袁德麗，周 清，傅曉冬

1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 產(chǎn)科(瀘州 646000)；2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 中心實(shí)驗(yàn)室 (瀘州 646000)

妊娠期高血壓疾病是一類獨(dú)有的妊娠并發(fā)癥，該疾病以高血壓、蛋白尿、抽搐等為臨床特點(diǎn)，嚴(yán)重時(shí)可發(fā)生腦卒中、多個(gè)器官功能衰竭，是直接導(dǎo)致母嬰死亡的第二原因，嚴(yán)重威脅母嬰安全。重度子癇前期(severe preeclampsia，SPE)是妊娠期高血壓疾病中危害程度較高且好發(fā)的一種類型，可累及各臟器功能及全身血管。慢性高血壓是孕期發(fā)生子癇前期的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。妊娠期高血壓疾病孕婦后期罹患高血壓的風(fēng)險(xiǎn)較正常孕婦明顯升高，且子癇前期的嚴(yán)重程度與未來(lái)心血管風(fēng)險(xiǎn)程度相關(guān)[1]。經(jīng)典瞬時(shí)受體電位通道1(transient receptor potential canonical 1，TRPC1)是位于生物膜上的非選擇性陽(yáng)離子通道。研究[2-3]報(bào)道，TRPC1參與儲(chǔ)存的鈣庫(kù)操作鈣進(jìn)入(store operated calcium entry，SOCE)途徑。該途徑是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)/肌漿網(wǎng)重拾鈣的主要機(jī)制，穩(wěn)定內(nèi)質(zhì)網(wǎng)/肌漿網(wǎng)鈣儲(chǔ)存，參與細(xì)胞收縮、增殖、遷移、凋亡等調(diào)控，在血管舒縮、運(yùn)動(dòng)及重構(gòu)中發(fā)揮重要作用。關(guān)于TRPC1在SPE人臍動(dòng)脈平滑肌中表達(dá)的相關(guān)研究還鮮見(jiàn)報(bào)道，本研究旨在分子水平方面比較分析SPE、慢性高血壓并發(fā)SPE(chronic hypertension complicated with severe preeclampsia，CHPE)及正常孕婦的臍動(dòng)脈平滑肌中TRPC1的表達(dá)情況，探究TRPC1與SPE之間的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2020年1—8月在西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院產(chǎn)科確診為SPE和CHPE的單胎孕婦各15例為研究對(duì)象，分別設(shè)為SPE組和CHPE組，另選取同期正常健康單胎孕婦15例為對(duì)照組。診斷標(biāo)準(zhǔn)：SPE及CHPE符合《婦產(chǎn)科學(xué)》[4]診斷標(biāo)準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：正常孕婦為無(wú)妊娠并發(fā)癥及合并癥的健康孕婦；2)育齡期婦女；3)孕周≥28周；4)單胎妊娠者。排除標(biāo)準(zhǔn)：1)除慢性高血壓外，既往患心臟病及肺動(dòng)脈高壓等心血管疾??；2)嚴(yán)重妊娠期并發(fā)癥及內(nèi)外科合并癥；3)吸煙飲酒史及傳染病史。本研究經(jīng)西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審核并通過(guò)，所有孕婦及家屬均知情同意并簽署知情同意書(shū)。

1.2 材料與方法

1.2.1 主要試劑耗材及儀器 總RNA提取試劑盒(北京,Tiangen公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量PCR(qPCR)試劑盒(日本,Toyobo公司)，內(nèi)參gapdh及目的trpc1基因上下游引物(上海,Sangon Biotech公司)，TRPC1、GAPDH一抗及山羊抗兔二抗(武漢，三鷹公司)，核酸濃度檢測(cè)儀(美國(guó),Hermo Scientific公司)，qPCR系統(tǒng)(新加坡,Applied Biosystems公司)，電泳及轉(zhuǎn)膜裝置系統(tǒng)(美國(guó),Bio-Rad公司)，發(fā)光成像儀(法國(guó),Fusion Solo公司)。

1.2.2 標(biāo)本取材 按上述標(biāo)準(zhǔn)選取研究對(duì)象，終止妊娠胎盤(pán)娩出后，立即從新鮮無(wú)菌臍動(dòng)脈的兩端及中間部位各選取一段組織，每段長(zhǎng)約3 cm，置于低溫標(biāo)本箱中轉(zhuǎn)運(yùn)至無(wú)菌操作臺(tái)，斷端辨認(rèn)臍動(dòng)脈后，在冰浴上頓性撕剝臍動(dòng)脈周圍的膠質(zhì)及系膜組織，快速分離臍動(dòng)脈血管，預(yù)冷無(wú)菌水漂洗后放入1.5 mL無(wú)菌EP管中，在液氮中迅速降溫凍凝，轉(zhuǎn)置-80 ℃冰箱長(zhǎng)期超低溫凍存。整個(gè)過(guò)程無(wú)菌操作，迅速完成，減少組織中RNA及蛋白質(zhì)降解。將凍存的臍動(dòng)脈平滑肌組織在液氮超低溫環(huán)境中碾磨成粉并分裝，一部分用于qPCR檢測(cè)，一部分用于蛋白質(zhì)印跡技術(shù)檢測(cè)。

1.2.3 qPCR技術(shù)檢測(cè)trppc1 mRNA表達(dá) 根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作加入裂解液(100 g/L)裂解細(xì)胞，逐步凈化提取RNA，凝膠電泳成像檢測(cè)RNA濃度完整度，核酸濃度檢測(cè)儀測(cè)定mRNA濃度，選取RNA完整度高、濃度適中的樣品按10 μL體系逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，置于-20 ℃冰箱低溫凍存。選取gapdh管家基因作為內(nèi)參基因，以20 μL體系行qPCR檢測(cè)。通過(guò)使用△Ct值來(lái)表示trpc1基因與gapdh基因相對(duì)表達(dá)差異。qPCR結(jié)果中Ct值表示qPCR循環(huán)擴(kuò)增倍數(shù)，△Ct值為目的基因trpc1與內(nèi)參基因gapdh的Ct差值，△Ct越小，則代表原始樣本中基因表達(dá)量越高。

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡技術(shù)檢測(cè)TRPC1 蛋白表達(dá)將上述已碾磨成粉的組織加入含有蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液(100 g/L)中，超聲破碎儀將組織細(xì)胞多次超聲后使細(xì)胞震裂致碎，組織蛋白被釋放至細(xì)胞外，離心(4 ℃，12 000 r/min，離心半徑8 cm)，取上清液，按4∶1比例添加蛋白上樣緩沖液混勻，置于65 ℃水浴中使蛋白變性，迅速放進(jìn)-20 ℃冰箱低溫保存?zhèn)溆谩Ｅ渲?%的濃縮膠和8%的分離膠，行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳后切膠、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂牛奶封閉，4 ℃低溫?fù)u床中過(guò)夜孵育一抗TRPC1(1∶1 000)及GAPDH(1∶3 000)，PBST洗膜30 min后常溫?fù)u床中孵育二抗(1∶3 000)1 h，再次洗膜30 min，置于成像儀中曝光，使用Fusion Solo軟件測(cè)定TRPC1及GAPDH條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 3組一般資料比較

3組年齡及孕周比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。SPE組、CHPE組的孕期收縮壓、舒張壓分別與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。SPE組與CHPE組的收縮壓比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);兩組舒張壓比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表1)。

表1 3組一般資料比較

2.2 3組trpc1 mRNA的表達(dá)水平比較

qPCR結(jié)果顯示，SPE組及CHPE組臍動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞trpc1 mRNA表達(dá)水平均高于對(duì)照組(P<0.05);SPE組與CHPE組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表2)。

表2 3組trpc1 mRNA的表達(dá)水平比較

2.3 3組TRPC1蛋白表達(dá)水平比較

蛋白質(zhì)印跡技術(shù)結(jié)果顯示,SPE組、CHPE組臍動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞TRPC1蛋白表達(dá)水平均高于對(duì)照組(P<0.05);SPE組與CHPE組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖1、表3)。

圖1 3組臍動(dòng)脈血管平滑肌中TRPC1蛋白表達(dá)

表3 3組TRPC1蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

妊娠期高血壓疾病是以高血壓和蛋白尿?yàn)樘卣鞯娜焉锶硇匝芗膊?，其中SPE發(fā)病率高且危害性大。SPE具體的發(fā)病機(jī)制至今尚未明確。胎盤(pán)因素引起的胎盤(pán)螺旋動(dòng)脈重塑不足和母體廣泛的氧化應(yīng)激免疫反應(yīng)組成的兩階段理論被認(rèn)為與SPE病理生理學(xué)有關(guān)[5]，近年也有學(xué)者[6]提出三階段學(xué)說(shuō)。研究[7]報(bào)道，缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)可誘導(dǎo)可溶性血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體1引起的全身血管內(nèi)皮功能障礙，也可與特殊受體相結(jié)合,釋放相應(yīng)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，從而作用于TRPC1通道，參與血管平滑肌細(xì)胞收縮及細(xì)胞增殖并誘發(fā)血管重塑[8];HIF-1α在SPE孕婦胎盤(pán)中表達(dá)明顯增高[9]。因此，TRPC1可能與SPE的病理學(xué)改變有關(guān)。

既往SPE孕婦胎盤(pán)或臍動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞離子通道的研究中，Kv7[10]、BK-Ca[11]、TRPC6[12]、氯離子[13]等通道均被證實(shí)與SPE發(fā)病相關(guān)。瞬時(shí)受體電位通道(transient receptor potential channel，TRP)是一類非選擇性、非電壓門(mén)控性陽(yáng)離子通道蛋白，主要介導(dǎo)Na+、Ca2+等陽(yáng)離子內(nèi)流。TRP家族共包括7個(gè)亞家族(TRPA、TRPC、TRPM、TRPN、TRPP、TRPV、TRPML)，TRPC1通道是TRPC家族成員之一[14]，在心肌、骨骼肌、血管等多種平滑肌細(xì)胞中廣泛表達(dá)[15]。研究[16]發(fā)現(xiàn)，在敲除小鼠L型鈣通道后的主動(dòng)脈環(huán)和分離的血管平滑肌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，5-羥色胺或毒胡蘿卜素可通過(guò)SOCE途徑增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度并刺激主動(dòng)脈收縮，表明SOCE途徑參與鈣內(nèi)流及血管收縮。Kunichika等[17]通過(guò)腺病毒轉(zhuǎn)染、離體大鼠肺動(dòng)脈血管環(huán)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)TRPC1通道組中，由環(huán)吡嗪酸誘導(dǎo)的Ca2+進(jìn)入引起的主動(dòng)張力明顯增強(qiáng),表明TRPC1過(guò)表達(dá)可增強(qiáng)血管張力。Chen等[18]通過(guò)小血管肌電圖觀察發(fā)現(xiàn)，與正常小鼠相比，去甲腎上腺素誘導(dǎo)的自發(fā)性高血壓小鼠腸系膜小動(dòng)脈血管運(yùn)動(dòng)明顯增加，TRPC1表達(dá)上調(diào)；用抗TRPC1抗體預(yù)孵育腸系膜小動(dòng)脈，可明顯降低去甲腎上腺素誘導(dǎo)的血管運(yùn)動(dòng)和鈣內(nèi)流。該結(jié)果表明，TRPC1與血管生成、舒縮功能及血壓調(diào)節(jié)之間有不同程度的聯(lián)系。

本研究結(jié)果顯示，SPE及CHPE孕婦臍動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞中TRPC1mRNA及其蛋白水平表達(dá)均高于對(duì)照組,此結(jié)果與原發(fā)性高血壓與肺動(dòng)脈高壓動(dòng)物模型試驗(yàn)[18]中結(jié)果趨于一致。SPE患者胎盤(pán)血氧灌輸相對(duì)缺乏，胎盤(pán)微血管長(zhǎng)期處于低氧狀態(tài)，低氧可通過(guò)RhoA/Rho激酶途徑誘導(dǎo)HIF-1α增加，使TRPC家族通道表達(dá)上調(diào)[19]。促血管收縮劑通過(guò)激活經(jīng)典的G蛋白-PLC-PKC信號(hào)通路，使細(xì)胞膜上G蛋白偶聯(lián)受體及活化的磷脂酶C將磷脂酰肌醇4，5-二磷酸分解為肌醇-1,4,5三磷酸(inositol triphosphate，IP3)和二酰甘油，IP3可作用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)/肌漿網(wǎng)膜上的IP3受體開(kāi)放SOCE途徑[20]。TRPC1主要參與SOCE途徑，儲(chǔ)存Ca2+消耗后,激活Ca2+傳感器基質(zhì)相互作用分子1可直接[21]或間接通過(guò)鈣釋放激活鈣通道調(diào)節(jié)分子[22]作用于TRPC1通道，介導(dǎo)細(xì)胞外Na+、Ca2+進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，誘導(dǎo)細(xì)胞膜去極化，促進(jìn)Ca2+內(nèi)流，誘發(fā)血管收縮。本研究發(fā)現(xiàn)，SPE組與CHPE組臍動(dòng)脈血管平滑肌TRPC1蛋白表達(dá)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，可能是因?yàn)槁愿哐獕杭膊∑鸩≡?，病情持續(xù)周期長(zhǎng)，機(jī)體相對(duì)缺氧環(huán)境及血管高壓已產(chǎn)生耐受，因此慢性高血壓并發(fā)SPE后，TRPC1上調(diào)水平不明顯，并且TRPC1在SPE及CHPE疾病的發(fā)病機(jī)制尚不明確。因此，TRPC1通過(guò)對(duì)Ca2+的調(diào)控參與血管舒縮調(diào)節(jié)，TRPC1的過(guò)表達(dá)可能與SPE疾病發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

綜上所述，SPE與CHPE孕婦臍動(dòng)脈平滑肌中TRPC1較正常孕婦表達(dá)高，提示SPE的發(fā)病機(jī)制或與臍動(dòng)脈平滑肌中TRPC1的過(guò)表達(dá)相關(guān)。關(guān)于TRPC1在妊娠期高血壓疾病各類型中具體扮演何種角色，可采取動(dòng)物建模、細(xì)胞培養(yǎng)、離體血管環(huán)等實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步論證，以期在探究SPE的發(fā)病機(jī)制及治療中開(kāi)辟新思路。