDD的一個重要因素，過量的ROS可促進(jìn)椎間盤細(xì)胞的分解代謝、凋亡和衰老，進(jìn)而引起ECM的破壞和椎間盤細(xì)胞數(shù)量下降[36]。體外培養(yǎng)的大鼠NP細(xì)胞經(jīng)H2O2孵育后，細(xì)胞內(nèi)ROS和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛（malondialdehyde,MDA）水平升高，MT可通過上調(diào)SOD和谷胱甘肽（glutathione,GSH）的表達(dá)逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象[37]。此外，ROS還可攻擊線粒體，使線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放及膜電位降低，導(dǎo)致線粒體功能障礙，功能失調(diào)的線粒體則會產(chǎn)生更多的ROS，由此形成惡性循環(huán)，加速IDD，而MT預(yù)處理則減弱了這些作用并改善了細(xì)胞凋亡[38]。

4.2 褪黑素的抗炎作用

炎癥反應(yīng)是促進(jìn)IDD的重要因素。目前研究認(rèn)為在IDD早期，部分分解代謝產(chǎn)物，如纖維連接蛋白片段及透明質(zhì)酸片段等可招募炎癥細(xì)胞到達(dá)椎間盤[2]，此外，部分椎間盤細(xì)胞也可在某些因素下被異常激活，分泌促炎細(xì)胞因子，從而損傷椎間盤[39]。在IDD中后期，椎間盤完整性被破壞，血管化的肉芽組織向椎間盤內(nèi)部生長，同時，巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞等也向該區(qū)域遷移，進(jìn)一步加重炎癥反應(yīng)[40，41]。針對炎癥反應(yīng)，MT表現(xiàn)出優(yōu)異的抗炎效應(yīng)。MT可顯著減少AF穿刺損傷大鼠椎間盤炎癥細(xì)胞浸潤，同時降低 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 的表達(dá)[42]。此外，NLRP3炎癥小體在包括IDD在內(nèi)的多種疾病中有著廣泛研究[43～45]。NLRP3 炎癥小體由感受蛋白 NLRP3、效應(yīng)蛋白酶caspase1及銜接蛋白ASC（apoptosis associated speck like protein containing a CARD）組成，被激活后，可促進(jìn)細(xì)胞IL-1β、IL-18等表達(dá)[46]。最近，Chen 等[47]發(fā)現(xiàn) IL-1β 通過增加人 NP細(xì)胞中NF-κB信號和線粒體ROS的產(chǎn)生上調(diào)NLRP3炎性小體的啟動和激活，進(jìn)而形成IL-1β-NLRP3炎性小體正反饋環(huán)路，而MT可抑制NF-κB信號和線粒體ROS的產(chǎn)生破壞這一正反饋。同樣，另一項研究表明MT可抑制TNF-α誘導(dǎo)下大鼠髓核細(xì)胞NLRP3炎性小體的活化，進(jìn)而延緩IDD[48]。

4.3 褪黑素的抗細(xì)胞凋亡作用

細(xì)胞凋亡是由能夠維持體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的基因控制的程序性死亡[49]。椎間盤細(xì)胞的異常凋亡和加速衰老是與IDD相關(guān)的兩個主要細(xì)胞過程，這兩者可導(dǎo)致椎間盤組織中細(xì)胞數(shù)量的減少，伴隨著代謝失調(diào)，加劇了組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)的破壞，并最終促進(jìn)了IDD的發(fā)展[50，51]。Ge 等[52]發(fā)現(xiàn) MT 可通過上調(diào) CDK2、CDK4及下調(diào)周期蛋白依賴性激酶抑制物p21、p27的表達(dá)促進(jìn)人NP細(xì)胞從G0/G1期向S期轉(zhuǎn)換，延緩細(xì)胞衰老，并通過調(diào)節(jié)Bcl-2家族基因表達(dá)減少細(xì)胞凋亡。同樣，MT可降低胞漿細(xì)胞色C、caspase9和caspase3的水平，升高抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)抑制H2O2誘導(dǎo)的大鼠NP細(xì)胞的凋亡[38]。此外，自噬作為一種進(jìn)化上保守的細(xì)胞內(nèi)再循環(huán)系統(tǒng)，可將胞質(zhì)內(nèi)容物傳遞至溶酶體進(jìn)行降解，從而維持新陳代謝和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。最近研究發(fā)現(xiàn)MT通過上調(diào)細(xì)胞自噬水平減弱叔丁基氫過氧化物（tert-butyl hydroperoxide,TBHP） 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，進(jìn)而延緩 IDD[17，38]。Hai等[53]發(fā)現(xiàn)MT可上調(diào)自噬相關(guān)基因（autophagy-related genes,ATG），尤其ATG7的表達(dá)促進(jìn)IDD患者AF細(xì)胞增殖、抑制凋亡，延緩IDD。上述研究表明，MT對椎間盤細(xì)胞過度凋亡有著重要保護(hù)作用，尤其可以通過維持線粒體穩(wěn)態(tài)，下調(diào)線粒體途徑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用。

4.4 褪黑素的抗ECM降解作用

ECM的組成及其降解和重建間的動態(tài)平衡對椎間盤的生理功能至關(guān)重要。在健康椎間盤中，由于生長因子和分解代謝型細(xì)胞因子的復(fù)雜調(diào)控，ECM的合成和分解速率處于平衡狀態(tài)。當(dāng)ECM分解代謝超過合成代謝時，就會發(fā)生IDD。ECM降解是由各種原因引起IDD的共同通路，主要表現(xiàn)為Ⅱ型膠原蛋白、蛋白聚糖等合成代謝基因表達(dá)降低以及MMPs、ADAMTS等分解代謝基因表達(dá)升高[54，55]。在一項研究中，與對照組相比，MT可顯著增加人NP細(xì)胞中Ⅱ型膠原蛋白、蛋白聚糖的表達(dá)，并減少M(fèi)MP3、ADAMTS4及ADAMTS5的表達(dá)，抑制ECM降解，且這一現(xiàn)象在AF穿刺損傷大鼠模型中得到驗證[56]。此外，相關(guān)研究表明IL-1β及TNF-α可增加NP細(xì)胞中MMP1，MMP3，MMP13，ADAMTS4和ADAMTS5的產(chǎn)生，這與NF-κB及MAPK信號傳導(dǎo)途徑的異常激活有關(guān)[57]，MT可通過下調(diào)NF-κB及MAPK的表達(dá)抑制 IL-1β及 TNF-α誘導(dǎo)的 ECM 降解[48]。Li等[58]發(fā)現(xiàn)MT通過作用于人NP細(xì)胞膜表面MT1/2受體減少磷酸肌醇3-激酶p85調(diào)節(jié)亞基、磷酸肌醇依賴性激酶-1和Akt的磷酸化，進(jìn)而促進(jìn)ECM的表達(dá)。

5 小結(jié)及展望

IDD相關(guān)疾病是引起下腰痛的主要原因之一，由于IDD病因復(fù)雜，其發(fā)病機(jī)制尚未闡明，目前治療方法多為對癥治療，尚無能延緩IDD療效確切的藥物。此外，目前對IDD的研究多集中于椎間盤本身，而對體液中具有保護(hù)椎間盤功能的潛在因子研究尚不足。近年來，MT因其低毒性及良好的抗氧化應(yīng)激、抗炎及抗細(xì)胞凋亡能力受到廣大研究者關(guān)注，且多項實驗結(jié)果表明MT能夠通過上述方式有效抑制椎間盤的退變，但目前其分子機(jī)制尚不明確，還需大量實驗進(jìn)一步探索。此外，MT對IDD的治療作用還缺乏關(guān)鍵的臨床證據(jù)，以明確其治療作用及相關(guān)副反應(yīng)。